专利名称：氨基酸的分析方法
技术领域：
本发明涉及氨基酸的分析方法，基于以磷酸三乙胺/乙腈为流动相反相分离氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，使用通常的高效液相色谱仪和色谱条件，不再需要其它的仪器配置，就可以完成各种氨基酸试样的分析，并给出准确的结果。
背景技术：
氨基酸(amino acid，AA)试样比较复杂，常见的AA有20多种，色谱分析方法必须有足够的选择性，以分辨试样中所要测定的AA。大多数AA对紫外光无明显的吸收，为了检测，最常用的手段是使AA分子中的氨基与衍生剂反应，生成具有紫外吸收或荧光性质的衍生物。
通常采用两种途径分析AA试样。一种是借助离子交换机理先使AA彼此分离，再用柱后衍生进行检测。这是一般AA分析仪所使用的办法。
另一途径是，AA经柱前衍生后，以反相色谱分离AA的衍生物。柱前衍生法分离对仪器设备没有特殊的要求，同时采用反相分离模式，但要求衍生反应能使每种AA几乎完全地生成相应的特定产物，且有足够的检测灵敏度[朱彭龄、云自厚、谢光华，“现代液相色谱”，第22章，兰州大学出版社，1989]。
在早期的文献报道中，AA经2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生，反相分离衍生物AA-DNFB，分离DNFB-AA是以60mM醋酸钠(pH＝4.45)为水相，以甲醇为有机相，在C18柱上进行梯度洗脱[Morton R.C.；Gerber G.E.，Anal.Biochem.，170(1988)220.]。后来，大多使用pH＝6.5-7的醋酸盐缓冲液-乙腈体系作为流动相，使异亮氨酸和亮氨酸之间有足够的分离度[Shang，Zhen-Hua；Yu，Yi-Nian；Guo，Wei；Jiang，Hui；Zhou，Liang-Mo，Chinese Journal of Chemistry，13(1995)163.]。
中国专利CN 1053128A公开了十八种复合氨基酸注射液的高效液相色谱分析方法，它以2，4-二硝基氟苯作衍生试剂，用柱前衍生化法对十八种复合氨基酸注射液进行定量测定。用定量稀释配制检测液，以一定浓度和pH值的流动相乙腈和流动相醋酸钠和醋酸缓冲液作梯度洗脱剂。
实验表明，反相分离AA-DNFB对流动相pH值的变化很敏感，精确控制流动相pH值是至关重要的。当使用接近中性的醋酸盐溶液作为流动相的组分，一个明显的问题是，流动相的酸度远离该缓冲液的缓冲区间，此方法的耐用性(robustness)就得不到保证。不同日期配制的流动相和不同品牌，甚至同一品牌不同批号的色谱柱都可能影响DNFB-AA衍生物的色谱分离结果。
发明内容
本发明的目的是提供一种氨基酸的分析方法。用磷酸三乙胺/乙腈为流动相反相分离氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，可以克服现有技术之不足。本发明以磷酸盐代替原有的醋酸盐，使用磷酸三乙胺(TEAP)/乙腈(ACN)流动相体系，提高了分离结果的重现性。本发明耐用性好，易于为一般实验室所采用。通过选择水相缓冲区间和在区间内微调pH值，使分析方法适用于不同品牌色谱柱和各种试样类型。不需增加设备，即可为一般HPLC分析室采用。
本发明氨基酸的分析方法包括使用高效液相色谱仪，AA经2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生，反相分离衍生物AA-DNFB，以磷酸三乙胺/乙腈为流动相梯度洗脱或等度洗脱，在分析柱上反相分离氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，再用外标法定量分析计算出氨基酸的含量。
