专利名称：一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物领域，涉及一种试剂盒及其制备方法，更特别的，本发明涉及一种可用于临床疾病检测的一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒及其制备方法。
背景技术：
肌酸激酶(CK)是由M和B亚单位组成的二聚体，在细胞质内共有三种同工酶CK-MM、CK-MB和CK-BB。在细胞线粒体内还有另一种同工酶，称为CK-Mt(又称巨CK)。巨CK又分为巨CK1和巨CK2。巨CK1是一种CK同工酶与自身抗体的复合物，因其分子量大，在体内不易排出，又因其有较长的半衰期，故在血中存留时间较长。文献认为CK1与疾病无明显联系，甚至有的在健康人血中检出巨CK1。巨CK2是一种低聚的线粒体CK，不会在健康人血中出现，近年来由于其在某些肿瘤病人血清中的高检出率而使国外众多研究者一致认为它与恶性肿瘤密切相关，可作为一种新的肿瘤标志物。
CK-BB存在于健康人脑组织，胃肠道和子宫平滑肌内，正常人血清中无CK-BB。组织坏死或某些恶性肿瘤时可出现血清CK-BB升高，在血清中升高通常提示肿瘤扩展或对治疗的应答。
免疫抑制法检测CK-MB作为早期诊断急性心肌梗死的特异性指标已被临床广泛应用，其测定原理是用抗CK-M抗体将M亚基抑制，测定B亚基，结果乘2即为CK-MB活性。而当血清中出现正常人不含有或含量甚微的巨CK或CK-BB时，由于它们不受抗M亚基抗体抑制，其活性已百分之百测出，再乘上系数2，就会出现“CK-MB”等于或高于总CK活性的现象(事实上，CK-MB活性占总CK活性的比例很少出现30％以上)。极易将健康人或肿瘤患者误诊为心脏病病人入院治疗，造成病人严重的精神负担，浪费不必要的医疗费用和延误肿瘤患者的早期诊断。
目前随着检验技术的不断改善，全自动生化仪在中小型医院也越来越普及，巨CK或CK-BB对临床检验结果所造成的干扰越来越明确。已经严重影响检验结果的正确性，造成对酶测定结果的错误判断，甚至引起不必要的医疗纠纷。因此，临床上需要找到一种更准确、可避免因免疫抑制法检测CK-MB时所造成的假阳性的发生的检测方法。
目前，美国海伦那及法国西比亚公司研制除了配套全自动(半自动)电泳仪用琼脂糖电泳试剂盒，也可用于检测巨肌酸激酶。其主要结构为全自动(半自动)电泳仪、琼脂糖凝胶板、样品杯(样品梳)、试剂底物、显色剂等。血清样品加至样品杯内(样品梳圆孔内)，放置样品架上备用，另取一片琼脂糖凝胶板放在电泳板上，琼脂板两侧各放一根碳棒(浸透缓冲液的膜条)，另配置一小瓶试剂底物放入试剂槽内(由样品板小孔内注入)，事先定好测定程序，按下开关即开始电泳。
但是，上述全自动或半自动电泳仪价格昂贵，一般医院不能购买，另外其专用配套试剂盒不能小批量标本检测，目前推销的试剂盒最小包装量一次检测8个标本，如标本少于8份，成本将大大提高，而临床上往往是发现一例可疑标本需即刻进行鉴定，因此，不适合鉴定用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒及其制备方法，应用本发明的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒鉴定血清标本，可以避免因免疫抑制法检测CK-MB时所造成的假阳性的发生，为临床提供正确的检测报告，为肿瘤的早期诊断提供新的肿瘤标志物。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是提供一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒，其中含有琼脂糖凝胶板、Tris缓冲液、巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液、底物、底物缓冲液和显色剂，在每1000ml所述的Tris缓冲液中，含有20mmolTris，14克蔗糖，500毫克叠氮钠，4-6gL-天冬酸干粉；所述的琼脂糖凝胶板中含有1％的琼脂糖；在每升所述的巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液中含有10.3克巴比妥钠，1.84克巴比妥；在每升所述的底物中含有4.0mmolADP，10.0mmol LAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol酸肌酸钠，≥5.0U已糖激酶，≥3.0U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，40mmolN-乙酰半胱氨酸；在每升所述的底物缓冲液中含有20mmol的咪唑，40mmol的葡萄糖，20mmol的醋酸镁，4.0mmolEDTA；每1ml所述的显色剂中含有氯化硝基四氮唑蓝2mg，吩嗪二甲酯硫酸盐0.1mg。
