专利名称：一种大肠癌分子分期检测方法
技术领域：
本发明涉及恶性肿瘤分子分期检测领域，为一种新的非侵入性的分期方法，对大肠癌进行缜密术前分期，对于指导新辅助治疗，明确手术范围及指征，并进行正确综合治疗及判断预后均具有重大意义。其总准确率均达到75.00％以上。
背景技术：
大肠癌在世界范围是第三大常见恶性肿瘤，在发达国家占第二位。近年来，我国大肠癌死亡率在大城市位居第四位，在农村位居第五位，并有逐年上升趋势。迄今为止大肠癌术前分期尚没有理想的方法，而术前准确地了解肿瘤侵犯范围对于临床医师选择手术方式和制定合理的综合治疗计划非常重要。过去50年来大肠癌根治术后生存率无明显变化，50％患者术后因局部复发或转移而最终死亡。死因与分期较晚和是否合理选择治疗方法有直接关联。大肠癌的治疗效果主要与病期有关，因此如何早期确诊并及早正确术前分期以指导治疗成为迫切要解决问题。迄今为止，大肠癌的标准治疗方法仍然是外科手术切除，术前对大肠癌侵犯程度的正确诊断直接影响其治疗方式的选择。今天术前分期被认为是前瞻性评价原发病灶范围，正确选定综合治疗方案、进行新辅助治疗及预测根治性手术后生存率和正确制定术后随访计划最关键的因素。
目前，传统的非侵入性大肠癌的术前分子分期常有以下几种方法①X线造影和纤维内窥镜，虽然两者对消化道肿瘤粘膜表面，粘膜下或粘膜自身病变具有良好显示能力，但都难以了解癌肿腔外浸润程度、与临近器官关系、区域淋巴结转移情况，均不能对结直肠癌进行术前分期。②螺旋CT，螺旋CT对于术前早期病变T1-T3分期还有一定限度；N分期较困难，必须综合其大小、形态、密度及其生物学行为进行全面的判断。周纯武等报道探讨螺旋CT(SCT)对结、直肠癌术前分期的价值，总的分期准确率为58.1％(18/31)。判断T分期的准确率为84.4％(27/32)，N分期的准确率为61.3％(19/31)。③磁共振、腔内B超对确定大肠癌有无淋巴结转移意义不可靠，因为它们均难发现小的淋巴结，而有癌转移的淋巴结78％直径≤5mm。它们可发现直径10-15mm以上的淋巴结，但大的淋巴结不一定是转移的。③直肠指检可扪及至少距肛门7cm以内直肠壁，但也不能评估淋巴结转移。③血液中肿瘤标记物的检测，癌胚抗原(CEA)、血清糖链抗原199(CA199)、血清糖链抗原242(CA242)等肿瘤标志物，不具有特异性诊断价值，只对估计预后和术后复发有一定帮助，对于分期则没有帮助。
表面-增强激光解吸-电离(SELDI)其基本原理是通过特定的化学表面结合蛋白质分子再以激光轰击，使蛋白质成为离子而飞行于电场中并被检测器所测得，进而用不同位置、强度的峰来表示各种不同的蛋白质及其相对含量，最终形成可用于分析的图谱，是最近几年才发展起来的一种新的蛋白组学的研究方法。SELDI可以克服二维凝胶电泳存在的内在问题，包括疏水性问题、强酸性、强碱性的蛋白质的分离、膜蛋白的分离问题、低分子量检测的灵敏性、低丰度蛋白质的灵敏性问题。蛋白质只要与SELDI蛋白质芯片阵列结合，就可通过电离-解吸飞行时间-质谱仪检测，并根据蛋白质的质量和电荷比(m/z)每一个蛋白质的峰值明显地分离并形成一个蛋白质(保留在芯片上的蛋白质)的图谱。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种大肠癌分子分期的检测方法，由此方法建立的该指纹图谱模型为大肠癌术前分子分期提供了新的途径和方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。
本发明方法通过以下步骤实现1.标本准备将待测血清标本冰浴中解冻，10000r/min离心5min，取5μL与10μLU9处理液(9mol/L尿素、0.2％CHAPS，0.1％DTT)混合振荡处理30min后，加50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)185μL混匀，CM10芯片(弱阳离子交换蛋白芯片)置于96孔支架中，50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)平衡芯片5min×2次，取经过处理、稀释的血清100μL加至芯片上，4℃摇床反应1h，反应结束甩干芯片表面液体，依次以50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)清洗芯片5min×3次；去离子水快速清洗2次，芯片自然干燥后点加1μL能量吸收基质(SPA)两次，待干燥后行质谱仪检测。
