专利名称：氨甲酰磷酸合成酶1的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种氨甲酰磷酸合成酶1用作检测肝癌的蛋白质分子标记的应用。
背景技术：
肝癌是一种严重危害人类的疾病。西方发达国家肝癌的发病率较低，国际上对肝癌的基础研究仍较为薄弱，而我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝癌基础研究中的前沿课题。
到目前为止，已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。
因此，为治疗和诊断目的研究和开发在肝癌中差异表达的基因和/或蛋白具有重要意义，本领域迫切需要新的在肝癌中差异表达的基因和/或蛋白。
氨甲酰磷酸合成酶1(carbamoyl-phosphate synthetase 1，CPS1)，又称Carbamoylphosphate synthase[ammonia]，mitochondrial[Precursor]。它的Genebank登录号为gi|21361331|，NCBI的登录号为NP_001866.2，Swissprot登录号为P31327。氨甲酰磷酸合成酶1是肝中基本的起始并催化尿素循环的代谢酶，它由2号染色体上一段大于120kb的基因编码，含有38个外显子和37个内含子。人类的氨甲酰磷酸合成酶1基因有多种单核苷酸多态现象(Characterization of genomic structure and polymorphisms in the humancarbamyl phosphate synthetase I gene，Gene 31151-57，2003)。
氨甲酰磷酸合成酶1是一种包含多个结构域，由1500个残基组成的肝线粒体基质蛋白，它可以被N-乙酰-L-谷氨酸变构激活，从而以三步反应合成氨甲酰磷酸。研究表明，氨甲酰磷酸合成酶1缺陷会导致一种常染色体隐性遗传的尿素循环紊乱病，可以引起血氨升高，威胁生命(J.Mol.Biol.349127-141，2005)。现有的报导说明氨甲酰磷酸合成酶1缺陷病人的该基因发生了不同的错义突变，但是还没有研究能解释发病的潜在性(Understanding Carbamoyl Phosphate Synthetase DeficiencyImpact of Clinical Mutations onEnzyme Functionality，J.Mol.Biol.(2005)349，127-141)。
但是到目前为止，现有技术中未见有关于氨甲酰磷酸合成酶1与肝细胞癌的相关性的报道。
发明内容
通过筛选在肝细胞癌癌组织以及肝细胞癌癌旁组织中差异表达的蛋白质，本申请的发明人找到了一种在肝细胞癌的癌组织和癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中下调表达)，经质谱鉴定为氨甲酰磷酸合成酶1。进一步的免疫印迹实验证实，氨甲酰磷酸合成酶1的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中下调表达)。
基于氨甲酰磷酸合成酶1与肝细胞癌的这种相关性，以该蛋白作为一个蛋白质分子标记对其表达量进行检测可以用于检测肝癌。
因此，本发明的首要目的即在于提供一种氨甲酰磷酸合成酶1用作检测肝癌的蛋白质分子标记的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备检测肝癌的制剂的应用。
本发明的再一个目的还在于提供一种抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备检测肝癌的试剂盒的应用。
本发明的又一个目的在于提供一种体外检测肝细胞组织中氨甲酰磷酸合成酶1的表达是否异常的方法，该方法包括以下步骤A、用特异性抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗体检测待测肝细胞中氨甲酰磷酸合成酶1的数量；B、将步骤A测得的氨甲酰磷酸合成酶1的数量与正常肝组织中的氨甲酰磷酸合成酶1的数量进行比较，如测得的蛋白数量低于正常值，则表示被检测肝组织中氨甲酰磷酸合成酶1的表达异常。
到目前为止，还没有氨甲酰磷酸合成酶1与肝细胞癌的相关性的报道，因此，本发明的这一发现将为肝细胞癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。
图1为氨甲酰磷酸合成酶1在癌组织和癌旁组织的2-DE图谱中的量变示意图，显示了蛋白质点SSP 6901(经质谱鉴定的氨甲酰磷酸合成酶1)在肝细胞癌患者的癌组织中的表达相比在癌旁组织中的表达明显下调。
图2为氨甲酰磷酸合成酶1的单向凝胶电泳后的免疫印迹分析结果示意图。
