专利名称：西红花苷指纹图谱分析方法
技术领域：
本发明涉及一种中药及其提取物的分析方法，特别是采用高效液相色谱法对西红花苷进行指纹图谱分析的方法。
背景技术：
西红花苷为中药西红花药材的主要成分，在西红花提取物和注射用西红花苷中，其主要化合物包括西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3、西红花苷-4，它们具体的化学结构式和分子式如下
西红花苷-1 分子式 C44H64O24 西红花苷-2 分子式 C38H54O19 西红花苷-3 分子式 C30H42O14 西红花苷-4 分子式 C26H34O8现有技术中记载西红花苷具有活血化瘀、散开结的作用；用于中风病血瘀证(脑脉痹塞)等。
现有技术的指纹图谱实验方法是根据中国药典2000年版一部附录VID所规定的高效液相色谱法实验来进行的，但是中国药典2000年版一部附录VID所规定的高效液相色谱法只是一个通则，并没有对那一个具体的品种描述分析方法。
一般规定是1、色谱条件和系统适用性试验用反相色谱柱作填充剂；有机相-缓冲溶液为流动相，流动相应过滤、脱气处理，检测波长为440nm。调整流速使西红花苷-1峰的保留时间为2.8-3.3分钟，理论板数以西红花苷-1峰计算应不低于1500。
2、技术参数共有峰的峰号及相对保留时间1(0.67-0.72)2(0.80-0.85)；3(S参照峰-西红花苷-11.0)，4(1.1-1.2)，5(西红花苷-21.4-1.6)，6(西红花苷-42.4-2.6)，7(西红花苷-36.4-7.0)，8(7.4-8.1)。峰面积比值5∶S＝(0.40-0.75)。
3、参照物溶液的制备取西红花苷-1对照品约5mg，精密称定，置25ml的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述西红花苷-1对照品溶液2.0ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得参照物溶液。
4、供试品溶液的制备西红花药材取本品干燥后的细粉约20mg，置索氏提取器中，加甲醇50ml，加热回流至提取液无色，放冷，用甲醇洗涤提取器，合并提取液和洗涤液置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。西红花苷取本品约20mg，置25ml的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。取此液1.0ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
注射用西红花苷取本品2瓶，用流动相溶解并稀释至置50ml的量瓶中。取此液1.0ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
5、测定法分别精密吸取上述参照物溶液和供试品溶液各10ul，分别注入液相色谱仪，记录1小时色谱图，计算各色谱峰的保留时间和峰面积，对照共有峰的峰号及相对保留时间，应符合规定。
根据国家食品药品监督管理局对中药注射剂指纹图谱研究的技术要求，对西红花苷及其药材和注射剂的指纹图谱进行了分析时，由于西红花苷-3分子结构中存在一分子的羧酸(见上式)，在有机相-水中，会电离出H+或与H+结合形成羧酸，这一动态平衡是不稳定的，因此致使西红花苷-3在指纹图谱分析时，每次进样的保留时间是不稳定的，飘移不定，重复性很差，不符合指纹图谱分析的要求。
发明内容
为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种改进的中药及其提取物的指纹图谱分析方法，特别是对西红花苷进行指纹图谱分析的方法。
为了完成上述的发明目的，本发明采用以下技术方案一种中药西红花苷成分及其提取物的指纹图谱的分析方法，包括采用色谱柱或者反相色谱柱高效液相色谱法，有机相-缓冲溶液为流动相，其特征在于色谱柱的填料选自C1、C3、C6、C8、C18、CN、NH2，所述的有机相-缓冲溶液为pH值为1.5-8.5的有机相-盐或酸类缓冲溶液，其中有机相的体积比为5％-80％，优选的是有机相的体积比为10％-60％。
所述的有机相包括四氢呋喃、甲醇、乙腈。
所述的有机相-缓冲溶液优选的pH值为2.8-8.0。
本发明的分析方法在于找到采用有机相-缓冲溶液作流动相，对于含有羧酸结构的西红花苷类中药及其提取物的指纹图谱的分析方法。具体的是色谱柱的填料选自C1、C3、C6、C8、C18、CN、NH2，流动相的组成为有机相-缓冲溶液，其中的pH值为1.5-8.5，有机相的比例为5％-80％(v/v)，缓冲溶液的比例为20％-80％(v/v)。
本发明采用的是有机相-缓冲溶液为流动相。若不采用有机相-缓冲溶液为流动相的话，而采用有机相-水为流动相，则含有羧酸的西红花苷-3，在分析时是不稳定的，因此致使每次的保留时间是不稳定的，飘移不定，重复性差，不符合指纹图谱分析的要求。
本发明通过在水溶液中加入各种盐类与对应的酸或多元酸形成缓冲溶液时(盐类的浓度为0.005mol/L-0.2mol/L、缓冲溶液pH值范围为2.0-8.0)，西红花苷-3的保留时间稳定，西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-4的保留时间基本不变，化合物的性质稳定，符合指纹图谱分析的要求。
本发明的测试样品中主要成分为西红花苷-1，其性质稳定，相对含量在50％以上，选为参照物。
图1是西红花苷的指纹图谱。
具体实施例方式
以下将进一步结合实施例来详细描述具体实施方案，以下的实施例并非限定本发明的方案。
经过以下实施例测定11个样品分别得到西红花苷技术数据中(见表1)以及附图1。
实施例1仪器Agilent 1100高压液相色谱仪(包括G1312A BinPump、G1313AALS、G1314A VWD)，Agilent色谱工作站。
采用本发明的方法对样品1进行测定时，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Shimadzu VP-ODS 150mm×4.6mm，5μm)；甲醇-0.02mol/L的醋酸铵溶液(用醋酸调节pH4.0)(55∶45)为流动相，检测波长为440nm。调整流速使西红花苷-1峰的保留时间2.9-3.3分钟，理论板数以西红花苷-1峰计算应不低于1500。