2.数据收集应用PBS-II表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪(SELDI-TOF-MS)、SPA收集血清蛋白质质谱数据，激光强度165，检测灵敏度7，数据收集范围2000～30000m/z。
3、数据处理及检测依据由六个蛋白质峰[2759.58、2964.66、2048.01、4795.90、4139.77和37761.6质荷比(m/z)]组合的模型检测局限性大肠癌和区域性大肠癌；依据由三个蛋白质峰[6885.30、2058.32和8567.75质荷比(m/z)]组合的模型检测局限区域性大肠癌和系统性大肠癌；依据由三个蛋白质峰[3376.29、4285.21和13762.6质荷比(m/z)]组合的模型检测I期和II期大肠癌；依据由两个蛋白质峰[2759.58和2964.66质荷比(m/z)]组合的模型检测I期和III期大肠癌；依据由三个蛋白质峰[4139.77、2292.31和2759.58质荷比(m/z)]组合的模型检测II期和III期大肠癌；依据由四个蛋白质峰[2954.65、4795.90、2174.44和2890.47质荷比(m/z)]组合的模型检测II期和IV期大肠癌；依据由两个蛋白质峰[6634.67和2022.55质荷比(m/z)]组合的模型检测III期和IV期大肠癌。按国际抗癌联盟(the International Union Against Cancer，UICC)1997TNM(Ttumor原发肿瘤，Nnode淋巴结转移，Mmetastasis远处转移)分期标准将大肠癌分为I，II，III，IV期，应用生物信息学分析方法检测大肠癌分子分期。
原始数据先以蛋白芯片(Proteinchip Software)3.0软件校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，初始噪音过滤值5，二次噪音过滤值2，以10％为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，曼-惠特尼秩检验比较各组血清蛋白质质谱数据寻找各组之间表达有差异的蛋白质峰。
生物信息学分析方法是指应用支持向量机、判别分析和时间序列分析软件进行大肠癌分子分期的检测。
本防主要仪器、软件及试剂PBS-II表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪(SELDI-TOF-MS)、能量吸收基质(SPA芥子酸)、CM10型蛋白质芯片及相应分析软件ProteinChip Software 3.0(美国Ciphergen公司)；支持向量机(support vector machines，SVM)、判别分析(discriminant analysis)和时间序列分析(time-sequence analysis)软件、Matlab6.5数据处理软件(MathWorks公司)；分析纯尿素、乙酸钠、乙腈、DTT和CHAPS缓冲盐(Sigma公司)。
本发明与其他非侵入性大肠癌的诊断方法比较具有以下优点(1)本发明提供的指纹图谱，为大肠癌术前分子分期提供了新的途径和方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。(2)与以往的传统的非侵入性方法比较具有极高总准确率，其总准确率均达75％以上，是一种在蛋白质组学水平上的诊断，对大肠癌的早期发现，早期诊断提供了新的方法与标准。(3)本发明模型的构建方法设计合理，可行，为前瞻性评价大肠癌分期，正确选定综合治疗方案、进行新辅助治疗及预测根治性手术后生存率和正确制定术后随访计划判断预后提供了可靠的依据。从而为降低我国大肠癌的病死率，提高大肠癌的治愈率提供了一种新的方法。
图1不同TNM分期二维散点分布图。
图2为质荷比(M/Z)位于2759.58Da(A)，2964.66Da(B)，2048.01Da(C)，4795.90Da(D)和4139.77Da(E)的部分局限性大肠癌与区域性大肠癌血清的蛋白质质谱图。
具体实施例方式