本发明氨基酸的分析方法包括下述步骤1)分别用HCl溶液作溶剂制备氨基酸标准溶液和试样溶液；2)分别取标准溶液和试样溶液于为其体积10倍量的容量瓶中，加入0.5MNaHCO3，标准溶液或试样溶液与NaHCO3的体积比为1∶1；再加入1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液，与标准溶液或试样溶液的体积比为0.5-1∶1，摇匀；置于60℃下加热60分钟，冷却至室温，用0.1M pH为6.5的磷酸盐缓冲液冲至刻度，摇匀，备用；3)使用包括泵、混合器、恒温箱、紫外检测器以及工作站所组成的HPLC仪。在C18分析柱上，以的TEAP/ACN为流动相，梯度洗脱或等度洗脱分离AA-DNFB；色谱条件如下分析柱C18，5μm，250×4.6mm流动相AACN B36mM TEAP，pH2-3或6-7洗脱方式 梯度洗脱或等度洗脱检测 UV300-380nm，温度 20-45℃，4)用外标法定量分析计算试样中AA的浓度＝(A试样/A标准)×C标准A试样试样色谱图中AA的峰面积A标准标准色谱图中AA的峰面积C标准标准溶液AA的浓度。
本发明的具体实施方案包括下述步骤1)分别用0.1M HCl作溶剂制备AA标准溶液和试样溶液；2)分别取1mL标准溶液和样品溶液于10mL棕色容量瓶中，加入1mL 0.5MNaHCO3，摇匀。再加入0.5-1mL 1％DNFB的乙腈溶液，摇匀；置于60℃下加热60分钟，冷却至室温，用0.1M pH为6.5的磷酸盐缓冲液冲至刻度，摇匀，备用。
3)使用包括泵、混合器、恒温箱、紫外检测器以及工作站所组成的HPLC仪。在C18分析柱上，以的TEAP/ACN为流动相，梯度洗脱或等度洗脱分离AA-DNFB。色谱条件如下分析柱C18，5μm，250×4.6mm流动相AACN B36mM TEAP，pH2-3或6-7洗脱方式 梯度洗脱或等度洗脱检测 UV300-380nm，优选360nm，温度 20-45℃，优选35℃；4)用外标法定量分析计算试样中AA的浓度＝(A试样/A标准)×C标准A试样试样色谱图中AA的峰面积A标准标准色谱图中AA的峰面积C标准标准溶液AA的浓度。
本发明采用了磷酸盐代替原有的醋酸盐，提高了方法的耐用性。在该缓冲体系中，三乙胺的阳离子作为磷酸根的对离子，而不是钾或钠离子。磷酸盐的缓冲区间是pH＝2-3和6-8。在所述的AA分析方法中，以36mM磷酸三乙胺，pH＝2-3和6-7水溶液/ACN流动相体系洗脱AA-DNFB(2，4-二硝基氟苯)。其次，流动相的酸度影响分离选择性，以不同pH的TEAP为水相，AA分离选择性显示很大的差异，这为优化色谱条件提供了方便。此外，三乙胺的加入可抑制固定相上残留硅羟基对分离的影响。
本发明使用磷酸三乙胺(TEAP)/乙腈(ACN)流动相，提高了分离结果的重现性。通过选择水相缓冲区间和在区间内微调pH值，使分析方法适用于不同品牌色谱柱和各种试样类型(例如注射液类、或原料药中主要成分的测定等)，解决了氨基酸混合物的分析，并给出准确的结果。本发明不需增加设备，即可适合于一般HPLC分析室采用。应用范围扩大，包括各种氨基酸的分析以及其它物质转化为氨基酸后的间接分析，还包括除氨基酸以外其它能与DNFB进行定量衍生反应物质的分析。
图1是以36mM TEAP，pH6-7/ACN为流动相肾病注射液色谱图。
图2是以36mM TEAP，pH6-7/ACN为流动相肝病注射液色谱图。
图3是以36mM TEAP，pH2-3/ACN为流动相肾病注射液色谱图。
图4是以36mM TEAP，pH2-3/ACN为流动相肝病注射液色谱图。
