专利名称：流式细胞仪－细胞内分子探针技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用流式细胞仪--肿瘤细胞内分子探针技术在体外、实验动物体内示踪肿瘤细胞的增生过程，并同时对潜在抗肿瘤药物进行快速筛选。
背景技术：
肿瘤目前已成为对人类生命构成严重威胁的三大疾病之一。因此，研究肿瘤细胞的增生过程以及寻找有效的抗肿瘤药物，对肿瘤的临床诊断和治疗具有重要意义。目前，较常用的检测肿瘤细胞的增生过程及抗肿瘤药物筛选方法如溴脱氧尿嘧啶免疫染色法(BrdU(5’-bromo-2’-deoxy-uridin)).微量培养四唑技术MTT(Microculture tetrazolium technique)、氚示踪技术(3H-thymidine incorporation)，等。
这些方法虽被广泛采用，但都有一定的局限性。如溴脱氧尿嘧啶免疫染色法无法确定原有的细胞数量，且需要抗体，价格昂贵；氚示踪技术有放射性污染，对人体和环境有害；几种方法操作程序都比较复杂，对技术要求较高。总的来说，这些方法耗时，工作量大，且操作者需要相当的实验室经验。
最近的一些分子生物学进展，使得利用细胞内分子探针技术标记细胞内DNA或蛋白质这一生物工具不断发展而且得到快速应用。细胞内分子探针包括基因探针(一段DNA序列)和荧光分子探针(荧光染料分子)。分子探针与细胞内DNA或蛋白质结合有较高的稳定性，其荧光强度可持续时间长(数天至数月)。这些已被应用于体外和体内持续检测生物过程(如基因表达，蛋白质-蛋白质相互间作用和淋巴细胞的生长分化等等)。
本发明以细胞内分子探针技术配合流式细胞仪的使用，可在体内体外示踪肿瘤细胞的增生过程，并同时对大量潜在抗肿瘤药物进行快速筛选，对各种不同的肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性进行‘高通量’(High-throughput)分析。与传统的方法相比，本技术具有对肿瘤细胞生长和药物疗效进行动态观察的优点，且无放射性、更准确、快捷、操作简单、经济。
发明内容
本发明涉及研发以流式细胞仪-细胞内分子探针为手段，动态观察体外、实验动物体内肿瘤细胞的生长繁殖，并对多种潜在抗肿瘤药物进行快速筛选的简单实用、高效的技术。
本发明的具体实施方式
之一，是用基因探针(一段DNA序列)通过转基因技术插入(标记)肿瘤细胞，既重组细胞。
本发明的另一具体实施方式
，是用荧光分子探针标记肿瘤细胞内的DNA或蛋白质。
本发明的另一具体实施方式
，在体外(in vitro)将标记了荧光分子探针的至少一种肿瘤细胞系分别与待测抗肿瘤药物培养；肿瘤细胞进行有丝分裂时，子细胞携带的荧光将减半。在设定的时间点由流式细胞仪收获。用正向光衍射(forward scatter)比电子密度(side scatter)来确定荧光的强弱和峰值，并使用设定的程序对检测结果进行分析。
本发明的另一具体实施方式
，由流式细胞仪收获时，激光激发待测样品的荧光标记物产生荧光，因其激发光的波长不同，不同的荧光标记物产生不同颜色的荧光。故不同的肿瘤细胞系可用不同颜色的荧光分子探针标记，之后数种肿瘤细胞可与至少一种待测抗肿瘤药物分别培养。由于所标记的不同的肿瘤细胞系荧光颜色不同，可在单一试管内同时由流式细胞仪收所获，进行多色荧光分析(可同时检测4色)，从而使单一试管内的检测指标成倍提高，形成高通量式测定模式。
本发明的另一具体实施方式
，是在体内(in vivo)将标记有基因探针的肿瘤细胞，既重组细胞接种到实验动物体内。肿瘤细胞繁殖时，基因探针表达。给以待测抗肿瘤药物治疗。收获时单个肿瘤细胞群被从组织中提取，由流式细胞仪收获分析。并使用设定的程序对检测结果进行半定量和定量分析。
本发明的另一具体实施方式
，是本选择性流式细胞仪-肿瘤细胞内蛋白质或DNA分子探针技术，用于(但不限于)以下范围体内体外肿瘤细胞的示踪，抗肿瘤药物的快速筛选。
三种不同的肿瘤细胞系用不同颜色的荧光分子探针标记之后，分别与一种待测抗肿瘤药物培养(未给药组作对照)。由于所标记的不同的肿瘤细胞系荧光颜色不同，可在单一试管内同时由流式细胞仪收所获，用正向光衍射(forward scatter)比电子密度(side scatter)来确定荧光的强弱和峰值，并使用设定的程序对检测结果进行多色荧光分析。结果显示未给药组三种肿瘤细胞系细胞携带荧光均随培养时间而递减，表明肿瘤细胞增殖进行有丝分裂，子细胞携带的荧光减半。而抗肿瘤药物治疗组相应的三种肿瘤细胞携带荧光并未随培养时间而递减，表明肿瘤细胞增殖受阻，肿瘤细胞对该种抗肿瘤药物敏感性高。