优选的，所述的Tris缓冲液的PH值为7.4。
优选的，所述的巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液的PH8.6。
优选的，所述的底物缓冲液的PH值为6.7。
本发明的目的还在于提供一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒的制备方法，包括以下步骤(1)配制PH7.4Tris缓冲液称取20mmolTris，14克蔗糖，500毫克叠氮钠，然后放置于容器中，再加入约800ml蒸馏水搅拌，将容器置于37℃水箱内，再向容器内加L-天冬酸干粉，边加边搅拌溶解，用PH试纸条粗调PH约7.4，最后用PH测定仪调整PH值至7.4，加水至1000ml；(2)制备1％琼脂糖凝胶称取1克琼脂糖，加热溶解于PH为7.4的Tris缓冲液100ml中，分装8ml/管；(3)制备琼脂糖凝胶板取出8ml/管1％琼脂糖凝胶，隔水加热溶解，在铁板上放一片110mm×80mm透明的聚酯膜作支撑，上面压一块中间挖有100mm×70mm×1mm大小孔的硅胶片，四周与聚酯膜用水贴紧，将加热溶解的8ml琼脂糖倒入孔内，顺势用管底将琼脂糖铺平，待冷却后，揭去硅胶片洗净待用，在凝胶板上覆盖一张保鲜膜，取下凝胶板，放入一密封的塑料盒内；(4)制备PH8.6，0.05mol/L巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液称取巴比妥钠10.3克，巴比妥1.84克溶于1L蒸馏水中；(5)制备底物将4.0mmol LADP，10.0mmol LAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol磷酸肌酸钠，≥5.0U已糖激酶，≥3.0U6-磷酸葡萄糖脱氢酶，40mmolN-乙酰半胱氨酸加入1L蒸馏水中混合；(6)制备底物缓冲液将20mmol咪唑、40mmol葡萄糖、20mmol醋酸镁、4.0mmolEDTA溶于1L蒸馏水，用醋酸调节PH至6.7；(7)制备显色剂称取氯化硝基四氮唑蓝(NBT)2mg，吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)0.1mg，使用前加蒸馏水至1ml。
本发明的目的还在于提供巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒在肿瘤检测上的应用，包括以下步骤1)取已配制好的1％琼脂糖凝胶板一片，在离阴极侧1.5cm处覆盖一条2cm宽滤纸条，吸去部分水分，除去滤纸后将一加样孔膜条置于其上，轻按加样孔膜使其与胶板贴紧，避免气泡，然后将5-7μl样品加入孔内，静置5-10分钟，待样品扩散进入胶内，用一条新的吸水纸盖于加样膜孔上，轻轻吸去多余样品，然后除去膜条；2)将胶板放入两侧已加有缓冲液的电泳槽上，加样侧放于阴极侧，二端用四层纱布搭桥，电泳20分钟，电泳条件为每板40mA，电压150V；3)用底物缓冲液溶解底物，待电泳毕，取出凝胶板，将底物均匀施加于胶板上，上面覆盖一张与胶板大小一致的塑料薄膜，置37℃恒温水浴槽内，温育40分钟，或在45℃温育20分钟；4)温育毕，除去覆盖的塑料薄膜，置干燥箱内20分钟烤干，烘干温度低于75℃；5)在荧光光密度计上扫描测定各同工酶区带的百分率，或在340nm紫外灯下直接观察是否出现紫蓝色巨CK、CK-BB或CK-MB的阳性区带。
更特别的，本发明所述的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒在用可见光扫描定量时，在完成操作4)以后，将1ml显色剂铺加于凝胶板上，再次覆盖塑料薄膜，室温避光放置10-15分钟，用5％醋酸漂洗背景，于530-570nm扫描。
