专利名称：检测谷丙转氨酶的生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于快速检测谷丙转氨酶的生物传感器及其批量生产的制作方法以及检测技术。
背景技术：
谷丙转氨酶(GPT)是体内活力最强的转氨酶之一，它广泛分布在人体的各种组织器官内，尤以肝脏含量最多，是心脏、肌肉、肾脏的3倍，将近血清的3千倍。在肝脏等脏器受损时，细胞内GPT释入血液，使血液内GPT的活力增高。所以血液中GPT升高几乎总是由肝病引起的，血液中的GPT通常被用作判断肝功能是否正常的重要指标。目前，血液中的GPT主要在大型血液生化分析仪上进行，由于需要使用特殊装置，测定所需要的血液较多，时间较长，价格昂贵，只适合在大型医院进行。
利用酶的特异性识别待测物而制作成可供家庭和医院中一次性使用的快速生物传感器，具有批量制作工艺简单，成本低廉，测试时间短，操作简便等优点，因此特别适合工业化的大规模生产。目前，这种生物传感器已经商品化，其中用于血液中葡萄糖的检测最为成熟。例如，在丝网印刷电极上固定包括葡萄糖氧化酶在内的一些干试剂被血液溶解后产生响应信号，通过检测仪表检测即可以获得血液中葡萄糖的浓度，但是丝网印刷技术生产的生物传感器，其工艺具有一定的局限性，包括原料的不确定性(如碳、银浆，网板等)，生产效率偏低，生产过程中容易受到污染等，因此，很可能影响到产品的一致性和准确性，同时也制约了生产规模的扩大。而且，由于葡萄糖在血液中的浓度相对比较高，一般在几个毫摩尔到几十个毫摩尔，因此，响应电流相对比较大，测试也较为容易。
目前，适合于家庭保健、运动员的测试、血液安全筛查等检测谷丙转氨酶的生物传感器具有广阔的应用市场。由于血液中的谷丙转氨酶的浓度相对较低，一般在几十个单位，基于上述技术的生物传感器存在响应电流小(pA-nA)，响应时间较长(10分钟，甚至更长)，灵敏度较低等缺点。小电流检测起来比较困难，特别是采用便携式仪表，很容易受到外界的干扰，从而影响到检测的准确性和稳定性。由于响应时间比较长，血液的凝结也会给测试带来一定的困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够快速定量测定血液中的谷丙转氨酶(GPT)浓度的生物传感器。
为达到上述目的，本发明的技术解决方案是提供一种检测谷丙转氨酶的生物传感器，用于快速检测血液中的谷丙转氨酶，该传感器是用微电子机械加工工艺制作的；其在一种绝缘基片上形成金属平面薄膜电极，平面薄膜电极的一端为插入检测仪器的接入端，在平面薄膜电极的另一端上粘贴带有图案的隔离片，隔离片上有微反应沟道，微反应沟道内绝缘基片上的金属平面薄膜电极构成传感器电极系统；微反应沟道里电极系统的工作电极上吸附一层用于反应的干试剂；微反应沟道上方粘贴另外一层绝缘基片，使微反应沟道形成一个微反应腔体，另外一层绝缘基片相对于沟道一面具有亲水性物质，因此样品很容易进入微反应腔体。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述绝缘基片，是从聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚乙烯，聚乙烯对苯二甲酸盐的组成中任选一种聚合物制成，这些材料是片材或者是卷材。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述绝缘基片上的金属平面薄膜电极，是采用溅射、蒸镀的金属薄膜工艺制作。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述金属平面薄膜电极，其材料为金、银、铂、钯中任选一种贵金属构成。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述隔离片，是从聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚乙烯，聚乙烯对苯二甲酸盐的组成中任选一种聚合物制成，这些材料是片材或者是卷材，且材料双面带胶贴片；隔离片上的图案是通过冲压或雕刻的方式获得。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述全血丙氨酸转氨酶检测试条的反应试剂，由缓冲液、电子媒介体、生物酶、表面活性剂、亲水高分子和用于保持酶活性的稳定剂组成。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述电子媒介体是氧化还原聚合物，铁氰化钾、对苯醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物、beta-萘酚-4-磺酸钾、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述亲水高分子是羧甲基纤维素(CMC)，羟基乙基纤维素(HEC)，羟基丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素和乙基纤维素、乙基羟基乙基纤维素、氨基甲基乙基纤维素、聚乙烯基毗咯烷酮、聚乙烯酸、聚赖氨酸和聚氨基酸、聚苯乙烯碘酸、乳胶、丙烯酸或其盐、甲基丙烯酸或其盐、淀粉或其衍生物、马来酐或其盐类、明胶、琼脂糖凝胶、树胶。