专利名称：利用apes修饰玻片制备蛋白质、dna及脂类微阵列的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物芯片/微阵列的制备方法，尤其涉及一种用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)修饰玻片，固定蛋白质、DNA，和脂类，来制备蛋白质、DNA、脂类微阵列的方法，以用于检测多种自身免疫性抗体，属生物芯片和诊断试剂等技术领域。
背景技术：
自身免疫性疾病在人群中的发病率是3-5％，尤其是在老年人中发病率最高。这类疾病最普遍的特点是血清中出现自身抗体，而且不同的自身抗体谱可以区分这类疾病中的各种疾病。目前国际上通用的自身免疫性疾病的诊断标准除了相应的临床症状外，其诊断主要还依据患者的血清中检测到自身抗体。风湿病在早期很难诊断，但是在疾病的晚期，全身多个器官系统都会被累及，给病人造成巨大的痛苦，所以需要一种灵敏度高而全面的诊断方法，而目前自身抗体的检测主要采用免疫学方法，常用的有免疫印记、免疫荧光、酶联免疫吸附实验等，这些方法的结果通常来说是不能比较的，而且，这些方法只能检测单种抗体，在实际应用过程中，不能大量平行检测多个自身抗体，而对于诊断风湿病来说，需要检测多个抗体，所以现有的这些检测方法需要相对大量的试剂和临床标本，加重了病人的身体和精神负担，也给临床医师带来不便。
生物芯片/微阵列技术是上个世纪末期产生的高通量平行检测技术，它一经产生就显示了极大的优势，寡核苷酸微阵列已经在基因表达和人类疾病的研究中取得了广泛的成果，而蛋白质微阵列近年内也发展迅速，已经应用于ToRCH感染病原体和过敏原的检测。有人采用芯片的方法对15种自身抗体的检测，发现蛋白芯片的检测灵敏度和特异度均与ELISA实验相当，另一研究者用芯片对18种抗原的稀释血清检测到自身抗体，特异度和敏感性也很高，而且可以达到40fg的检测下限。德国的欧蒙医学诊断实验室已经研制出用于自身免疫疾病检测的包括六种抗可提取性核抗原(ENA)在内的斑点膜条。
制备蛋白质芯片的过程中，基片的选择和处理是很重要的一步，它不但要对蛋白质有较高的固定能力，而且还要保证固定在其表面的蛋白质保持活性。目前大部分蛋白质芯片都采用玻片作为基片，基片的修饰方式也是多种多样的，目前常用的有氨基、多聚赖氨酸、醛基等，利用它们的活性基团与蛋白质的活性基团结合，达到固定蛋白质的目的。所以，寻找一种蛋白固定效果好，信噪比高的玻片对于制备蛋白质微阵列意义重大。
APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)是一种常用的免疫组化基片固定试剂，价格也比较便宜，APES修饰的玻片若能够同时固定蛋白质、DNA及脂类，制备抗原-抗体微阵列，检测风湿病患者血清中的自身抗体，将具有广泛的临床应用价值，进而将具有巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
针对现有技术的不足和临床诊断的需要，本发明要解决的问题是提供一种新型的利用APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法。
本发明的利用APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法，由下述方法组成(1)将玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗至玻片洁净，离心机甩干；(2)将上述洗净的玻片放入体积比为1∶45～55的丙酮稀释的APES中，停留20～50秒钟；(3)取出玻片，稍停片刻，再入纯丙酮溶液涮去未结合的APES；(4)以上述APES修饰的玻片作为基片，固定蛋白质、DNA及酯类，制备抗原-抗体微阵列。
其中，上述APES与丙酮稀释的体积比优选为1∶50。