本发明利用的主要原理为CK同工酶在琼脂糖介质上电泳分离，CK-BB迁移向阳极白蛋白区域，CK-MB位于α2至β球蛋白区域，而CK-MM位于阴极侧γ球蛋白区，巨CK1位于CK-MB和CK-MM之间，巨CK2迁移率较低，位于CK-MM阴极侧。电泳毕，覆盖底物，温育后干燥，在340nm光密度计扫描检测，或在底物温育后再覆盖PMS-NBT，酶条带呈紫蓝色，可用可见光扫描检测。
本发明的试剂盒使用前，需放置于4℃冰箱中备用，不可冰冻。
本发明和已有技术相比，成本低，操作简便，适合小批量或个别的检测。无需特殊的仪器设备，大部分实验室均可完成。另外琼脂糖凝胶支撑物聚酯膜无色透明，可在340nm紫外灯下直接观察，拍照，并可连接电脑保留图像。而进口试剂盒琼脂糖凝胶支撑物是黑色的，不能在340nm紫外灯下直接观察，拍照，保留图像。同时，本发明的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒鉴定血清标本，可以避免因免疫抑制法检测CK-MB时所造成的假阳性的发生，为临床提供正确的检测报告，为肿瘤的早期诊断提供新的肿瘤标志物。
图1是CK同工酶和巨CK在琼脂糖介质上的电泳示意图。
图2是采用本发明的巨肌酸酶试剂盒检测的一个样品的电泳图。
图3是采用本发明的巨肌酸酶试剂盒检测的另一个样品的电泳图。
具体实施例方式
实施例1 本发明的巨肌酸酶试剂盒的制备本发明的巨肌酸酶试剂盒包括的试剂如下1)PH7.4Tris缓冲液20mmolTris，14克蔗糖，500毫克叠氮钠，加蒸馏水约800ml，将烧杯置于37℃水箱内，直接向烧杯内加L-天冬酸干粉，边加边搅拌溶解，用PH试纸条粗调PH约7.4(大约用L-天冬酸干粉5克左右)，最后用PH测定仪调整PH至7.4，加水至1000ml置于冰箱备用。
2)1％琼脂糖凝胶称量1克琼脂糖，加热溶解于PH7.4Tris缓冲液100ml中，分装8ml/管置于4℃冰箱内备用。
3)琼脂糖凝胶板取出8ml/管1％琼脂糖凝胶，隔水加热溶解，在铁板上放一片110mm×80mm透明的聚酯膜作支撑，上面压一块中间挖有100mm×70mm×1mm大小孔的硅胶片，四周与聚酯膜用水贴紧，不要有空隙(否则琼脂糖易逸出)，将加热溶解的8ml琼脂糖倒入孔内，顺势用管底将琼脂糖铺平，待冷却后，揭去硅胶片洗净待用，在凝胶板上覆盖一张保鲜膜，取下凝胶板，放入一密封的塑料盒内置4℃冰箱内保存。
4)PH8.6，0.05mol/L巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液称取巴比妥钠10.3克，巴比妥1.84克溶于1L蒸馏水中。
5)制备底物将4.0mmol LADP，10.0mmolLAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol磷酸肌酸钠，≥5.0U已糖激酶，≥3.0U6-磷酸葡萄糖脱氢酶，40mmolN-乙酰半胱氨酸加入1L蒸馏水中混合；6)制备底物缓冲液将20mmol咪唑、40mmol葡萄糖、20mmol醋酸镁、4.0mmolEDTA溶于1L蒸馏水，用醋酸调节PH至6.7；7)显色剂氯化硝基四氮唑蓝(NBT)2mg，吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)0.1mg，使用前加蒸馏水1ml。
实施例2 本发明的巨肌酸酶试剂盒的样品检测本发明使用的电泳仪和电泳槽为市场上有销售的。本发明采用的加样孔膜条如下制备将一稍硬质的塑料薄膜，裁制成150mm×20mm大小尺寸。用一根2mm×5mm大小尺寸的铁针加热后将塑料薄膜烫出一只孔，一条塑料薄膜可烫十只孔。
具体采用如下步骤1)取琼脂糖凝胶板一片，在离阴极侧1.5cm处覆盖一条2cm宽滤纸条，吸去部分水分，除去滤纸后将一加样孔膜条置于其上，轻按加样孔膜使其与胶板贴紧，避免气泡，然后将5-7μl样品加入孔内，注意使孔内全部均匀地充满，静置5-10分钟，待样品扩散进入胶内，用一条新的吸水纸盖于加样膜孔上，轻轻吸去多余样品，然后除去膜。
2)将胶板放入两侧已加有缓冲液的电泳槽上，注意将加样侧放于阴极侧，二端用四层纱布搭桥(如房间温度较高，上空架一冰袋降温)，电泳20分钟，电泳条件为每板40mA，电压150V。
3)电泳结束前用1ml底物缓冲液溶解底物。