图3为氨甲酰磷酸合成酶1的双向凝胶电泳后的免疫印迹分析结果示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本申请的发明人用非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制备的肝细胞癌的癌组织与癌旁组织蛋白质样品，以双向凝胶电泳(2-DE)技术筛选在癌组织与癌旁组织中差异表达的蛋白质点并质谱鉴定，结果发现氨甲酰磷酸合成酶1在肝细胞癌癌组织中下调表达。免疫印迹实验进一步证实氨甲酰磷酸合成酶1的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达。
因此，以氨甲酰磷酸合成酶1作为一个蛋白质分子标记对其表达量进行检测可以用于检测肝癌，也即氨甲酰磷酸合成酶1可以用作检测肝癌的蛋白质分子标记。
实施例1、肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品的制备本实施例中所使用的尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)均购自Sigma公司。
本实施例以非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制备肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品，具体如下手术切除的新鲜组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、无坏死区域的小块。用预冷的不含谷氨酰胺的RPMI1640培养基(5％胎牛血清，0.2mM PMSF，1mM EDTA，苯甲异噁唑青霉素25mg/mL，庆大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL，两性霉素B 0.25mg/mL，制霉菌素50U/mL)洗涤组织小块数次后，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，细胞沉淀分别溶于适量裂解液(8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmmol/L DTT)中，超声细胞破碎仪(Soniprep 150，英国，MSE)冰浴间歇超声2min，15000r/min、4℃离心1h。取上清，以改良的Bradford法(见Bio-Rad公司产品说明书)进行总蛋白质定量，制备好的肝细胞癌癌组织及相应癌旁组织的蛋白质样品分装，-80℃保存备用。
以上述方法制备16对肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品。16例肝细胞癌标本均来自东方肝胆外科医院，由2个病理科医生明确为肝细胞癌。均为男性，平均年龄49.4岁(31～65岁)，血清检测hepatitis B病毒感染阳性，16例(100％)属临床分级(TNM分级)III级。其中，甲胎蛋白(AFP)高于25μg/L的15例(93.75％)；14例肿瘤大于5cm。16例肝细胞癌标本的病理资料详见以下表1。
表1、16例肝细胞癌标本的病理资料
本实施例所用癌组织及癌旁组织样品均为取自同一肝细胞癌患者的成对样品，所有16例肝细胞癌病例有极相似的病例诊断指标均为男性，平均年龄49.4岁(31～65岁)，血清检测hepatitis B病毒感染阳性，16例(100％)属TNM分级III级。其中，AFP高于25μg/L的15例(93.75％)；14例肿瘤大于5cm。这种取样方法有利于降低个体间差别对实验分析工作的影响。
实施例2、差异表达蛋白的筛选本实施例中使用的尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯酰胺等购自Fluka公司。
过硫酸胺(AP)、Tri-n-butylphosphat(TBP)、PDQuest软件等为Bio-Rad产品。
Bruker Reflex III MALDI-TOF质谱，购自Karlsruhe公司(德国)。
非线性固相pH梯度预制胶条(IPG干胶条，pH3-10NL，130×3×0.5mm)、IPG缓冲液、IPGphore等电聚焦系统(Amersham Pharmacia Biotech)、Amersham Pharmacia EttanDalt II systems等为Amersham Bioscience公司产品。
取实施例1得到的16对肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品中的前10对(表1中f31、f32、f33、f39、3 27、3 28、4 15、4 18、4 22和3 17)，采用双向凝胶电泳法对其中的差异表达蛋白进行筛选，双向凝胶电泳主要按Sanchez等人的改进方法(Sanchez，J.C.et al.Electrophoresis 1997，18，324-327)进行，具体如下首先采用分析型双向凝胶电泳将60μg蛋白质样品与重泡涨液(8mol/L尿素、2％CHAPS、0.5％IPG缓冲液、18mmol/L DTT和痕量溴酚蓝)混合，总体积250μl，使用130×3×0.5mm pH3-10NL胶条，在IPGphore等电聚焦系统上进行一向分离，总电压小时约为80000Vhrs。等电聚焦后胶条依次在平衡液I(6M尿素、30％甘油、2％SDS、1％DTT)和平衡液II(平衡液I中DTT以2.5％IAA代替)中平衡，每次15min。胶条转移至十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，胶浓度12％)上缘，电泳条件为15mA/胶30min，然后30mA/胶保持至溴酚蓝离胶下缘0.5cm。
