专利名称：一种测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌毒力的方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域中一种测定杀菌剂对病原菌毒力的方法，特别是涉及一种测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌毒力的方法。
背景技术：
黄瓜是我国蔬菜产区露地和保护地栽培的主要种植品种，在多数地区可以整年种植。霜霉病是黄瓜生产上最重要的病害之一，凡栽培黄瓜的地区均有发生，在我国尤以北方地区受害最重，露地栽培以春茬黄瓜发病最重，保护地栽培则春季或冬季发病较重。该病主要由气流传播，具有侵染频繁、潜育期短、流行危害严重的特点，能在几日内导致植物全部死亡，俗称“跑马干”。也因在其发病后，黄瓜叶背出现大量紫褐色的霉状物，而称之为“黑毛病”。
由于黄瓜霜霉病已成为制约黄瓜生产的一个关键因素，生产上通常采用农业方法、培育抗病品种、生物防治、植物检疫和化学防治等不同的防治措施来减轻其危害。在诸多防治措施中，化学药剂的使用仍是控制黄瓜霜霉病危害的主要手段之一，在农业生产中发挥着重要作用。国内外许多研究单位和农化企业一直尝试创制和筛选对黄瓜霜霉病具有显著防治效果的新型杀菌剂。由于其防治的主要靶标菌黄瓜霜霉病菌为气流传播的专性寄生菌，国际杀菌剂抗性行动委员会(FRAC)认为该病原菌对杀菌剂具有潜在的高抗药性风险。因此，新型杀菌剂投入使用后必须采取严格的抗性监测和治理措施来避免和延缓抗药性的产生，延长杀菌剂的使用寿命。
研究稳定可靠、可重复性强的毒力测定方法，用来筛选对黄瓜霜霉病具有优异防效的杀菌剂及建立病原菌对药剂的敏感基线，监测田间病原菌对药剂的敏感性变化，是杀菌剂活性筛选和抗药性研究及治理的前提，是实现植物病害化学防治可持续发展的基础。
针对非专性寄生菌，一般采用离体毒力测定法进行药剂的筛选和田间病原菌对药剂敏感性的监测，即在实验室条件下进行的不依附于病原寄主的农药本身(原药)对靶标菌的抑菌作用的测定法，如传统毒力测定方法中的孢子萌发法和生长速率测定法等。但黄瓜霜霉病菌为专性寄生菌，其孢子萌发后菌丝主要在寄主细胞间隙扩展，不能在人工培养基上生长；同时病原菌菌株难于在离体条件下进行长期保存，且生产中用于黄瓜霜霉病害防治的几种杀菌剂对病原菌不同发育阶段的影响有所区别如氟吗啉和烯酰吗啉对黄瓜霜霉病菌的休止胞萌发、芽管伸长和菌丝扩展、孢囊梗形成有影响；霜脲氰对黄瓜霜霉病菌菌丝扩展、孢囊梗形成各阶段没有影响，而对休止胞萌发、芽管伸长有影响；代森锰锌对休止胞萌发、芽管伸长都有抑制作用，而对附着胞的产生、菌丝扩展和孢囊梗形成没有影响；腈嘧菌酯除对孢囊梗的产生、休止胞萌发没有影响外，对其它各阶段都有影响。因此传统的毒力测定方法如孢子萌发法和生长速率测定法难于检测这类药剂的真实抑菌作用。目前，一般采用活体植株法和叶盘漂浮法进行杀菌剂的毒力测定。活体植株法用于毒力测定，一般是在田间或温室自然发病的植株上进行，采用喷雾法进行不同梯度浓度的杀菌剂试验，一般7-10d喷药一次，共喷三次，调查喷药前后植株叶片的病斑面积，换算为病情指数，计算试验接种条件下各药剂处理的防病效果。并以防病效果数据转换成机率值为纵坐标，以药剂浓度对数为横坐标，作图并求其毒力回归式，计算出各药剂对病原菌的EC50，比较不同药剂的毒力及抑菌活性。该方法存在着测定周期长，需要大于40d时间；测定过程中影响因素较多，除药剂本身的毒力起作用外，其他各种条件均对药剂毒力的发挥产生影响，包括具体剂型，施药质量，作物生长情况及防治对象生育情况；试验可重复性较差，采用人工多点调查方法不可避免具有一定的误差，影响了方法的准确度和精密度；试验实施中因为涉及到温室盆栽或田间试验，工作量大、需要耗材较多等诸多弊端。活体植株法用于监测田间病原菌对药剂的敏感性变化，一般需要将采自田间的菌株人工接种至黄瓜植株上，待植株叶片发病后按照上述方法进行测定。