图5是以36mM TEAP，pH2-3/ACN为流动相丙谷酰胺酸解液色谱图。
图6是以36mM TEAP，pH2-3/ACN为流动相苯丙氨酸色谱图。
具体实施例方式
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1 肾病注射液(Amino acid for renal insufficiency，Hoechst MarionRoussel公司生产)和肝病注射液(Amino acid preparation for hepaticinsufficiency，Hoechst Marion Roussel公司生产)中AA的分析1.试剂1.1.0.1M HCl 4mL盐酸与480mL水相混合。
1.2 1％DNFB1g DNFB溶于100mL乙腈中。
1.3.0.5M NaHCO32.1g NaHCO3溶于50mL水中。
1.4.0.1M磷酸盐缓冲液，pH6.5称1.74g K2HPO4溶于100mL水中得0.1MK2HPO4。称1.36g KH2PO4溶于100mL水中得0.1M KH2PO4。向0.1M KH2PO4中加0.1M K2HPO4至pH＝6.5。
1.5.36mM磷酸三乙胺(TEAP)，pH2.75在烧杯中取～950mL水，用移液管取5mL三乙胺加至其中。混合后，用磷酸调节pH值至2.75。将溶液转移到1000mL容量瓶中，用水冲至刻度。过滤后使用。
1.6.36mM磷酸三乙胺(TEAP)，pH6.50在烧杯中取～950mL水，用移液管取5mL三乙胺加至其中。混合后，用磷酸调节pH值至6.50。将溶液转移到1000mL容量瓶中，用水冲至刻度。过滤后使用。
2.标准溶液的制备 按肾病注射液和肝病注射液的组成，精确称取AA参照物，以0.1M HCl作溶剂定容。用移液管取AA标准溶液5mL于25mL容量瓶中，以0.1M HCl冲至刻度，摇匀备用。
3.试样溶液的制备 用移液管取AA注射液样品1mL于25mL容量瓶中，以0.1M HCl冲至刻度，摇匀备用。
4.标准溶液和试样溶液的衍生反应 用移液管取稀释后的AA标准溶液和样品溶液各1mL，分别置于10mL棕色容量瓶中，加入1mL 0.5M NaHCO3，摇匀，再加入1mL1％DNFB，摇匀。置于60℃加热块上加热60分钟。冷却后，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.5)冲至刻度，摇匀，准备HPLC分析用。
5.色谱条件5.1.测定天冬、谷、脯、丙、异亮、亮氨酸分析柱 Kromasil C18，5μm，250×4.6mm流动相 AACN B36mM TEAP，pH6.50梯度83/71/68/10/10B％[VB/(VA+VB)]at 0/10/25/30/35min平衡时间10min检测UV360nm温度35℃进样体积20μL在此条件下得到如色谱图1(肾病注射液)和2(肝病注射液)的分离结果，出峰顺序为天冬、谷、精、丝、苏和甘(与试剂峰重叠)、脯、丙、缬、蛋、异亮、亮、色、组、苯丙、赖、酪氨酸5.2.测定精、丝、苏、甘、组、蛋、缬、色、苯丙、赖、酪氨酸分析柱 Kromasil C18，5μm，250×4.6mm流动相 AACN B36mM TEAP，pH2.75梯度78/60/35/10/10B％[VB/(VA+VB)]at 0/20/30/35/40min平衡时间10min检测UV360nm温度35℃进样体积20μL在此条件下得到如色谱图3(肾病注射液)和4(肝病注射液)的分离结果，出峰顺序为精、丝、天冬、谷、苏、甘、丙、脯、组、蛋、缬、色、苯丙、亮+异亮、赖、酪氨酸。