然后，采用银染使胶条生成图像，并以GS-710图像扫描仪(Bio-Rad)透射模式扫描胶图像，分辨率为84.7μm/pixel。点的检测和匹配用PDQuest软件分析。蛋白质点的等电点pI和分子量Mr以2-DE标准蛋白质(Bio-Rad)的作为Marker，输入软件用于分析其它蛋白的pI和Mr。
本实施例以非酶解样品制备法中制备的10对肝细胞癌患者的癌组织与相应癌旁组织蛋白质样品，共得到2-DE图谱40余幅，其中5对样品重复3次PDQuest软件进行了癌组织与癌旁组织的蛋白质差别表达谱分析，分析结果见以下表2。
表2、PDQuest软件分析结果(部分)
注在T中更多＝在肝癌组织中表达上调的蛋白质点；在N中更多＝在肝癌组织中表达下调的蛋白质点；仅在T中＝仅在肝癌组织中检测到的蛋白质点；仅在N中＝仅在非肝癌组织中检测到的蛋白质点；T-T＝肿瘤之间的相关系数；N-N＝成对的非肿瘤之间相关系数；T-N＝肿瘤组织和成对的非肿瘤组织之间的相关系数。
在pH3-10胶条上，银染条件下两类组织样品均显示约1200个银染点。癌组织间银染点匹配率为0.75～0.86，癌组织与癌旁组织间银染点匹配率为0.60～0.76，一定程度上说明两类组织样品取样方法的科学性。
图谱分析之后，本实施例又采用制备型双向凝胶电泳，上样量为1.5mg，总Vhrs约为90000，采用可与质谱兼容的考玛斯亮蓝法检测，其它与分析型双向凝胶电泳方法相同。
接下来的胶内酶解与质谱鉴定过程如下蛋白质点由质谱兼容的考玛斯亮蓝染色的制备型电泳凝胶上手工切取，在100mM NH4HCO3、30％乙腈中脱色，真空冷冻干燥，5μl50mmol/L NH4HCO3(pH8.3，蛋白质∶胰蛋白酶＝1∶5，w/w)中4℃放置2hr，加入20μl 50mmol/L NH4HCO3(pH8.3)，37℃酶解过夜。抽提蛋白(60％乙腈、0.1％三氟乙酸)，真空冷冻干燥。用Bruker Reflex III MALDI-TOF质谱鉴定酶解好的样品，MASCOT搜索工具(http//www.matrix science.com；Matrix Science，London，UK)进行数据库搜索。
应用双向凝胶电泳技术、胶内酶解技术、质谱技术，本实施例鉴别出了116个差别点，对应102种差别表达的蛋白质。其中，肝细胞癌癌组织中高表达或仅在其中表达的为61个差别点，对应54种蛋白质；肝细胞癌癌旁组织中高表达或仅在其中表达的为55个差别点，对应48种蛋白质。
在差异表达谱中，点SSP6901(图1)在癌组织中表达明显下调，经切点、胶内酶解，点SSP6901用MALDI-TOF质谱鉴定和数据库搜索得12个非重复肽段与氨甲酰磷酸合成酶1相符并满足MASCOT打分条件(单一同位素峰的搜库标准MASCOT得分大于63，p＜0.05)得分71，p＝0.001514；氨基酸覆盖率为10％，具体结果详见以下表3表3、氨甲酰磷酸合成酶1质谱鉴定结果
并且，根据PDQuest软件对已有2-DE图谱的分析，通过比较点SSP6901在不同肝细胞癌患者的癌组织与癌旁组织的2-DE图谱中的表达情况，发现点SSP6901在以下9例不同病例中的都是在癌组织中低表达(表4)。
表4、点SSP6901在癌组织中的下调表达在9例不同病例中的重复情况
因而，2-DE图谱分析显示点SSP6901在癌组织中的下调表达在不同肝细胞癌患者的癌组织与癌旁组织的2-DE图谱中得到良好的重复(90％)
实施例3、氨甲酰磷酸合成酶1差异表达的免疫印迹验证为确认氨甲酰磷酸合成酶1的差异表达，取10位肝细胞癌患者的癌组织及相应癌旁组织蛋白质样品(表1中3 17、3 27、4 2、4 5、4 8、4 9、4 15、4 18、4 22和4 24)，用购买的抗氨甲酰磷酸合成酶1抗体进行免疫印迹分析，具体过程简述如下每个样品取20μg蛋白质样品用12％SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(购自Amersham Biosciences公司)上，一抗使用兔抗人氨甲酰磷酸合成酶1多克隆抗体(购自Abcam公司，1∶2000)，4℃孵育过夜，用TBST(每升含Tris 2.42g，氯化钠8g，Tween 20ml，用HCl调节pH到7.6)洗涤三次，每次5分钟，二抗为抗兔抗体(购自Santa Cruz公司，1∶10000)，室温孵育1小时，再用TBST洗涤三次，每次10分钟，最后用ECL plus试剂(Amersham Biosciences)反应5分钟后，以X-光片曝光检测，检测结果如图2所示。
图2的免疫印迹结果显示，10对癌组织与癌旁组织中均呈现这样的现象癌组织中氨甲酰磷酸合成酶1的杂交条带的浓度都明显低于相应的癌旁组织，可见氨甲酰磷酸合成酶1在肝细胞癌的癌组织中存在低表达，该结果与双向凝胶电泳结果一致。