叶盘漂浮法是针对活体植株法中的弊端，而采用的一种改良的方法。即用打孔器将生长健康完好的黄瓜叶片制成直径为1.5cm的叶盘，在含系列浓度杀菌剂和清水对照的培养皿中(Φ9cm)分别漂浮5-10片叶盘，在每个叶盘上接种10μL的黄瓜霜霉病菌孢子悬浮液，保持悬浮状态，置于16-20℃条件下光照黑暗交替培养6-8d，检查每个叶盘的病情指数，计算防效，求其毒力回归式和EC50。
该方法虽然目前一些学者相互引用，但技术人员在实际测定中发现存在黄瓜叶龄不统一，病原菌接种体浓度不一致，漂浮液以水为溶剂，展着性和渗透性差，漂浮时间过长(达6-8d)，影响叶片正常的生理代谢，漂浮液易挥发导致处理浓度的改变等影响因素，而最终导致试验重复性和准确性较差，因此不同人员、不同批次的测定结果也没有可比性和引用价值，不能将叶盘漂浮法作为杀菌剂对黄瓜霜霉病菌毒力测定的一种标准方法。
国家农药检定部门及药剂研发部门迫切需要建立一种准确和有效的检测杀菌剂活性的方法，以确定和比较不同药剂对黄瓜霜霉病菌的抑菌效果和毒力，并为新型杀菌剂的筛选和田间抗性菌株的监测提供理论方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌毒力的方法。
本发明所提供的测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌毒力的方法，是在无菌条件下，用经消毒的黄瓜植株第3-5叶位上的健康离体叶片制成叶碟，将其分成若干组，分别于稀释为若干浓度的杀菌剂中浸泡1-2h，所述杀菌剂中添加有质量百分浓度相同的0.003-0.01％的吐温20和0.1-0.3％的甲醇；再将每个叶碟背面接种浓度为1.0×104-1.0×105个孢子囊/mL的黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液，然后将其在17-20℃黑暗条件下保湿培养20-28h，再于17-20℃、湿度RH大于80％、10-14h光暗交替条件下保湿培养5-7d，测量叶碟上的发病面积，计算防治效果和EC50值。
上述方法中，所述健康离体叶片优选为黄瓜植株第4叶位上的叶片；叶碟的尺寸为φ1.2-2.0cm，优选为φ1.5cm；所述杀菌剂中吐温20的含量优选为0.005％，甲醇的含量优选为0.1％；所述浸泡时间优选为1h；黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液的浓度优选为1.0×104个孢子囊/mL；每个叶碟背面滴加的孢子囊悬浮液的体积为10μL；背面滴加有黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液的叶碟的培养条件优选为先在19℃的黑暗条件下保湿培养24h，再于19℃、湿度RH大于80％、12h光暗交替条件下保湿培养5d。
浸泡过程中需经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的湿润。
接种方法为将叶盘上的药液吸干，叶背朝上置于培样皿内用相同药剂浓度润湿的吸水纸上，然后用液滴法将孢子囊悬浮液滴加于叶盘中央。
所述接种孢子悬浮液时所用的仪器可为5-40μL的移液枪。
本发明针对目前黄瓜霜霉病菌(专性寄生菌)菌株不能长期保存，采用的活体植株法测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌的毒力作用过程中存在的实验周期长，影响因素多，工作量大等弊端；针对叶盘漂浮法测定过程中存在的黄瓜叶龄/叶位和病原菌接种体浓度不确定，漂浮液以水为溶剂，展着性和渗透性差，在液体溶液中漂浮时间过长(达6-8天)，影响叶片正常的生理代谢，叶盘易黄花及腐烂，导致病斑面积调查中出现误差，漂浮液易挥发导致处理浓度的改变等影响试验重复性和准确性的问题。