具体实施例方式
细胞内分子探针包括自基因探针和荧光分子探针。
基因探针是一段DNA序列，编码一个很容易被侦测到的蛋白或酶。它们可以人工引入到一个细胞内来监测基因的表达，以得到细胞定位或整体细胞生物传感器的作用。包括(但不限于)绿色荧光蛋白基因green fluorescentprotein(GFP)，半乳糖激酶基因(β-galactosidase)，荧光素酶基因(luciferase)，等等。20多年前，Marlene DeLuca’s第一个成功的获得表达萤火虫荧光素酶基因(luc基因)的转基因烟草，基因探针的生物发光的应用进入了一个新时代。基因探针的主要特点就在于光信号的高度可测性，高光子产生效率。因此应用基因探针的检测极限可以达到10-18到10-21摩尔。基因探针的高度可侦测性使得它非常适合于微小化的生物分析装置(如微矩阵，微流设备和高密度的微孔板)，以用于小量样品体积的基因和蛋白的高通量筛选。
荧光分子探针来源于一系列生物荧光染料，包括(但不限于)蓝色萤光氯甲基衍生物氨基-，羟-和difluoro hydroxycoumarinCMAC(7-amino-4-chloromethylcoumarin、CMHC(4-chloromethyl-7-hydroxy-coumarin)和CMF2HC(4-chloromethyl-6，8-difluoro-7-hydroxycoumarin)，绿色萤光氯甲基衍生物(CMFDA5-chloromethylfluorescein diacetate)、BODIFY(8-chloromethyl-4，4-difluoro-1，3，5，7-tetramethyl-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene)，橙色萤光CMTMR(5-(and-6)-((4-chloromethyl)benzoyl)amino)、吖啶Acridine(3，6-bis(Dimethylamino)、Bisbenzimide，和红色萤光CMTPX，等。
荧光分子探针的特点是1)对活细胞内的DNA或蛋白质有很强的亲和力。这些所选生物荧光染料分子一旦进入细胞内，迅速与细胞内的DNA或蛋白质结合，且有较高的稳定性。荧光分子探针能自由穿透细胞膜并存在于细胞内。一旦进入细胞内，即通过化学反应被变换成不能渗透细胞膜的反应产物。荧光分子探针试剂由最初不发荧光变为荧光分子探针经历了两次的细胞内化学反应。分子探针包含了一个与硫烃起反应的氯甲基团，在谷胱甘肽S-转移酶作用下起反应。在多数细胞里，谷胱甘肽水平较高(~10mM)，并且谷胱甘肽转移酶是普遍存在的。虽然分子探针首先与细胞内谷胱甘肽起反应，但产物是不发荧光的。第二步由细胞内酯酶起作用，其反应产物才具荧光性。
2)被荧光分子探针标记了的细胞在分裂时，荧光强度减半，将其荧光只传给其子代(至少可传4-8代)，而并不传给与之相连的其他细胞。
3)荧光分子探针的荧光强度可持续时间长，至少4天至数月。而其他的可渗透入细胞内的染料则无此特性，包括被广泛应用的钙黄绿素(calcein AM)和BCECF-AM等，它们的荧光强度在生理温度下仅能在活细胞中存在数小时。
本发明的具体实施方式
，是用分子探针标记肿瘤细胞。(1)将基因探针(特定的DNA序列)以基因载体(Vector)为载体，通过转基因技术(Transgenic technique)插入到肿瘤细胞内的DNA；(2)将荧光分子探针(生物荧光染料分子)加入适合的试剂，通过细胞微量培养技术(Microculture technique)标记肿瘤细胞内的DNA或蛋白质。
本发明的另一具体实施方式
，在体外(in vitro)将标记了荧光分子探针的至少一种肿瘤细胞系分别放入96孔板培养基，与一种以上待测抗肿瘤药物共同分别进行微量培养。肿瘤细胞进行有丝分裂时，子细胞携带的荧光减半。在设定的时间点由流式细胞仪收获。此一部分实验用于检测不同的肿瘤细胞系对多种抗肿瘤药物的敏感性。