4)电泳毕，取出凝胶板，将底物均匀施加于胶板上，上面覆盖一张与胶板大小一致的塑料薄膜，注意避免气泡，置37℃恒温水浴槽内，温育40分钟，或在45℃温育20分钟。
5)温育毕，除去覆盖的塑料薄膜，置干燥箱内20分钟烤干(最高温度不能超过75℃)。
6)在荧光光密度计上扫描测定各同工酶区带的百分率，也可340nm紫外灯下直接观察是否出现巨CK、CK-BB或CK-MB的阳性区带。
7)如用可见光扫描定量，则在完成操作4以后，将1ml显色剂铺加于凝胶板上，再次覆盖塑料薄膜，室温避光放置10-15分钟，用5％醋酸漂洗背景，于530-570nm扫描。
图1是CK同工酶和巨CK在琼脂糖介质上的电泳示意图，CK同工酶在琼脂糖介质上电泳分离，CK-BB迁移向阳极白蛋白区域，CK-MB位于α2至β球蛋白区域，而CK-MM位于阴极侧γ球蛋白区，巨CK1位于CK-MB和CK-MM之间，巨CK2迁移率较低，位于CK-MM阴极侧。图2、图3是采用本发明的巨肌酸酶试剂盒检测的两个样品的电泳图，其中，a代表质控样品，b是患者样品，c是正常对照，图2说明了该患者的血清中含有CK-MM和巨CK2，图3说明了该患者的血清中含有巨CK1和CK-MM。
实施例3 临床检测试验应用本发明的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒和免疫抑制法，本发明人鉴定了133例临床标本，其中的结果对比见表1。采用本发明的试剂盒，其中20例标本含有巨CK1，107例标本含有巨CK2(其中经病理证实为恶性肿瘤者71例，肝硬化16，其它疾病20例)及6例标本含有CK-BB。而采用免疫抑制法检测，这些标本均有一个共同的特点，即血清中“CK-MB”占总CK活性50％以上，而总CK活性正常或轻度增高。因此采用本发明的试剂盒，避免了由于巨CK1、CK2、CK-BB的干扰而出现CK-MB假阳性的现象，造成错误判断和临床误诊。从而更加准确的检测出肿瘤患者和心脏病病人，为临床提供正确的检验报告。
表1
权利要求
1.一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒，其中含有琼脂糖凝胶板、Tris缓冲液、巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液、底物、底物缓冲液和显色剂，其特征在于所述的琼脂糖凝胶板中含有1％的琼脂糖；在每升所述的Tris缓冲液中，含有20mmolTris，14克蔗糖，500毫克叠氮钠，4-6g L-天冬酸干粉；在每升所述的巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液中含有10.3克巴比妥钠，1.84克巴比妥；在每升所述的底物中含有4.0mmolADP，10.0mmol LAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol酸肌酸钠，≥5.0U己糖激酶，≥3.0U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，40mmolN-乙酰半胱氨酸；在每升所述的底物缓冲液中含有20mmol的咪唑，40mmol的葡萄糖，20mmol的醋酸镁，4.0mmolEDTA；每1ml所述的显色剂中含有氯化硝基四氮唑蓝(NBT)2mg，吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)0.1mg。
2.如权利要求1所述的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒，其特征在于所述的Tris缓冲液的PH值为7.4。
3.如权利要求1所述的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒，其特征在于所述的巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液的PH8.6。
4.如权利要求1所述的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒，其特征在于所述的底物缓冲液的PH值为6.7。