其中，上述步骤(2)所述APES修饰停留的时间优选为20～30秒钟。
在本发明所述的利用APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法中，固定蛋白质制备抗原-抗体微阵列的方法是，将人IgG用PBST做系列稀释，形成10个浓度梯度；用点样仪分别成列点在上述用APES修饰的玻片上，每一浓度点1行5个重复；阳性对照选用同样点样液稀释的IgG，阴性对照选用PBST点样液，同样分别成列点在前述用APES修饰的玻片上；形成除阳性对照和阴性对照外的5×10阵列(见图1)。
在本发明所述的利用APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法中，固定DNA制备抗原-抗体微阵列的方法是，将从原核表达载体pcDNAII中提取的DNA(见图6)，用PBST做系列稀释，形成6个浓度梯度；用点样仪分别成列点在上述用APES修饰的玻片上，每一浓度点1行5个重复；阳性对照选用同样点样液稀释的IgG，阴性对照选用PBST点样液，同样分别成列点在前述用APES修饰的玻片上；形成除阳性对照和阴性对照外的5×6阵列。
在本发明所述的利用APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法中，固定脂类制备抗原-抗体微阵列的方法是，将心磷脂用二甲基亚砜做系列稀释，形成6个浓度梯度；用点样仪分别成列点在上述用APES修饰的玻片上，每一浓度点1行5个重复；阳性对照选用人IgG，阴性对照选用DMSO点样液，同样分别成列点在前述用APES修饰的玻片上；形成除阳性对照和阴性对照外的5×6阵列。
在本发明所述的利用APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法中，固定蛋白质、核酸及磷脂制备检测风湿病患者血清中自身抗体的抗原-抗体微阵列的方法是，将七种自身抗原，即ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1、心磷脂用点样仪点在上述APES修饰的玻片上；阳性对照为IgG，阴性对照人成骨蛋白-7，空白对照为PBST，同样分别点在前述用APES修饰的玻片上；每个样品设4～5个重复，制备成微阵列。
采用本发明经APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法，其所制备的玻片检测灵敏度高，平均荧光值高，既有高灵敏度，又没有扩散，对蛋白的固定效果最好。在检测风湿病患者血清实验中，与目前检测方法相比，符合率较高(见图3，7)。
下面以五种不同修饰方法的玻片作为基片，固定蛋白质以制备微阵列，对本发明所述方法产生的效果进行比较1.五种不同修饰方法的玻片的制备将玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗；双蒸水冲洗至洁净，离心机甩干。除氨基玻片购自Cel associate公司外，分别制备APES修饰玻片、多聚赖氨酸修饰玻片、醛基-PBS修饰的玻片、醛基-H2O修饰的玻片。
2.APES蛋白芯片的制备和分析2.1蛋白质芯片的制备将人IgG做系列稀释，形成10个浓度梯度。用Cartisian点样仪分别点在前述五种玻片上。阳性对照选用同样点样液稀释的IgG，阴性对照选用PBST点样液。取氨基、多聚赖氨酸、醛基-PBS、醛基-H2O、APES玻片各一片，按浓度下降的次序点样，每一浓度点1行5个重复，形成5×10阵列(见图1)。
2.2杂交反应将制备好的蛋白质微阵列经过温孵、封闭、洗涤、与荧光标记的二抗杂交、洗涤后，用ScanArray4000扫描，采用Quantarray对杂交点的荧光强度图象进行定量分析，所有实验重复三次。
3.APES修饰的玻片固定自身抗原检测风湿病患者血清将七种自身抗原用Cartisian点样仪点在APES修饰的玻片上，经过温孵、封闭、洗涤、与经过稀释的患者血清杂交、洗涤、与荧光标记的二抗杂交、洗涤后，扫描图象。