本发明的另一具体实施方式
，是在体内(in vivo)将标记有分子探针的肿瘤细胞接种到实验动物体内。肿瘤细胞生长时，子细胞携带的荧光将减半；给以待测抗肿瘤药物治疗。收获时单个肿瘤细胞群被从组织中提取。在设定的时间点由流式细胞仪收获。这一实施方式，可对肿瘤细胞在一个单独动物体内的生长繁殖，及机体对治疗干预的抗肿瘤药物的反应进行实时监视(real-time monitoring)。
本发明的另一具体实施方式
，是在体内(in vivo)将标记有基因探针的肿瘤细胞接种到实验动物体内。肿瘤细胞在体内生长。给以待测抗肿瘤药物治疗。收获时肿瘤细胞群被从相关的组织(如肝、淋巴节等)中提取并培养，给以适当的刺激，会特异性的激活控制基因(基因探针)表达和蛋白合成的调控序列，再利用流式细胞仪技术进行检测。这一实施方式，可对肿瘤细胞在单独动物体内的生长、繁殖、转移，及机体对治疗干预的抗肿瘤药物的反应进行实时监视(real-time monitoring)。
本发明的另一具体实施方式
，是收获时，使用程序化、多价流式细胞仪-微载体收获技术，在设定的程序下，根据的细胞的大小(正向光衍射比电子密度)，所标记的不同的肿瘤细胞系荧光分子探针颜色(发射波长)不同，在单一试管内顺序收获不同的肿瘤细胞系；至少包含2种以上的不同荧光分子探针标记的肿瘤细胞系。进行多色荧光分析(可同时检测4色)，从而使单一试管内的检测指标成倍提高，形成高通量式测定模式。
激光激发待测样品的荧光标记物产生荧光，流式细胞仪接收荧光。因其激发光的波长不同，不同的荧光标记物产生不同颜色的荧光。由于有不同颜色(波长)的荧光分子探针，故不同的肿瘤细胞系可用不同颜色的荧光分子探针标记。之后数种标记了分子探针的肿瘤细胞可分别与一种或多种待测抗肿瘤药物共同微量培养。由于所标记的不同的肿瘤细胞系荧光颜色不同，可在单一试管内同时由流式细胞仪收所获，使用多种波长的荧光分子探针和多频道流式细胞分析，进行多色荧光分析(如红色、绿色、橙色及蓝色荧光、)。在多重发光测试中，光信号是同时产生，测试是独立进行，可以在一个反应试管里测试不同的发射光波。这种方法可以在一个反应试管里定量两个以上分析物和测试两个以上发光反应。由于可同时对数种肿瘤细胞系及多种待测抗肿瘤药物进行微量培养，以及多种波长的荧光分子探针和多频道流式细胞仪的使用，可同时观测数种肿瘤细胞对药物的敏感性，从而使检测的样本量大大提高，形成高通量式(High throughput)测定模式。分析测试仅需要非常短的时间，所以适用于大量的药物筛选。
本发明创立以流式细胞仪-细胞内分子探针技术为基础的肿瘤检测及抗肿瘤药物筛选系统，检测肿瘤细胞在体外、实验动物体内的增生、转移，及对抗肿瘤药物的反应；可同时观测数种肿瘤细胞对一种或数种药物的敏感性，形成高通量式(High throughput)测定模式。适用于多种肿瘤的实验室研究及对大量抗肿瘤药物进行快速筛选，可广泛应用于科研和制药产业。
权利要求
1.一种流式细胞仪-细胞内分子探针技术为基础的抗肿瘤药物筛选系统，其特征是一种细胞内分子探针标记肿瘤细胞的制备技术；一种程序化、多价流式细胞仪-细胞内分子探针分析技术；一种检测肿瘤细胞在体外、实验动物体内的增生过程的示踪技术；一种对抗肿瘤药物进行快速筛选的技术。
2.根据权利要求1所述的细胞内分子探针标记肿瘤细胞的制备技术，细胞内分子探针的特征是对活细胞内的DNA或蛋白质有很强的亲和力；荧光强度可持续时间长；细胞在分裂时其子细胞荧光强度减半(可传代4-8代)。自发荧光的DNA片段以质粒(Vector)为载体，通过转基因技术插入到肿瘤细胞的DNA。自发荧光的DNA片段包括(但不限于)绿色荧光蛋白基因green fluorescent protein(GFP)，半乳糖激酶基因(β-galactosidase)，荧光素酶基因(luciferase)，等等.荧光分子探针(荧光染料分子)通过细胞微量培养技术(Microculture technique)标记肿瘤细胞内的DNA或蛋白质。