实施例2仪器Agilent 1100高压液相色谱仪(包括G1312A BinPump、G1313AALS、G1315A DAD)，Agilent色谱工作站。
采用本发明的方法对样品2进行测定时，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil-ODS 200mm×4.6mm，5μm)；甲醇-乙腈-0.2mol/L的醋酸铵溶液(用醋酸调节pH4.5)(25∶5∶70)为流动相，检测波长为440nm。调整流速使西红花苷-1峰的保留时间2.8-3.3分钟，理论板数以西红花苷-1峰计算应不低于1500。
实施例3仪器Agilent 1100高压液相色谱仪(包括G1312A BinPump、G1313AALS、G1314A VWD)，Agilent色谱工作站。
采用本发明的方法对样品3进行测定时，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(NOVPAK-ODS 100mm×3.9mm，5μm)；四氢呋喃-0.05mol/L的醋酸钠溶液(用醋酸调节pH2.8)(20∶80)为流动相，检测波长为440nm。调整流速使西红花苷-1峰的保留时间2.8-3.3分钟，理论板数以西红花苷-1峰计算应不低于1500。
实施例4仪器Hi-Tech P 4000 Pump系统，Model 525可编程紫外检测器，Chromtek色谱工作站。
采用本发明的方法对样品4进行测定时，用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZORBAX-C8 200mm×4.6mm，5μm)；甲醇-水溶液(用磷酸调节pH4.0)(60∶40)为流动相，检测波长为440nm。调整流速使西红花苷-1峰的保留时间2.8-3.3分钟，理论板数以西红花苷-1峰计算应不低于1500。
实施例5仪器Agilent 1100高压液相色谱仪(包括G1312A BinPump、G1313AALS、G1314A VWD)，Agilent色谱工作站。
采用本发明的方法对样品5进行测定时，用C3烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Chromasil-C3 200mm×4.6mm，5μm)；甲醇-0.02mol/L的硫酸铵溶液(用硫酸调节pH7.0)(55∶45)为流动相，检测波长为440nm。调整流速使西红花苷-1峰的保留时间2.8-3.3分钟，理论板数以西红花苷-1峰计算应不低于1500。
实施例6仪器Alltech 426 HPLC Pump系统Alltech uvis 200可变波长紫外检测器，Chromtek色谱工作站。
采用本发明的方法对样品6进行测定时，用C1烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Chromasil-C1 200mm×4.6mm，5μm)；甲醇-0.1mol/L的醋酸钠溶液(用醋酸调节pH6.0)(40∶60)为流动相，检测波长为440nm。调整流速使西红花苷-1峰的保留时间2.8-3.3分钟，理论板数以西红花苷-1峰计算应不低于1500。
实施例7仪器Agilent 1100高压液相色谱仪(包括G1312A BinPump、G1313AALS、G1314A VWD)，Agilent色谱工作站。
采用本发明的方法对样品7进行测定时，用氨基硅烷键合硅胶为填充剂(HYPER-NH2250mm×4.6mm，5μm)；乙腈-0.03mol/L的枸橼酸钠溶液(用枸橼酸调节pH5.0)(30∶70)为流动相，检测波长为440nm。调整流速使西红花苷-1峰的保留时间2.8-3.3分钟，理论板数以西红花苷-1峰计算应不低于1500。
实施例8仪器Agilent 1100高压液相色谱仪(包括G1312A BinPump、G1313AALS、G1314A VWD)，Agilent色谱工作站。
采用本发明的方法对样品8进行测定时，用氰基硅烷键合硅胶为填充剂(ALLTIMA-CN 200mm×4.6mm，5μm)；甲醇-0.01mol/L的醋酸三乙胺溶液(用醋酸调节pH8.0)(52∶48)为流动相，检测波长为440nm。调整流速使西红花苷-1峰的保留时间2.8-3.3分钟，理论板数以西红花苷-1峰计算应不低于1500。
实施例9采用同实施例1相同的方法对样品9进行测定，得到的结果见表1。
实施例10采用实施例2相同的方法对样品10进行测定，得到的结果见表1。
实施例11采用实施例4相同的方法对样品11进行测定，得到的结果见表1。
表权利要求
1.中药西红花苷成分及其提取物的指纹图谱的分析方法，包括采用色谱柱或者反相色谱柱高效液相色谱法，有机相-缓冲溶液为流动相，其特征在于色谱柱的填料选自C1、C3、C6、C8、C18、CN、NH2，所述的有机相-缓冲溶液为pH值为1.5-8.5的有机相-盐或酸类缓冲溶液，其中有机相的体积比为5％-80％。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的有机相包括四氢呋哺、甲醇、乙腈。
3.根据权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于有机相的体积比为10％-60％。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的有机相-缓冲溶液的pH值为2.8-8.0。
全文摘要
本发明披露在反相色谱系统中加入缓冲溶液对西红花苷进行了指纹图谱分析的方法。西红花苷－1、西红花苷－2、西红花苷－4在流动相中的化学性质稳定，特别是西红花苷－3的定性准确，保留时间稳定，符合指纹图谱分析的要求。
文档编号G01N30/02GK1880955SQ20051007700
公开日2006年12月20日 申请日期2005年6月13日 优先权日2005年6月13日
发明者李语如 申请人:江苏恒瑞医药股份有限公司