本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1本发明的检测大肠癌术前分子分期的一种检测方法1.标本准备血清标本冰浴中解冻，10000r/min离心5min，取5μL与10μLU9处理液(9mol/L尿素、0.2％CHAPS即3-环乙胺-1-丙磺酸、0.1％DTT即1，4二硫代苏糖醇的混合配液)混合振荡处理30min后，加50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)185μL混匀。CM10蛋白质芯片置于96孔支架中，50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)平衡芯片5min×2次，取经过处理、稀释的血清100μL加至芯片上，4℃摇床反应1h。反应结束甩干芯片表面液体，依次以50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)清洗芯片5min×3次；去离子水快速清洗2次。芯片自然干燥后点加1μL SPA(能量吸收基质芥子酸)两次，待干燥后行质谱仪检测。
2、数据收集与处理应用PBS-II表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪(SELDI-TOF-MS)、能量吸收分子SPA、CM10型蛋白质芯片及相应分析软件ProteinChip Software3.0及支持向量机(support vector machines，SVM)、判别分析(discriminantanalysis)和时间序列分析(time-sequence analysis)软件。
质谱仪参数设定激光强度165，灵敏度7，数据收集范围2000～30000m/z(蛋白质质量和电荷比值，即质荷比)，每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正分子量。原始数据先以Proteinchip Software 3.0软件校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，初始噪音过滤值5，二次噪音过滤值2，以10％为最小阈值进行聚类。经上述数据预处理后，Mann-Whitney秩检验比较各组血清蛋白质质谱数据(由Proteinchip Software 3.0自带的Biomarker Wizard 3.2.0软件完成)，寻找各组之间表达有差异的蛋白质峰。
3、生物信息学分析大肠癌各期患者术前血清蛋白质质谱比较的数据导入Matlab6.5数据处理软件的SVM(支持向量机)、判别分析软件。选择两组间差别最显著的10个蛋白质峰数据进行分析。筛选出约登指数(Youden′s index)最高的秩和比峰组合，用SVM留一法和判别分析留一法建立分期模型。每组分析样本设为n个，则所有样本中随机抽取n-1个样本设为训练集用于建立模型，剩余1个样本设为测试集进行交叉验证。如此抽样、训练和验证过程重复n次，以得到最接近真实值的结果。最后同时输出SVM、原始判别及二者交叉验证的结果，并应用时间序列分析的方法将I，II，III，IV各期以二维散点图的形式表示(参见图1)。
实施例2检测实例1、样本与仪器2002年3月至2005年5月间我院收治的初诊术前大肠癌患者共76例，中位年龄57岁(18～89岁)，男54例，女22例。按国际抗癌联盟(UICC)1997TNM分期标准分期，其中I期10例，中位年龄53岁(37～77岁)，男7例，女3例；II期19例，中位年龄64岁(32～77岁)，男16例，女3例；III期16例，中位年龄58岁(36～71岁)，男11例，女5例；IV期31例，中位年龄55岁(18～89岁)，男20例，女11例。大肠癌的血清标本须在进行所有治疗前留取。上述诊断均经术后病理证实。所有患者术前血样均于清晨空腹采集，4℃静置离心分离血清，-80℃低温冰箱保存。
PBS-II表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪(SELDI-TOF-MS)、能量吸收分子SPA、CM10型蛋白质芯片及相应分析软件ProteinChip Software 3.0由美国Ciphergen公司研制；支持向量机(support vector machines，SVM)、判别分析(discriminant analysis)和时间序列分析(time-sequence analysis)软件由本研究所运用Matlab6.5数据处理软件(MathWorks公司)开发；分析纯尿素、乙酸钠、乙腈、DTT和CHAPS缓冲盐(Sigma公司)。