6.计算试样中AA的浓度＝(A试样/A标准)×C标准A试样试样色谱图中AA的峰面积A标准标准色谱图中AA的峰面积C标准标准溶液AA的浓度7.肾病注射液的分析结果、准确度、精密度这里以肾病注射液为例，给出方法的准确度和精密度。肝病注射液也给出相近的结果。
7.1.准确度表1准确度测定结果(％RSD，相对标准偏差)
对所有测试的AA，回收率都在100±1％范围内。
7.2.精密度该方法有较高的精密度，中间精密度和重复性都不大于0.5％，以下是测定结果。
7.2.1.中间精密度表2中间精密度测定结果
7.2.2.重复性表3重复性测定结果(SD标准偏差)
实施例2 丙谷酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)原料药(天津天成制药有限公司生产)中主成分丙谷酰胺含量的测定1.试剂1.1.参见实施例1。
1.2.6N HCl 浓盐酸和水按1∶1(V/V)混合。
2.标准溶液的制备 从干燥器中取出丙谷酰胺基准物，精确称取约15mg于带盖的聚乙烯管(1)中，用移液管加1mL 6N HCl，盖严，摇匀备用。
3.试样溶液的制备 精确称取丙谷酰胺试样约15mg于带盖的聚乙烯管(2)中，用移液管加1mL 6N HCl，盖严，摇匀备用。
4.标准溶液和试样溶液的酸解 将聚乙烯管(1)和(2)于105℃加热6小。冷却，摇匀备用。
5.不经酸解试样溶液的制备 精确称取丙谷酰胺试样约15mg于带盖的聚乙烯管(3)中，用移液管加1mL水，盖严，摇匀备用。
6.衍生反应 用移液管分别从聚乙烯管(1)、(2)和(3)吸取溶液各20L，置于10mL棕色容量瓶中。分别加1mL 0.5M NaHCO3，摇匀。再加0.5mL 1％DNFB，摇匀。将溶液置于加热块中，60℃加热60分钟，取出冷却。用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.5)冲至刻度，摇匀，准备HPLC分析用。
7.色谱条件分析柱 Kromasil C18，5μm，250×4.6mm流动相 AACN B36mM TEAP，pH2.75梯度 78/64.5/60/60B％[VB/(VA+VB)]at0/15/25/30min平衡时间 10min检测 UV360nm温度 35℃进样体积 20μL在此条件下得到如色谱图5的分离结果。
8.计算8.1.当未酸解试样谱图中Ala-Glu、L-Glu衍生物的峰面积小于Ala-Gln衍生物峰面积的0.1％时，就不考虑这些杂质对測定的影响。
丙谷酰胺的百分含量＝[(A试样×W标准)/(A标准×W试样)]×100％W试样酸解试样重(mg)W标准丙谷酰胺基准物重(mg)A试样酸解试样谱图中谷氨酸衍生物峰面积A标准基准物谱图中谷氨酸衍生物峰面积
8.2.当未酸解试样谱图中Ala-Glu、L-Glu的峰面积大于Ala-Gln峰面积的0.1％时，应校正丙谷酰胺的测定结果。丙谷酰胺在酸、碱、氧化剂存在下的降解实验结果表明，Ala-Glu是主要降解物，但没观察到L-Glu。因此，校正时主要考虑试样中原有的Ala-Glu。
丙谷酰胺的百分含量＝{[A试样×AAla-Gln×W标准]/[(AAla-Gln+AAla-Glu×f)×(A标准×W试样)]}×100％W试样酸解试样重(mg)W标准丙谷酰胺基准物重(mg)A试样酸解试样谱图中谷氨酸衍生物峰面积A标准基准物谱图中谷氨酸衍生物峰面积AAla-Gln未酸解试样谱图中丙谷酰胺衍生物的峰面积AAla-Glu未酸解试样谱图中丙谷二肽衍生物的峰面积f丙谷酰胺和丙谷二肽相对响应因子。
实施例3 丙谷酰胺注射液(四川科伦药业股份有限公司生产)中丙谷酰胺含量的测定1.试剂1.1.参见实施例1。