建立了稳定可靠、重复性好、精密度高的检测杀菌剂对黄瓜霜霉病菌毒力的测定方法，将其命名为叶碟保湿培养法，该方法测定周期约为5天；测定过程中供试药剂均为高含量的原药，不受施药方法和剂型的影响；原药借助表面展着剂及有机溶剂的定量添加增强了药液在叶碟上的展着和渗透，叶碟在药液中漂浮的时间缩短为1h，杜绝了因长时间在药液中悬浮造成的叶碟黄花现象；测定过程在离体叶碟上进行，是不依附于活体植株进行的农药本身(原药)对于靶标菌的抑菌作用的测定，不受植物生长情况的影响，方法的准确度和精密度高，平行性好，检测过程中耗费的试材量少，可准确、可靠的测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌的毒力作用和监测田间黄瓜霜霉病菌对杀菌剂敏感性的变化，为进一步的杀菌剂作用机制和抗药性研究及治理提供了技术支撑。本发明可作为一种新的具有标准特征的方法，用于测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌的毒力作用和监测田间黄瓜霜霉病菌对杀菌剂敏感性的变化，具有潜在的社会经济意义。
图1为用叶碟保湿培养法测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌的毒力图2为不同浓度的杀菌剂处理后叶碟的发病情况图3为黄瓜霜霉病菌对氟吗啉的敏感性分布图4为77株黄瓜霜霉病菌对氟吗啉的敏感性频率分布具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
供试药剂96％氟吗啉(flumorph)原药(沈阳化工研究院)；97％甲霜灵(metalaxyl)原药(新加坡利农私人有限公司)；95％腈嘧菌酯(azoxystrobin)悬浮剂(先正达中国投资有限公司)。
供试植物材料将感病黄瓜品种长春密刺栽培于φ15cm，高12cm的育苗钵内，置于玻璃温室中培养，待植株长到10叶期后采集相同叶位的叶片，用于黄瓜霜霉病菌的培养及毒力测定。
实施例1、叶碟保湿法测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌的毒力中各处理条件的选择1、叶碟保湿测定法中黄瓜叶龄的选择采集黄瓜植株的第3-10个叶位上的健康叶片，用无菌水清洗3次，然后分别将不同叶位上的叶片用φ15mm的打孔器制成叶碟，叶背朝上整齐的放置于用吸水纸保湿的φ150mm培养皿中，每皿50个叶碟(图1)，在每个叶碟中央接种10μL浓度为1×104孢子囊/mL黄瓜霜霉病菌孢子囊的悬浮液，并置于20℃，RH＞80％，12h光暗交替的生长间培养，7d后调查叶碟上的霉层面积，比较不同叶龄黄瓜叶碟上黄瓜霜霉病菌发病的严重度(试验重复3次)。结果如表1所示，表明不同叶位上的叶片对黄瓜霜霉病菌侵染有明显影响，第3、4、5和6叶位上叶片制成的叶碟之间发病面积没有显著差异，而第7、8、9、10叶位上叶片制成的叶碟发病面积明显降低，表明随着叶龄的增大，叶片对黄瓜霜霉病菌的侵入具有一定的抵抗能力。因此，选择第4叶位上的叶片进行药剂的敏感性测定，可降低由叶片之间的差异而导致的误差，也可以节省培养植物材料需要的时间。
表1 黄瓜叶片叶龄对黄瓜霜霉病菌侵染的影响
注a3代表植株完全展开的第一片叶，随着数值增大，叶龄也相应变大。b三次重复之间的标准误。
2、叶碟保湿测定法中接种体浓度的选择采集黄瓜植株第4位叶片，按步骤1的方法制成叶碟，每50个叶碟一个处理，用液滴法于每个叶碟背面接种10μL浓度分别为1×103，1×104和1×105个孢子囊/mL的悬浮液，然后保湿培养，7d后测量叶碟的发病面积，比较不同接种体浓度对发病的影响(试验重复3次)。结果如图2所示，对发病面积进行统计，统计结果如表2所示，接种浓度为1×104和1×105个孢子囊/mL的悬浮液的叶碟发病面积之间没有显著差异，而接种浓度为1×103个孢子囊/mL的叶碟发病严重度明显降低，表面接种体浓度也会对发病的严重程度产生影响，因此，选择1×104个孢子囊/mL的浓度进行接种。
表2 接种体浓度对黄瓜霜霉病菌侵染的影响