荧光染料分子包括(但不限于)CMAC(7-amino-4-chloro methylcoumarin)、CMHC(4-chloromethyl-7-hydroxycoumarin)和CMF2HC(4-chloromethyl-6，8-difluoro-7-hydroxycoumarin)，绿色萤光氯甲基衍生物CMFDA(5-chloromethyl fluorescein diacetate)、BODIFY(8-chloromethyl-4，4-difluoro-1，3，5，7-tetramethyl-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene)，橙色萤光CMTMR(5-(and-6)-((4-chloromethyl)benzoyl)amino)、吖啶(3，6-bis(Dimethylamino)、Bisbenzimide，和红色萤光CMTPX，等。
3.根据权利要求1所述的一种程序化、多价流式细胞仪-微载体分析技术，其特征是可同时观测数种肿瘤细胞对一种或数种药物的敏感性，形成高通量式(High throughput)测定模式。测定一个试管内的单色标记的一种肿瘤细胞系，用正向光衍射比电子密度来确定荧光的强弱和峰值，检测肿瘤细胞在体外增生过程；以及检测不同的肿瘤细胞系对多种抗肿瘤药物的敏感性。测定一个试管内多色标记的多种肿瘤细胞，用正向光衍射比电子密度来确定荧光的强弱和峰值，使用多种波长的荧光分子探针和多频道流式细胞分析，进行多色荧光分析，并使用设定的程序和适当的对照(阴性、阳性和标准)，可对以上检测结果进行半定量和定量分析。由于单一试管内的检测指标成倍提高，而技术的复杂程度降低，用于同时检测不同的肿瘤细胞系对一种以上抗肿瘤药物的敏感性。
4.根据权利要求1所述的一种实验动物体内肿瘤细胞增生过程的示踪技术，其特征是可示踪肿瘤细胞在活体内的增生过程；在体内检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物的反应。
5.根据权利要求1所述，肿瘤细胞系或肿瘤包括(但不限于)Jurkat细胞(人T单核细胞白血病细胞)、MCF-7细胞(乳腺癌细胞系)、KU-8细胞(男性阴茎癌细胞系)、U937细胞(单核细胞白血病细胞系)、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)、NCI-H929细胞(人多发性骨髓瘤癌症细胞系)、IM-9细胞(人淋巴癌细胞系)、U937细胞(人组织细胞瘤细胞系)，Raji细胞(人B细胞瘤细胞系)，SW1116细胞(人大肠癌细胞系)、Hep2细胞(人鼻咽癌上皮细胞系)、MDR细胞(人胃癌细胞系)、SGC-7901细胞(人胃癌细胞系)、LSC-1细胞(人男性喉癌细胞系)、SGC-7901细胞(人胃癌细胞系)、MHCC97细胞(人肝癌细胞系)、5-FU细胞(人肝癌细胞系)、HepG2细胞(人肝癌细胞系)、A549细胞(人肺癌细胞系)、3T3细胞(小鼠成纤维瘤细胞系)。直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、非小细胞肺癌、肺癌、卵巢癌、大肠癌、鳞状细胞癌、喉癌、胃癌、食道癌、单核细胞白血病细胞、单核细胞白血病细胞、男性阴茎癌细胞系、鼻咽癌、皮肤癌。
6.根据权利要求1所述的一种对抗肿瘤药物进行筛选，抗肿瘤药物(但不限于抗肿瘤药物)包括各种中成药、中药复方汤剂、草药及其提取物、化学合成药、基因工程抗体、重组细胞因子、其他基因重组产物等。
7.根据权利要求1所述的可对肿瘤细胞生长和药物疗效进行动态观察的技术。
全文摘要
本发明涉及使用流式细胞仪－细胞内分子探针技术在体外、实验动物体内示踪肿瘤细胞增生过程，同时对大量抗肿瘤药物进行快速筛选。(1)将分子探针标记肿瘤细胞内DNA或蛋白质。(2)将标记分子探针的至少一种肿瘤细胞系分别培养，细胞分裂时子细胞携带的荧光将减半；加入待测抗肿瘤药物。(3)将标记有分子探针的肿瘤细胞接种到动物体内，肿瘤细胞生长时子细胞携带的荧光将减半；给以待测抗肿瘤药物治疗。收获时单个肿瘤细胞群被从组织中提取。(4)收获时使用设定的程序定量分析肿瘤细胞的数量(荧光强度)。(5)流式细胞仪－肿瘤细胞内分子探针标记标记技术，用于(但不限于)以下范围体内体外肿瘤细胞的示踪，抗肿瘤药物的快速筛选。
文档编号G01N33/68GK1970788SQ200510016348
公开日2007年5月30日 申请日期2005年11月23日 优先权日2005年11月23日
发明者郑芳, 林远 申请人:郑芳, 林远