实验结果1)不同表面修饰固定蛋白质的图像直观对比图2为扫描的图像，由图中可见五种玻片对蛋白的固定效果不同。APES、多聚赖氨酸、醛基-H2O玻片制备的蛋白芯片检测的灵敏度较高，检测限度可以达到0.05mg/ml，但是多聚赖氨酸、醛基-H2O玻片上蛋白点有扩散，说明其对蛋白固定的效果不是太好。而氨基玻片上蛋白虽然扩散，但是灵敏度较低，醛基-PBS玻片检测灵敏度较低，而且有蛋白点扩散。APES玻片即有高灵敏度，又没有扩散，对蛋白的固定效果最好。
2)不同表面修饰固定蛋白质的效率对比玻片上固定的蛋白质反应性越强，则参与反应的荧光标记蛋白质反应活性越强，则参与反应的荧光标记蛋白质越多，所获取的荧光信号越强。经荧光扫描，各蛋白浓度杂交点所测得的平均荧光值减去相应玻片的背景及相应玻片上阴性对照PBST的平均荧光值即该杂交点最终的荧光值。
荧光强度测定结果表明五种玻片中APES玻片所得到的平均荧光值最高，多聚赖氨酸玻片次之，其次是醛基-PBS和醛基-H2O玻片，最后是氨基玻片，说明APES玻片信噪比最高。由图3可见APES修饰玻片在IgG浓度为0.5mg/ml时达到峰值平台期，在实际应用中可以节约抗原(见图4)。
4.蛋白浓度与荧光强度的相关性选择杂交、固定效果最好的APES玻片，以蛋白浓度为横坐标，发现在0.05-0.5mg/ml范围内呈明显的线性关系，R2＝0.9885，大于0.5mg/ml时达到饱和，说明蛋白芯片杂交荧光强度为蛋白浓度线性关系(见图5)。
5.提取质粒DNA作为检测抗双链(ds-)DNA抗体的抗原。抗双链DNA抗体是一种系统性红斑狼疮患者血液中重要的抗体，对该病有较高的诊断特异性，是诊断及判断SLE患者疾病活动性的重要指标之一。申请人选择本实验室冻存的原核表达载体pcDNA II提取质粒DNA，作为抗原，固定在APES修饰的玻片上制备微阵列，检测风湿病患者血清中的抗ds-DNA抗体，效果较好。
6.用心磷脂作为检测抗磷脂抗体的抗原。通过实验发现，结果较好。
7.APES修饰的玻片固定自身抗原制备微阵列，检测风湿病患者血清结果七种包括蛋白质、磷脂、核酸、在内的自身抗原能够固定在APES修饰的玻片上，制备微阵列，用此微阵列检测风湿病患者血清，与目前检测方法相比，符合率较高(见图3，7)。
在蛋白质微阵列的制备和检测过程中，蛋白点样液、封闭液种类、与二抗反应的时间等因素对荧光信号的强弱都有影响，本实验将上述条件都尽量保持一致。在激光共聚焦扫描仪检测过程中，扫描仪的激光强度和光电倍增管参数的增加，荧光强度也随之增大，但同时背景也有加大的趋势，本实验将激光强度和光电倍增管参数都设置为75％，并在检测过程中保持一致。
制备蛋白质芯片的过程中，基片的选择和处理是很重要的一步，它不但要对蛋白质有较高的固定能力，而且还要保证固定在其表面的蛋白质保持活性。目前大部分蛋白质芯片都采用玻片作为基片。
通过比较五种不同修饰方法的玻片发现，APES修饰的玻片对蛋白固定效果最好。氨基玻片和APES玻片分别是由氨丙基三甲氧基硅烷和氨丙基三乙氧基硅烷处理而得到的，它们都是对玻片进行氨基化处理，在玻片表面形成活化的氨基，与蛋白质的羧基缩合反应，形成共价键，但是两者所固定的蛋白质反应活性差别很大，具体原因还需进一步分析。
在实验过程中还发现，IgG浓度在0.5～2.5mg/ml之间时，荧光值达到饱和，APES玻片在IgG浓度为0.5mg/ml时，荧光值就达到饱和，而且IgG浓度在0.05～0.5之间时，荧光强度与IgG浓度保持良好的线性关系，证明APES玻片的检测灵敏度高。
总之，制备蛋白质微阵列是个复杂的过程，需要考虑到多方面的因素，本实验对上述五种修饰方法的玻片作了比较，发现APES修饰的玻片比较适合制备蛋白质微阵列。而在进一步的实验中发现APES修饰的玻片也适用于固定核酸和磷脂，制备的抗原-抗体微阵列检采风湿病患者血清与临床目前检测方法符合率较高。