同时取一对组织样品(3 17)，用购买的抗氨甲酰磷酸合成酶1抗体进行免疫印迹分析，具体过程简述如下每个样品取60μg蛋白质样品用双向凝胶电泳分离，转移至PVDF膜(购自AmershamBiosciences公司)上，一抗使用兔抗人氨甲酰磷酸合成酶1多克隆抗体(购自Abcam公司，1∶2000)，4℃孵育过夜，用TBST(每升含Tris 2.42g，氯化钠8g，Tween 20ml，用HCl调节pH到7.6)洗涤三次，每次5分钟，二抗为抗兔抗体(购自Santa Cruz公司，1∶10000)，室温孵育1小时，再用TBST洗涤三次，每次10分钟，最后用ECL plus试剂(Amersham Biosciences)反应5分钟后，以X-光片曝光检测，检测结果如图3所示。
其中，病例3 17癌组织与3 17癌旁组织样品进行了双向凝胶电泳的免疫印迹分析，发现氨甲酰磷酸合成酶1的不同的翻译后修饰形式在癌组织中也有下调表达(图3)，并且这一结果与双向凝胶电泳银染图谱是相互吻合的(图1)，进一步提示氨甲酰磷酸合成酶1不同的翻译后修饰形式也是重要的变化指标。
综上所述，氨甲酰磷酸合成酶1在肝细胞癌的癌组织及癌旁组织中存在差异表达，显然与肝细胞癌的发生发展有着密切的相关性，因此，以氨甲酰磷酸合成酶1作为一个蛋白质分子标记对其表达量进行检测可以用于检测肝细胞癌。相应的，特异性抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗体，包括各种抗氨甲酰磷酸合成酶1的单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能够用于检测氨甲酰磷酸合成酶1的表达量，因而可以用于检测肝癌，或者用于制备检测肝癌的制剂或试剂盒等，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
虽然有关氨甲酰磷酸合成酶1动态的生物学功能及肿瘤相关机制还有待进一步研究，但是将其作为检测肝癌的标记物却是肯定的。氨甲酰磷酸合成酶1可作为肝细胞癌的潜在标志，而其在胞内的生物学功能提示氨甲酰磷酸合成酶1可能作为肝癌的预后分子标记和临床治疗的靶分子。
权利要求
1.一种氨甲酰磷酸合成酶1的应用，其特征在于，用作检测肝癌的蛋白质分子标记。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用作检测肝癌的蛋白质分子标记是检测该蛋白在肝细胞组织中的表达量。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测该蛋白在肝细胞组织中的表达量是检测该蛋白在肝细胞组织中是否存在下调表达。
4.一种抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗体的应用，其特征在于，用于制备检测肝癌的制剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
6.一种抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗体的应用，其特征在于，用于制备检测肝癌的试剂盒。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
8.一种体外检测肝细胞组织中氨甲酰磷酸合成酶1的表达是否异常的方法，其特征在于包括以下步骤A、用特异性抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗体检测待测肝细胞中氨甲酰磷酸合成酶1的数量；B、将步骤A测得的氨甲酰磷酸合成酶1的数量与正常肝组织中的氨甲酰磷酸合成酶1的数量进行比较，如测得的蛋白数量低于正常值，则表示被检测肝组织中氨甲酰磷酸合成酶1的表达异常。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述所述抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
全文摘要
本发明通过筛选在肝细胞癌的癌组织和癌旁组织中存在差异表达的蛋白，找到了一种在肝细胞癌的癌组织中低表达的蛋白，免疫印迹实验进一步证实了氨甲酰磷酸合成酶1的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达，同时双向凝胶电泳的免疫印迹进一步证实氨甲酰磷酸合成酶1的不同的翻译后修饰形式在癌组织中也有差异表达。鉴于氨甲酰磷酸合成酶1与肝细胞癌的这种相关性，该蛋白可以用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。
文档编号G01N33/577GK1920052SQ20051002915
公开日2007年2月28日 申请日期2005年8月26日 优先权日2005年8月26日
发明者曾嵘, 李辰, 周晓, 袁新雨 申请人:中国科学院上海生命科学研究院