1.2.6.7N HCl 167mL浓盐酸用水稀释到300mL。
2.标准溶液的制备 精确称取约20mg丙谷酰胺或13.5mg谷氨酸基准物于带盖的聚乙烯管(1)中，加100μL水和900μL 6.7N HCl，盖严，摇匀备用。
3.试样溶液的制备 取100μL试样溶液和900μL 6.7N HCl于带盖的聚乙烯管(2)中，盖严，摇匀备用。
4.酸解 将聚乙烯管(1)和(2)置于加热块中，105℃加热6小时后，取出冷却，摇匀备用。
5.衍生反应 用移液管分别吸取酸解标准溶液和试样溶液各20mL于10mL棕色容量瓶中。分别加1mL 0.5M NaHCO3，摇匀。再加0.5mL 1％DNFB，摇匀。将容量瓶置于加热块中，60℃加热60分钟，取出冷却。用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.5)冲至刻度，摇匀，准备HPLC分析用。
6.色谱条件分析柱Kromasil C18，5μm，250×4.6mm流动相AACN B36mM TEAP，pH2.75梯度 78/64.5/60/60B％[VB/(VA+VB)]at0/15/25/30min平衡时间 10min检测 UV360nm温度 35℃进样体积 20μL在此条件下得到如色谱图5的分离结果。
7.计算7.1.以丙谷酰胺为基准物时，丙谷酰胺的浓度按下试计算丙谷酰胺的浓度(g/100mL)＝A试样×C标准/A标准C标准丙谷酰胺基准物溶液浓度(以100L溶液中基准物称量计算，g/100mL)A试样试样谱图中谷氨酸衍生物峰面积A标准基准物谱图中谷氨酸衍生物峰面积7.2.以谷氨酸为基准物时，丙谷酰胺的浓度按下试计算丙谷酰胺的浓度(g/100mL)＝(A试样×C标准/A标准)×(MAla-Gln/ML-Glu)
C标准丙谷酰胺基准物溶液浓度(以100L溶液中基准物称量计算，g/100mL)A试样试样谱图中谷氨酸衍生物峰面积A标准基准物谱图中谷氨酸衍生物峰面积MAla-Gln丙谷酰胺摩尔量ML-Glu谷氨酸摩尔量。
实施例4 L-苯丙氨酸原料药中主成分苯丙氨酸含量的测定1.试剂 参见实施例1。
2.标准溶液的制备 从干燥器中取出苯丙氨酸基准物，于100mL容量瓶中精确称取约20mg。以0.1M HCl为溶剂溶解并冲至刻度，摇匀。
3.试样溶液的制备 于100mL容量瓶中精确称取苯丙氨酸试样约20mg。以0.1MHCl为溶剂溶解并冲至刻度，摇匀。
4.标准溶液和试样溶液的衍生反应 用移液管分别取标准溶液和样品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，加入1mL 0.5M NaHCO3摇匀，再加0.5mL 1％DNFB，摇匀。将溶液置于60℃水浴上加热60分钟，冷却。用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.5)冲至刻度，摇匀，准备HPLC分析用。
5.色谱条件分析柱 Alltima C18，5μm，250×4.6mm流动相 ACN/36mM TEAP，pH2.75 体积比48/52等度洗脱检测UV360nm温度35℃进样体积20μL在此条件下得到如色谱图6的分离结果。
6.计算试样中的苯丙氨酸的百分含量＝(A试样/A标准)×(W标准/W标准)×100％A试样试样色谱图中苯丙氨酸的峰面积A标准标准色谱图中苯丙氨酸的峰面积W标准苯丙氨酸基准物的称量，mgW试样苯丙氨酸基试样的称量，mg。
权利要求