图1.蛋白微阵列点样分布图其中左边起，第一列为阳性对照，第二列为阴性对照。三到七列为五个重复的系列稀释的IgG图2.五种不同处理玻片制备的芯片的固定杂交效果扫描图像其中A APES修饰的玻片，B多聚赖氨酸修饰的玻片，C Cel associated氨基玻片，D醛基-H2O修饰的玻片，E醛基-PBS修饰的玻片。每个阵列上设有7列，第一列阳性IgG对照，第二列PBST阴性对照，三到七列为5个重复的系列稀释的IgG。
图3.APES修饰的玻片固定自身抗原，制备微阵列的点样分布图其中①阳性对照；②阴性对照；③ANAs；④dsDNA；⑤Ro-60/SSA；⑥Ro-52/SSA；⑦La/SSB；⑧Jo-1；⑨心磷脂；⑩PBST。每个样品有四个重复。
图4.不同玻片上荧光强度及与蛋白质浓度关系比较图5.APES玻片各IgG浓度与荧光强度的线性关系图6.从原核表达载体pcDNA II提取质粒DNA的琼脂糖电泳图。
其中(从左到右)1.质粒DNA；2.同1；3.DNAMarker DL2000图7.用APES玻片制备抗原-抗体微阵列检测风湿病患者血清的图像其中A临床目前检测方法检测结果dsDNA+，抗磷脂抗体(Acl)IgG+；微阵列检测结果dsDNA+，抗磷脂抗体(Acl)IgG+。
B临床目前检测方法检测结果ANA+，dsDNA+，Acl IgG+，SSA+，SSB+；微阵列检测结果ANA+，dsDNA+，Acl IgG+，SSA+，SSB+。
C临床目前检测方法检测结果ANA+，dsDNA+，Acl IgG+，SSA+，SSB+；微阵列检测结果ANA+，dsDNA+，Acl IgG+，SSA+，SSB+，Jo-1+。
具体实施例方式
下面结合实施例对发明的内容作进一步阐述实施例1(1)将玻片分别用1N NaOH和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗至玻片洁净，离心机甩干；(2)将上述洗净的玻片放入体积比为1∶47的丙酮稀释的APES中，停留30～40秒钟；(3)取出玻片，稍停片刻，控干液滴，再入纯丙酮溶液涮去未结合的APES；(4)以上述APES修饰的玻片作为基片，固定蛋白质，制备微阵列。
将人IgG从50mg/mL开始，用PBST(每升中含NaCl 8.0g，KCl 0.20g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，Tween-20 1ml)做系列稀释，浓度依次为50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05mg/ml共十个梯度，用Cartisian点样仪分别点在上述用APES修饰的玻片上，每一浓度点1行5个重复；阳性对照选用同样点样液稀释的IgG，阴性对照选用PBST点样液，同样分别成列点在前述用APES修饰的玻片上；形成除阳性对照和阴性对照外的5×10阵列。
实施例2(1)将玻片分别用1N NaOH和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗至玻片洁净，离心机甩干；(2)将上述洗净的玻片放入体积比为1∶50的丙酮稀释的APES中，停留20～30秒钟；(3)取出玻片，稍停片刻，控干液滴，再入纯丙酮溶液涮去未结合的APES；(4)-70℃冻存的载体质粒pcDNAII复苏后，接种含氨苄西林(ampicillin)50ml的LB(LB-Amp)琼脂固体培养基，37℃过夜。挑单个菌落接种于LB-Amp液体培养基，37℃摇床，振荡扩增质粒过夜，用质粒中提试剂盒提取质粒，做琼脂糖凝胶电泳验证，并测其浓度为300μg/ml。
(5)以上述APES修饰的玻片作为基片，将提取的质粒DNA，做系列稀释，浓度分别为300、200、100、50、25、10μg/ml，用Cartisian点样仪点样，制备微阵列。
实施例3.