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述的GPT反应试剂，是L-丙氨酸或α-酮戊二酸盐，为通过转氨酶GPT的酶促反应生成谷氨酸或丙酮酸。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述生物酶是谷氨酸氧化酶(GLOD)或丙酮酸氧化酶(PyOD)中的一种。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述生物酶，为每平方厘米0.01～200U活性单位。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述微反应沟道上方粘贴另外一层绝缘基片，是在其相对于沟道一面涂附一层亲水层。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其可以用于全血、血清、尿液的流体介质中的谷丙转氨酶的快速测定。
所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其所述用于反应的干试剂，被溶液重新溶解后，其各组分的浓度为L-丙氨酸、浓度为0.1～0.5M；α-酮戊二酸盐、浓度为1.0～20.0mM；谷氨酸酶氧化酶、浓度为0.0～200U；海藻酸钠、浓度为1.0～10mM；羧甲基纤维素、浓度为1.0～20mg。
与现有技术相比，本发明检测谷丙转氨酶的生物传感器试条的优点在于，利用金属薄膜沉积工艺制作具有精确三维结构的贵金属电极不仅确保了电极表面的一致性，而且使生产流程进一步简化，提高了生产效率，降低了生产成本。通过在电极的表面修饰一层，具有氧化还原性质的聚合物薄膜，一方面可以降低背景电流，另一方面，也可以作为电子媒介体传递电子，降低试条的工作电压，最大限度地消除了一些电化学活性物质如尿酸、抗坏血酸的干扰。而且这种聚合物具有很高的电子传递效率，从而增大了电流响应信号，使得检测血液中较低GPT的浓度成为可能，同时也降低了后续检测电路的难度，提高检测仪表的可靠性。
图1为本发明检测谷丙转氨酶的生物传感器的结构分解示意图；图2为本发明检测谷丙转氨酶的生物传感器的局部剖视图；图3为本发明传感器对缓冲溶液中的GPT响应的校准曲线；图4为本发明传感器对血清中的GPT响应曲线。
具体实施例方式
本发明的反应原理
从上述反应式(1)中，血液中的谷丙转氨酶(GPT) 催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸盐反应生成丙酮酸和L-谷氨酸。反应式(2)中L-谷氨酸在谷氨酸氧化酶的催化下产生过氧化氢。反应式(3)中丙酮酸在丙酮酸氧化酶的催化下也可以产生过氧化氢。反应式(4)中过氧化氢将电极表面固定的过氧化物酶(HRP)氧化，被氧化的HRP又被聚合物膜中的金属锇重新还原，被氧化的锇在电极上获得电子被还原，随之产生的电流正比过氧化氢的浓度，因此，可以通过检测反应式(1)中生成的丙酮酸或L-谷氨酸的经过氧化生成的过氧化氢的浓度即可以测定GPT的浓度。不过，丙酮酸氧化时需要额外的试剂如TPP和Mg2+，且丙酮酸氧化酶没有谷氨酸氧化酶稳定。
本发明采用了微电子机械(MEMS)加工工艺，批量制作检测谷丙转氨酶的生物传感器。
参照附图可以很好地理解本发明的优选实施例。优选实施例只是为了说明的技术内容，而不是对本发明的限制。
实施例一如图1和图2所示，本发明的检测谷丙转氨酶的生物传感器，包括绝缘基片10，为0.5mm厚的聚碳酸酯片，在该基片10上依靠静电力粘贴一层保护性塑料薄膜，利用一台高精度刻膜机雕刻出所需要的薄膜电极的遮蔽掩膜的图形，通过金属薄膜沉积工艺，在此基片10上沉积出金薄膜，厚度约为100nm，去掉遮蔽掩膜即可形成金属平面薄膜电极，薄膜电极的一端作为插入检测仪器的接入端接入端7、接入端8和接入端9，在另一端的电极表面上粘贴一个厚度为0.125mm隔离片4，隔离片4上刻有一个反应沟道5(4.0mm×8.0mm)，在反应沟道5里的电极系统分别为参比电极1、工作电极2和对电极3，面积均为2.0mm×2.0mm。在工作电极2表面修饰氧化还原聚合物(Redox Polymer，BAS)后，再加入反应试剂，干燥后形成一层干试剂层12。
干试剂层12含有谷氨酸酶氧化酶、用于酶活性保持的稳定剂和亲水高分子等物质。具体是在1.0ml的pH值为7.4的0.01M磷酸氢二钠一磷酸二氢钠的缓冲液中含有0.1％的曲拉通(TX-100)，2单位的谷氨酸酶氧化酶，10mM海藻酸钠，10mg羧甲基纤维素(CMC)溶解制成的混合溶液，将这种混合溶液滴在图1所示的电极系统的反应沟道5里，在35℃的恒温干燥箱中干燥十分钟。
待反应试剂干燥后，再在反应沟道5上粘贴一层一面具有亲水性层的绝缘基片6形成一个两端均敞口的类似毛细管的微腔体11，反应在微腔体11内完成。当干燥的反应试剂被溶液重新溶解后，其各组分的浓度如表1所示表1、试剂组分配方
实施例二在0.5ml的离心管中加入18μl的谷丙转氨酶(GPT)反应试剂。试剂中含有pH值为7.4的0.01M磷酸氢二钠一磷酸二氢钠的缓冲液中含有0.1％的曲拉通(TX-100)，2U/ml的谷氨酸酶氧化酶，10mM海藻酸钠，10mg羧甲基纤维素(CMC)溶解制成的混合溶液。再加入2μl不同浓度的谷丙转氨酶(GPT)溶液。待反应2分钟后，将离心管里的溶液滴加到传感器的反应沟道5里的电极上，在工作电极2和参比电极1两端加上0.0V电压，60秒后读取反应的电流。每个GPT浓度用不同的传感器测定三次。