3、叶碟保湿测定法中表面展着剂及溶剂的选择测定0.005％的吐温20和0.1％的甲醇溶剂对测定结果的影响，以无菌水为对照。采集黄瓜植株第4位叶片，按步骤1的方法制成叶碟，每50个叶碟一个处理，分别于100mL无菌水，0.005％吐温20溶液，0.1％甲醇溶液及同时含有0.005％吐温20和0.1％甲醇的溶液里浸泡1h，浸泡过程中经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的润湿。然后按步骤1的方法进行接菌、培养和数据处理，比较表面展着剂和有机溶剂对发病的影响，结果如表3所示，0.005％的吐温20和0.1％的甲醇对试验结果均没有明显影响，表明可采用浓度低于0.005％的吐温20作为表面展着剂，0.1％甲醇(methanol)作为有机溶剂进行原药的溶解，且将药剂稀释液中甲醇的含量控制在≤0.1％范围内。
表3表面展着剂(Tween 20)和有机溶剂(甲醇)对黄瓜霜霉病菌侵染的影响
4、叶碟保湿测定法的精密度试验随机选用6个黄瓜霜霉病菌菌株，采用叶碟保湿法进行杀菌剂氟吗啉对其毒力测定，具体方法为取黄瓜植株上第4叶位的健康离体叶片，制成φ15mm的黄瓜叶碟。随机混匀，分成7组，每组50个叶碟，分别于系列浓度(0.00、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70和1.00μg/mL)的氟吗啉药液中浸泡1h。浸泡过程中经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的湿润。每个处理均含有0.005％的吐温20和0.1％的甲醇。浸泡结束后将叶碟上的药液吸干，叶背朝上置于培样皿内用相同药剂浓度润湿的吸水纸上，然后用液滴法接种浓度为每毫升含有104个孢子囊的悬浮液10μL于叶碟中央。将接种后的叶碟放置于19℃、RH＞80％、12h光暗交替的条件下培养，5d后测量叶碟上的发病面积，计算防治效果和EC50。每个菌株重复5次，计算药剂对各个菌株的EC50及每个菌株5次重复间的变异系数，通过变异系数确定试验方法的精密度。6个供试菌株，每个菌株5次重复的精密度测定结果如表4所示，5次重复间的变异系数在1.4-5.3％之间，均表现出了较高的重复性。进一步证明叶碟保湿测定法具有很好的重复性和精密度，该方法适用于进行杀菌剂氟吗啉对专性寄生菌黄瓜霜霉病菌毒力的测定。
表4 叶碟保湿测定法用于氟吗啉敏对黄瓜霜霉病菌毒力测定的重复性
5、杀菌剂之间的交互抗药性试验采用上述精密度试验中的测定方法，分别选用6株甲霜灵和腈嘧菌酯抗药性菌株进行氟吗啉、甲霜灵和腈嘧菌酯之间的交互抗药性试验，结果如表5所示，甲霜灵和腈嘧菌酯对甲霜灵抗药性菌株和腈嘧菌酯抗药性菌株的EC50分别在63.10-87.10μg/mL和2.82-7.33μg/mL之间，而氟吗啉对所有菌株的EC50均在0.08-0.18μg/mL之间，统计分析表明氟吗啉和甲霜灵(r＝0.000685，n＝6)及氟吗啉和腈嘧菌酯(r＝0.220137，n＝6)之间的相关性均很低，证明氟吗啉和甲霜灵及腈嘧菌酯之间不存在交互抗药性。
表5 6株甲霜灵抗药性菌株和6株腈嘧菌酯抗药性菌株对氟吗啉、甲霜灵和腈嘧菌酯的敏感性
实施例2、叶碟保湿法测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌的毒力(田间抗药性菌株的监测供试药剂96％氟吗啉(flumorph)原药(沈阳化工研究院)。
供试植株将感病黄瓜品种长春密刺栽培于φ15cm，高12cm的育苗钵内，置于玻璃温室中培养，待植株长到6叶期后采集第4叶位的叶片，用于黄瓜霜霉病菌的培养及毒力测定。
供试菌株从北京郊区的平谷东高村崔庄子科技园、怀柔王化村西菜地、延庆永宁镇孔化营村、昌平南郝庄苹园及中国农业大学昌平实验站、房山豆店村、海淀区西北旺村及河北峦平、内蒙等地区未施用过氟吗啉及同类药剂烯酰吗啉的黄瓜栽培地采集黄瓜霜霉病样本，分离获得77株敏感菌株，按照实施例1中的方法对菌株进行继代培养和低温冷藏长久保存。