(1)将玻片分别用1N NaOH和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗至玻片洁净，离心机甩干；(2)将上述洗净的玻片放入体积比为1∶48的丙酮稀释的APES中，停留32～42秒钟；(3)取出玻片，稍停片刻，控干液滴，再入纯丙酮溶液涮去未结合的APES；(4)将从Sigma购买的心磷脂溶液，用二甲基亚砜(DMSO)做系列稀释，浓度分别为4000、2000、1000、500、200、100μg/ml，用Cartisian点样仪点样，制备微阵列。
实施例4(1)将玻片分别用1N NaOH和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗至玻片洁净，离心机甩干；(2)将上述洗净的玻片放入体积比为1∶53的丙酮稀释的APES中，停留25～35秒钟；(3)取出玻片，稍停片刻，控干液滴，再入纯丙酮溶液涮去未结合的APES；(4)以上述APES修饰的玻片作为基片，固定蛋白质、核酸及磷脂制备检测风湿病患者血清的抗原-抗体微阵列。
将七种自身抗原，即ANAs(300μg/ml)、dsDNA(200μg/ml)、SSA/Ro-60(100μg/ml)、SSA/Ro-52(200μg/ml)、SSB/La(300μg/ml)、Jo-1(200μg/ml)、心磷脂(1000μg/ml)用Cartisian点样仪点在APES修饰的玻片上，阳性对照为10mg/ml的IgG，阴性对照为人成骨蛋白-7(BMP-7)，空白对照为PBST(每升中含NaCl 8.0g，KCl0.20g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，Tween-20 1ml)。每个样品设四个重复，制备成微阵列。
实施例51.五种不同修饰方法的玻片的制备将玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗；双蒸水冲洗至洁净，离心机甩干。(1)APES修饰玻片的制备APES现用现配。将洗净的玻片放入以1∶50比例丙酮稀释的APES中，停留20～30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液涮去未结合的APES。(2)多聚赖氨酸修饰玻片将玻片用清洁液清洗干净后，浸泡于含10％多聚赖氨酸的PBS(每升中含NaCl8.0g，KCl 0.20g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g)中，置摇床60rpm平摇1小时，双蒸水清洗，离心机甩干。(3)醛基-PBS修饰的玻片将氨基玻片置于含2.5％戊二醛的PBS溶液中2小时，然后用PBS清洗，离心机甩干。(4)醛基-H2O修饰的玻片将氨基玻片置于含2.5％戊二醛的水溶液中2小时，然后用蒸馏水清洗，离心机甩干。(5)氨基玻片购自Cel associate公司。
2.蛋白芯片的制备和分析2.1蛋白质芯片的制备将人IgG从50mg/mL开始，用PBST(每升中含NaCl 8.0g，KCl 0.20g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，Tween-20 1ml)做系列稀释，浓度依次为50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05mg/ml共十个梯度，用Cartisian点样仪分别点在前述五种玻片上。阳性对照选用同样点样液稀释的10mg/ml的IgG，阴性对照选用PBST点样液。取氨基、多聚赖氨酸、醛基-PBS、醛基-H2O、APES修饰的玻片各一片，按浓度下降的次序点样，每一浓度点1行5个重复，形成5×10阵列。
2.2杂交反应将制备好的蛋白质微阵列在37℃杂交盒中温孵2h，用封闭液(0.01mol/L PBS，含1％BSA，2.5％蔗糖)封闭2h，醛基玻片要在硼氰化钠溶液(26mg硼氰化钠，2.5ml无水乙醇，7.5ml PBS)中还原5min，PBS洗三次，每次15秒，离心机甩干，每个阵列中加入2.5μL Cy3标记的羊抗人IgG，37℃温孵1h，PBS洗三次，方法同前，用ScanArray4000扫描，扫描仪的参数Laser power及PMT均为设定为75％，图像存为TIEF文件，然后采用Quantarray对杂交点的荧光强度图象进行定量分析，所有实验重复三次。3.