1.一种氨基酸的分析方法，它包括的步骤是使用高效液相色谱仪，AA经2，4-二硝基氟苯柱前衍生，反相分离衍生物氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，其特征在于以磷酸三乙胺与乙腈为流动相梯度洗脱或等度洗脱，在分析柱上反相分离氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，再用外标法定量分析计算出氨基酸的含量。
2.一种氨基酸的分析方法，其特征在于它包括下述步骤1)分别用HCl溶液作溶剂制备氨基酸标准溶液和试样溶液；2)分别取标准溶液和试样溶液于为其体积10倍量的容量瓶中，加入0.5MNaHCO3，标准溶液或试样溶液与NaHCO3的体积比为1∶1；再加入1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液，与标准溶液或试样溶液的体积比为0.5-1∶1，摇匀；置于60C°下加热60分钟，冷却至室温，用0.1M pH为6.5的磷酸盐缓冲液冲至刻度，摇匀，备用；3)使用包括泵、混合器、恒温箱、紫外检测器以及工作站所组成的HPLC仪；在C18分析柱上，以的磷酸三乙胺/乙腈为流动相，梯度洗脱或等度洗脱分离AA-2，4-二硝基氟苯；色谱条件如下分析柱 C18，5μm，250×4.6mm流动相 A乙腈 B36mM磷酸三乙胺，pH2-3或6-7洗脱方式 梯度洗脱或等度洗脱检测 UV 300-380nm，温度 20-45C°，4)用外标法定量分析计算试样中AA的浓度＝(A试样/A标准)×C标准A试样试样色谱图中AA的峰面积A标准标准色谱图中AA的峰面积C标准标准溶液AA的浓度。
3.一种氨基酸的分析方法，其特征在于它包括下述步骤1)分别用0.1M HCl作溶剂制备氨基酸标准溶液和试样溶液；2)分别取1mL标准溶液和试样溶液于10mL棕色容量瓶中，加入1mL 0.5MNaHCO3，摇匀。再加入0.5-1mL 1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液，摇匀；置于60C°下加热60分钟，冷却至室温，用0.1M pH为6.5的磷酸盐缓冲液冲至刻度，摇匀，备用；3)使用包括泵、混合器、恒温箱、紫外检测器以及工作站所组成的HPLC仪。在C18分析柱上，以的磷酸三乙胺/乙腈为流动相，梯度洗脱或等度洗脱分离AA-2，4-二硝基氟苯；色谱条件如下分析柱 C18，5μm，250×4.6mm流动相 A乙腈 B36mM磷酸三乙胺，pH2-3或6-7洗脱方式 梯度洗脱或等度洗脱检测 UV 360nm温度 35C°；4)用外标法定量分析计算试样中AA的浓度＝(A试样/A标准)×C标准A试样试样色谱图中AA的峰面积A标准标准色谱图中AA的峰面积C标准标准溶液AA的浓度。
4.按照权利要求2或3所说的氨基酸的分析方法，其特征在于所说的36mM磷酸三乙胺与乙腈的体积比为1∶0.01-100。
5.按照权利要求2或3所说的氨基酸的分析方法，其特征在于所说的磷酸盐缓冲液为K2HPO4与KH2PO4，或Na2HPO4与NaH2PO4。
6.按照权利要求2或3所说的氨基酸的分析方法，其特征在于所说的试样溶液是含多种氨基酸组成的原料及其制剂，或是主成分为丙谷酰胺或苯丙氨酸原料药及其制剂。
7.按照权利要求6所说的氨基酸的分析方法，其特征在于所说的含多种氨基酸组成的原料的制剂是肾病注射液或肝病注射液。
8.按照权利要求6所说的氨基酸的分析方法，其特征在于所说的主成分丙谷酰胺制剂是丙谷酰胺注射液。
全文摘要
本发明涉及一种氨基酸的分析方法。在C
文档编号G01N30/06GK1749748SQ200510014478
公开日2006年3月22日 申请日期2005年7月14日 优先权日2005年7月14日
发明者朱彭龄, 朱润之 申请人:天津药业研究院有限公司