2、标本准备血清标本冰浴中解冻，10000r/min离心5min，取5μL与10μL U9处理液(9mol/L尿素、0.2％CHAPS，0.1％DTT)混合振荡处理30min后，加50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)185μL混匀。CM10芯片置于96孔支架中，50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)平衡芯片5min×2次，取经过处理、稀释的血清100μL加至芯片上，4℃摇床反应1h。反应结束甩干芯片表面液体，依次以50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)清洗芯片5min×3次；去离子水快速清洗2次。芯片自然干燥后点加1μL SPA两次，待干燥后行质谱仪检测。
3、数据收集与处理数据收集和统计学分析质谱仪参数设定激光强度165，灵敏度7，数据收集范围2000～30000m/z(蛋白质质量和电荷比值，即质荷比)，每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正分子量。原始数据先以Proteinchip Software 3.0软件校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，初始噪音过滤值5，二次噪音过滤值2，以10％为最小阈值进行聚类。经上述数据预处理后，Mann-Whitney秩检验比较各组血清蛋白质质谱数据(由Proteinchip Software3.0自带的Biomarker Wizard 3.2.0软件完成)，寻找各组之间表达有差异的蛋白质峰。
4、生物信息学分析大肠癌各期患者术前血清蛋白质质谱比较的数据导入Matlab6.5数据处理软件的SVM、判别分析软件。选择两组间差别最显著的10个蛋白质峰数据进行分析。筛选出Youden指数最高的秩和比峰组合，用SVM留一法和判别分析留一法建立分期模型。每组分析样本设为n个，则所有样本中随机抽取n-1个样本设为训练集用于建立模型，剩余1个样本设为测试集进行交叉验证。如此抽样、训练和验证过程重复n次，以得到最接近真实值的结果。最后同时输出SVM、原始判别及二者交叉验证的结果，并应用时间序列分析的方法将I，II，III，IV各期以二维散点图的形式表示，(参见图1)。
结果1.通过对29例局限性(I、II期)大肠癌患者和16例区域性(III期)大肠癌患者血清蛋白质质谱数据的比较，共得到两者间表达差异有统计学意义的蛋白质峰11个。经过交叉验证，判别分析软件筛选出其中6个蛋白质峰[2759.58、2964.66、2048.01、4795.90、4139.77和37761.60质荷比(m/z)](参见图2)组合所构建的诊断模型I鉴别局限性和区域性大肠癌患者的总准确率86.67％(39/45)(表1、表2)。
表1 局限性大肠癌(I、II期)患者与区域性大肠癌(III期)患者比较构建的模型I的6个蛋白质峰比较(x±SD)
表2模型I对局限性大肠癌(I、II期)患者与区域性大肠癌(III期)患者交叉验证结果(例数)
注敏感性86.21％(25/29)；特异性87.50％(14/16)；准确率86.67％(39/45)2.通过对45例局限区域性(I、II、III期)大肠癌患者与31例系统性(IV期)大肠癌患者血清蛋白质质谱数据的比较，共得到两者间表达差异有统计学意义的蛋白质峰24个。经过交叉验证，判别分析软件筛选出其中3个蛋白质峰[6885.30、2058.32和8567.75质荷比(m/z)]组合所构建的诊断模型II鉴别局限区域性大肠癌患者和系统性大肠癌患者的总准确率75.00％(57/76)(表3、表4)。
表3局限区域性(I、II、III期)大肠癌患者和系统性(IV期)大肠癌患者比较构建的模型II的3个蛋白质峰(x±SD)
表4 模型II对局限区域性(I、II、III期)大肠癌患者和系统性(IV期)大肠癌患者的交叉验证结果(例数)
注敏感性80.65％(25/31)；特异性71.11％(32/45)；准确率75.00％(57/76)3.另根据不同蛋白质峰组合所产生的分期模型III、IV、V、VI、VII鉴别其余不同期别的大肠癌患者的结果分期模型III鉴别I期和II期大肠癌患者的总准确率86.2％(25/29)；分期模型IV鉴别I期和III期大肠癌患者的总准确率84.6％(22/26)；分期模型V鉴别II期和III期大肠癌患者的总准确率85.7％(30/35)；分期模型VI鉴别II期和IV期大肠癌患者的总准确率80％(40/50)；分期模型VII鉴别III期和IV期大肠癌患者的总准确率78.7％(37/47)(表5)。应用时间序列分析的方法将I，II，III，IV各期以二维散点图的形式表示，可以明显看出各期之间的区别(参见图1)。