将从原核表达载体中提取的质粒DNA，用PBST做系列稀释，浓度分别为300、200、100、50、25、10μg/ml，阳性对照选用同样点样液稀释的10mg/ml的IgG，阴性对照选用PBST点样液，用Cartisian点样仪点在APES修饰的玻片上，制备成微阵列。将此微阵列在37℃杂交盒中温孵2h，封闭液(0.01mol/L PBS，含1％BSA，2.5％蔗糖)封闭30min，PBS洗三次，每次15秒，离心机甩干，每个阵列中加入3μL用PBS按1∶2稀释的含抗dsDNA抗体的标准抗体血清，在37℃杂交盒中温孵30min，PBS洗三次，方法同前，每个阵列中加入3μL Cy3标记的羊抗人IgG，37℃温孵30min，PBS洗三次，方法同前，用ScanArray4000扫描，扫描仪的参数Laser power及PMT均设定为85％，图像存为TIEF文件。
4.将从Sigma购买的心磷脂溶液，用二甲基亚砜(DMSO)做系列稀释，浓度分别为4000、2000、1000、500、200、100μg/ml，阳性对照选用同样点样液稀释的10mg/ml的IgG，阴性对照选用DMSO，用Cartisian点样仪点样，制备微阵列。将此微阵列在37℃杂交盒中温孵2h，封闭液(0.01mol/L PBS，含1％BSA，2.5％蔗糖)封闭30min，PBS洗三次，每次15秒，离心机甩干，每个阵列中加入3μL用PBS按1∶2稀释的含抗磷脂抗体的标准抗体血清，在37℃杂交盒中温孵30min，PBS洗三次，方法同前，每个阵列中加入3μL Cy3标记的羊抗人IgG，37℃温孵30min，PBS洗三次，方法同前，用ScanArray4000扫描，扫描仪的参数Laser power及PMT均为设定为85％，图像存为TIEF文件。
5.APES修饰的玻片固定自身抗原制备微阵列，检测风湿病患者血清将七种自身抗原，即ANAs(300μg/ml)、dsDNA(200μg/ml)、SSA/Ro-60(100μg/ml)、SSA/Ro-52(200μg/ml)、SSB/La(300μg/ml)、Jo-1(200μg/ml)、心磷脂(1000μg/ml)用Cartisian点样仪点在APES修饰的玻片上，阳性对照为10mg/ml的IgG，阴性对照为本实验室制备的人成骨蛋白-7(BMP-7)，空白对照为PBST。每个样品设四个重复，制备成微阵列。将此微阵列在37℃杂交盒中温孵2h，封闭液(0.01mol/L PBS，含1％BSA，2.5％蔗糖)封闭30min，PBS洗三次，每次15秒，离心机甩干，每个阵列中加入3μL用PBS按1∶2稀释的风湿病患者血清，在37℃杂交盒中温孵30min，PBS洗三次，方法同前，每个阵列中加入3μL Cy3标记的羊抗人IgG，37℃温孵30min，PBS洗三次，方法同前，用ScanArray4000扫描，扫描仪的参数Laser power及PMT均为设定为85％，图像存为TIEF文件。
结果表明1)不同表面修饰固定蛋白质的图像直观对比图2为扫描的图像由图中可见五种玻片对蛋白的固定效果不同。APES、多聚赖氨酸、醛基-H2O修饰玻片制备的蛋白芯片检测的灵敏度较高，检测限度可以达到0.05mg/ml，但是多聚赖氨酸、醛基-H2O玻片上蛋白点有扩散，说明其对蛋白固定的效果不是太好。而氨基玻片上蛋白虽然扩散，但是灵敏度较低，醛基-PBS玻片检测灵敏度较低，而且有蛋白点扩散。APES玻片即有高灵敏度，又没有扩散，对蛋白的固定效果最好。
2)不同表面修饰固定蛋白质的效率对比玻片上固定的蛋白质反应性越强，则参与反应的荧光标记蛋白质反应活性越强，则参与反应的荧光标记蛋白质越多，所获取的荧光信号越强。经荧光扫描，各蛋白浓度杂交点所测得的平均荧光值减去相应玻片的背景及相应玻片上阴性对照PBST的平均荧光值即该杂交点最终的荧光值。
荧光强度测定结果表明五种玻片中APES玻片所得到的平均荧光值最高，多聚赖氨酸玻片次之，其次是醛基-PBS和醛基-H2O玻片，最后是氨基玻片，说明APES玻片信噪比最高。由图3可见APES修饰玻片在IgG浓度为0.5mg/ml时达到峰值平台期，在实际应用中可以节约抗原(见图4)。
6.蛋白浓度与荧光强度的相关性选择杂交、固定效果最好的APES玻片，以蛋白浓度为横坐标，发现在0.05-0.5mg/ml范围内呈明显的线性关系，R2＝0.9885，大于0.5mg/ml时达到饱和，说明蛋白芯片杂交荧光强度为蛋白浓度线性关系(见图5)。
7.APES修饰的玻片固定自身抗原制备微阵列，检测风湿病患者血清七种包括蛋白质、磷脂、核酸在内的自身抗原能够固定在APES修饰的玻片上，制备微阵列，用此微阵列检测风湿病患者血清，与目前检测方法相比，符合率较高(见图3，7)。