按照实施例1中的叶碟保湿法测定黄瓜霜霉病菌对杀菌剂的敏感性。具体方法为采集黄瓜植株第4叶位叶片，制备φ15mm的叶碟，随机混匀，分成7组，每组50个叶碟，分别于0、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70、1.000μg/mL氟吗啉溶液中浸泡1h浸泡过程中经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的湿润。每个处理均含有0.005％的吐温20和0.1％的甲醇。浸泡结束后将叶碟上的药液吸干，叶背朝上置于用相同药剂浓度润湿的吸水纸上，然后用液滴法接种浓度为每毫升含有104个孢子囊的悬浮液10μL于叶碟中央。将接种后的叶碟放置于19℃、RH＞80％、12h光暗交替的条件下培养，7d后测量叶碟上的发病面积，计算防治效果和EC50。用该法测定从田间采集的77个菌株对氟吗啉的敏感性，建立敏感基线，测定如图3所示，其中EC50最大的为0.2647μg/mL，最小的为0.0213μg/mL，相差12.43倍，平均EC50＝(0.1360±0.0487)μg/mL。从77株黄瓜霜霉病菌对氟吗啉的敏感性频率分布图(图4)可以看出，77个菌株对氟吗啉的敏感性分布呈连续的单峰曲线，没有出现敏感性下降的抗药病原亚群，因此可用该单峰曲线作为将来进行田间抗药性监测的敏感基线。
权利要求
1.一种测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌毒力的方法，是在无菌条件下，用经消毒的黄瓜植株第3-5叶位上的健康离体叶片制成叶碟，将其分成若干组，分别于稀释为若干浓度的杀菌剂中浸泡1-2h，所述杀菌剂中添加有质量百分浓度相同的0.003-0.01％的吐温20和0.1-0.3％的甲醇；再将每个叶碟背面接种浓度为1.0×104-1.0×105个孢子囊/mL的黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液，然后将其在17-20℃黑暗条件下保湿培养20-28h，再于17-20℃、湿度RH大于80％、10-14h光暗交替条件下保湿培养5-7d，测量叶碟上的发病面积，计算防治效果和EC50值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述健康离体叶片为黄瓜植株第4叶位上的叶片。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述杀菌剂中吐温20的含量为0.005％，甲醇的含量为0.1％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液的浓度为1.0×104个孢子囊/mL。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述叶碟的尺寸为φ1.2-2.0cm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述叶碟的尺寸为φ1.5cm；每个叶碟背面滴加的孢子囊悬浮液的体积为10μL。
7.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述背面滴加有黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液的叶碟的培养条件为先在19℃的黑暗条件下保湿培养24h，再于19℃、湿度RH大于80％、12h光暗交替条件下保湿培养7天。
8.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述浸泡过程中要不断搅动。
全文摘要
本发明公开了一种测定杀菌剂对黄瓜霜霉病菌毒力的方法。该方法是在无菌条件下，用经消毒的黄瓜植株第3－5叶位上的健康离体叶片制成叶碟，将其分成若干组，分别于稀释为若干浓度的杀菌剂中浸泡1－2h，所述杀菌剂中添加有质量百分浓度相同的0.003－0.01％的吐温20和0.1－0.3％的甲醇；再将每个叶碟背面接种浓度为1.0×10
文档编号G01N33/00GK1687774SQ20051007097
公开日2005年10月26日 申请日期2005年5月19日 优先权日2005年5月19日
发明者刘西莉, 朱书生, 李健强, 顾宝根, 袁善奎, 刘亮, 王岩 申请人:中国农业大学