表5几种模型判别大肠癌分期I、II、III、IV期的总准确率和筛选的蛋白质峰组的对比
(m/zMass/Charge质荷比；A，accuracy准确率；Sp，specificity特异性；Se，sencitivity敏感性)无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
权利要求
1.一种大肠癌分子分期检测方法，利用人血清蛋白质指纹图谱，其特征是通过以下步骤实现(1)标本准备采用由9mol/L尿素、0.2％CHAPS，0.1％DTT混合的处理液处理血清标本，采用弱阳离子交换蛋白芯片CM10、pH＝4.0的乙酸钠溶液平衡芯片，取上述处理、稀释的血清加至芯片上再以pH＝4.0的乙酸钠溶液、去离子水清洗芯片，干燥。(2)数据收集应用PBS-II表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪收集血清蛋白质质谱数据，激光强度165，检测灵敏度7，数据收集范围2000～30000m/z。(3)数据处理及检测依据由六个质荷比位于2759.58、2964.66、2048.01、4795.90、4139.77和37761.6的蛋白质峰组合的模型检测局限性大肠癌和区域性大肠癌，依据由三个质荷比位于6885.30、2058.32和8567.75的蛋白质峰组合的模型检测局限区域性大肠癌和系统性大肠癌，依据由三个质荷比位于3376.29、4285.21和13762.6的蛋白质峰组合的模型检测I期和II期大肠癌，依据由两个质荷比位于2759.58和2964.66的蛋白质峰组合的模型检测I期和III期大肠癌，依据由三个质荷比位于4139.77、2292.31和2759.58的蛋白质峰组合的模型检测II期和III期大肠癌，依据由四个质荷比位于2954.65、4795.90、2174.44和2890.47的蛋白质峰组合的模型检测II期和IV期大肠癌，依据由两个质荷比位于6634.67和2022.55的蛋白质峰组合的模型检测III期和IV期大肠癌，应用生物信息学分析方法检测大肠癌分子分期。
2.根据权利要求1所述的一种大肠癌分子分期检测方法，其特征是步骤(1)中经去离子水清洗的芯片自然干燥后再点加能量吸收基质两次。
3.根据权利要求1所述的一种大肠癌分子分期检测方法，其特征是步骤(2)中每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正分子量。
4.根据权利要求1所述的一种大肠癌分子分期检测方法，其特征是步骤(3)中原始数据先以蛋白芯片软件3.0校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，初始噪音过滤值5，二次噪音过滤值2，以10％为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，曼-惠特尼秩检验比较各组血清蛋白质质谱数据寻找各组之间表达有差异的蛋白质峰。
5.根据权利要求1所述的一种大肠癌分子分期检测方法，其特征是步骤(3)中所述生物信息学分析方法是指应用支持向量机、判别分析和时间序列分析软件进行检测。
全文摘要
本发明提供一种大肠癌分子分期检测方法，是利用人血清蛋白质指纹图谱，通过标本准备、数据收集、数据处理完成检测。本发明检测方法具有极高总准确率，其总准确率均达75％以上，是一种在蛋白质组学水平上的诊断，对大肠癌的早期发现，早期诊断提供了新的方法与标准。本发明方法设计合理，可行，为前瞻性评价大肠癌分期，正确选定综合治疗方案、进行新辅助治疗及预测根治性手术后生存率和正确制定术后随访计划判断预后提供了可靠的依据。从而为降低我国大肠癌的病死率，提高大肠癌的治愈率提供了一种新的方法。
文档编号G01N30/06GK1786707SQ200510061718
公开日2006年6月14日 申请日期2005年11月28日 优先权日2005年11月28日
发明者徐文鸿, 陈益定, 张苏展, 胡跃, 余捷凯, 郑树, 胡汛 申请人:浙江大学