5.权利要求1所述的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)配制PH7.4Tris缓冲液称取20mmolTris，14克蔗糖，500毫克叠氮钠，然后放置于容器中，再加入约800ml蒸馏水搅拌，将容器置于37℃水箱内，再向容器内加L-天冬酸干粉，边加边搅拌溶解，用PH试纸条粗调PH约7.4，最后用PH测定仪调整PH至7.4，加水至1000ml；(2)制备1％琼脂糖凝胶称取1克琼脂糖，加热溶解于PH为7.4的Tris缓冲液100ml中，分装8ml/管；(3)制备琼脂糖凝胶板取出8ml/管1％琼脂糖凝胶，隔水加热溶解，在铁板上放一片110mm×80mm透明的聚酯膜作支撑，上面压一块中间挖有100mm×70mm×1mm大小孔的硅胶片，四周与聚酯膜用水贴紧，将加热溶解的8ml琼脂糖倒入孔内，顺势用管底将琼脂糖铺平，待冷却后，揭去硅胶片洗净待用，在凝胶板上覆盖一张保鲜膜，取下凝胶板，放入一密封的塑料盒内；(4)制备PH8.6，0.05mol/L巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液称取巴比妥钠10.3克，巴比妥1.84克溶于1L蒸馏水中；(5)制备底物将4.0mmol LADP，10.0mmol LAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol磷酸肌酸钠，≥5.0U己糖激酶，≥3.0U6-磷酸葡萄糖脱氢酶，40mmol N-乙酰半胱氨酸加入1L蒸馏水中混合；(6)制备底物缓冲液将20mmol咪唑、40mmol葡萄糖、20mmol醋酸镁、4.0mmolEDTA溶于1L蒸馏水，用醋酸调节PH至6.7；(7)制备显色剂称取氯化硝基四氮唑蓝(NBT)2mg，吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)0.1mg，使用前加蒸馏水至1ml。
6.权利要求1所述的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒在肿瘤检测上的应用，其特征在于，包括以下步骤1)取已制备好的1％琼脂糖凝胶板一片，在离阴极侧1.5cm处覆盖一条2cm宽滤纸条，吸去部分水分，除去滤纸后将一加样孔膜条置于其上，轻按加样孔膜使其与胶板贴紧，避免气泡，然后将5-7μl样品加入孔内，静置5-10分钟，待样品扩散进入胶内，用一条新的吸水纸盖于加样膜孔上，轻轻吸去多余样品，然后除去膜条；2)将胶板放入两侧已加有缓冲液的电泳槽上，加样侧放于阴极侧，二端用四层纱布搭桥，电泳20分钟，电泳条件为每板40mA，电压150V；3)用底物缓冲液溶解底物，待电泳毕，取出凝胶板，将底物均匀施加于胶板上，上面覆盖一张与胶板大小一致的塑料薄膜，置37℃恒温水浴槽内，温育40分钟，或在45℃温育20分钟；4)温育毕，除去覆盖的塑料薄膜，置干燥箱内20分钟烤干，烘干温度60-75℃；5)在荧光光密度计上扫描测定各同工酶区带的百分率，或在340nm紫外灯下直接观察是否出现紫蓝色巨CK、CK-BB或CK-MB的阳性区带。
7.根据权利要求6所述的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒在肿瘤检测上的应用，其特征在于，用可见光扫描定量时，在完成操作4)以后，将1ml显色剂铺加于凝胶板上，再次覆盖塑料薄膜，室温避光放置10-15分钟，用5％醋酸漂洗背景，于530-570nm扫描。
全文摘要
本发明属于医药生物领域，公开了一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒，其中含有琼脂糖凝胶板、Tris缓冲液、巴比妥钠－巴比妥电泳缓冲液、底物、底物缓冲液和显色剂；本发明还公开了一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒的制备方法，采用本发明的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒鉴定血清标本，可以避免因免疫抑制法检测CK－MB时所造成的假阳性的发生，为临床提供正确的检测报告，为肿瘤的早期诊断提供新的肿瘤标志物。
文档编号G01N21/64GK1880954SQ20051002683
公开日2006年12月20日 申请日期2005年6月16日 优先权日2005年6月16日
发明者王爱华, 于嘉屏, 许绍辉 申请人:中国人民解放军第二军医大学