权利要求
1.一种利用APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法，由下述方法组成(1)将玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗至玻片洁净，离心机甩干；(2)将上述洗净的玻片放入体积比为1∶45～55的丙酮稀释的APES中，停留20～50秒钟；(3)取出玻片，稍停片刻，再入纯丙酮溶液涮去未结合的APES；(4)以上述APES修饰的玻片作为基片，固定蛋白质、DNA及脂类，制备微阵列。
2.如权利要求1所述的利用APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法，其特征是，所述APES与丙酮稀释的体积比为1∶50。
3.如权利要求1所述的利用APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法，其特征是，步骤(2)所述APES修饰停留的时间为20～30秒钟。
4.如权利要求1所述的利用APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法，其特征是，所述固定蛋白质制备抗原-抗体微阵列的方法是，将人IgG用PBST做系列稀释，形成10个浓度梯度；用点样仪分别成列点在上述用APES修饰的玻片上，每一浓度点1行5个重复；阳性对照选用同样点样液稀释的IgG，阴性对照选用PBST点样液，同样分别成列点在前述用APES修饰的玻片上；形成除阳性对照和阴性对照外的5×10阵列。
5.如权利要求1所述的利用APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法，其特征是，所述固定DNA制备抗原-抗体微阵列的方法是，将从原核表达载体pcDNA II中提取的DNA，用PBST做系列稀释，形成6个浓度梯度；用点样仪分别成列点在上述用APES修饰的玻片上，每一浓度点1行5个重复；阳性对照选用同样点样液稀释的IgG，阴性对照选用PBST点样液，同样分别成列点在前述用APES修饰的玻片上；形成除阳性对照和阴性对照外的5×6阵列。
6.如权利要求1所述的利用APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法，其特征是，所述固定脂类制备抗原-抗体微阵列的方法是，将心磷脂用二甲基亚砜做系列稀释，形成6个浓度梯度；用点样仪分别成列点在上述用APES修饰的玻片上，每一浓度点1行5个重复；阳性对照选用人IgG，阴性对照选用DMSO点样液，同样分别成列点在前述用APES修饰的玻片上；形成除阳性对照和阴性对照外的5×6阵列。
7.如权利要求1所述的利用APES修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法，其特征是，所述固定蛋白质、核酸及磷脂制备检测风湿病患者血清的抗原-抗体微阵列的方法是，将七种自身抗原，即ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1、心磷脂用点样仪点在上述APES修饰的玻片上；阳性对照为IgG，阴性对照人成骨蛋白一7，空白对照为PBST，同样分别点在前述用APES修饰的玻片上；每个样品设4～5个重复，制备成微阵列。
全文摘要
本发明公开了一种利用APES(3－氨丙基三乙氧基硅烷)修饰玻片制备蛋白质、DNA及脂类微阵列的方法，由下述方法组成(1)将玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗至玻片洁净，离心机甩干；(2)将上述洗净的玻片放入体积比为1∶45～55的丙酮稀释的APES中，停留20～50秒钟；(3)取出玻片，稍停片刻，再入纯丙酮溶液涮去未结合的APES；(4)以上述APES修饰的玻片作为基片，固定蛋白质、DNA及脂类，制备微阵列。利用本发明的方法与其它化学处理的玻片相比，固定效果好，检测灵敏度高，平均荧光值高，激光共聚焦检测信噪比高，具有广泛的临床应用价值，将带来巨大的社会效益和经济效益。
文档编号G01N33/53GK1763528SQ20051004479
公开日2006年4月26日 申请日期2005年9月22日 优先权日2005年9月22日
发明者韩金祥, 徐华, 高雪芹, 刘毅 申请人:山东省医药生物技术研究中心