传感器采用上述制作方法，但是没有加入反应试剂。实验结果如图3，在浓度为20～1000U/l的GPT，响应信号与浓度有线性关系，相关系数为0.99。
实施例三在0.5ml的离心管中加入20μl的谷丙转氨酶(GPT)反应试剂。试剂中含有pH值为7.4的0.01M磷酸氢二钠一磷酸二氢钠的缓冲液中含有0.1％的曲拉通(TX-100)，2U/ml的谷氨酸酶氧化酶，10mM海藻酸钠，10mg羧甲基纤维素(CMC)溶解制成的混合溶液。在35℃的恒温干燥箱中干燥24小时。取人血清样品20μl加入含有干试剂的离心管中，充分搅拌，反应2分钟后，将离心管里的溶液滴加到传感器的反应沟道5里的电极上，在工作电极2和参比电极1两端加上0.0V电压，60秒后读取反应的电流。响应曲线如图4。3U/l的GPT响应电流为39.8nA，而112U/l的GPT响应电流为104.9nA，由此得出，传感器可以用来检测人血清中的谷丙转氨酶(GPT)浓度。
权利要求
1.一种检测谷丙转氨酶的生物传感器，用于快速检测血液中的谷丙转氨酶，该传感器是用微电子机械加工工艺制作的；其特征在于，在一种绝缘基片上形成金属平面薄膜电极，平面薄膜电极的一端为插入检测仪器的接入端，在平面薄膜电极的另一端上粘贴带有图案的隔离片，隔离片上有微反应沟道，微反应沟道内绝缘基片上的金属平面薄膜电极构成传感器电极系统；微反应沟道里电极系统的工作电极上吸附一层用于反应的干试剂；微反应沟道上方粘贴另外一层绝缘基片，使微反应沟道形成一个微反应腔体，另外一层绝缘基片相对于沟道一面具有亲水性物质，因此样品很容易进入微反应腔体。
2.如权利要求1所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述绝缘基片，是从聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚乙烯，聚乙烯对苯二甲酸盐的组成中任选一种聚合物制成，这些材料是片材或者是卷材。
3.如权利要求1所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述绝缘基片上的金属平面薄膜电极，是采用溅射、蒸镀的金属薄膜工艺制作。
4.如权利要求1或3所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述金属平面薄膜电极，其材料为金、银、铂、钯中任选一种贵金属构成。
5.如权利要求1所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述隔离片，是从聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚乙烯，聚乙烯对苯二甲酸盐的组成中任选一种聚合物制成，这些材料是片材或者是卷材，且材料双面带胶贴片；隔离片上的图案是通过冲压或雕刻的方式获得。
6.如权利要求1所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述用于反应的干试剂，由缓冲液、电子媒介体、生物酶、GPT反应试剂、表面活性剂、亲水高分子和用于保持酶活性的稳定剂组成。
7.如权利要求6所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述电子媒介体是氧化还原聚合物，铁氰化钾、对苯醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物、beta-萘酚-4-磺酸钾、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物。
8.如权利要求6所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述亲水高分子是羧甲基纤维素，羟基乙基纤维素，羟基丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、乙基羟基乙基纤维素、氨基甲基乙基纤维素、聚乙烯基毗咯烷酮、聚乙烯酸、聚赖氨酸和聚氨基酸、聚苯乙烯碘酸、乳胶、丙烯酸或其盐、甲基丙烯酸或其盐、淀粉或其衍生物、马来酐或其盐类、明胶、琼脂糖凝胶、树胶。
9.如权利要求6所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述的GPT反应试剂，是L-丙氨酸或α-酮戊二酸盐，为通过转氨酶GPT的酶促反应生成谷氨酸或丙酮酸。
10.如权利要求6所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述生物酶是谷氨酸氧化酶或丙酮酸氧化酶中的一种。
11.如权利要求6或10所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述生物酶，为每平方厘米0.01～200U活性单位。
12.如权利要求1所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述微反应沟道上方粘贴另外一层绝缘基片，是在其相对于沟道一面涂附一层亲水层。
13.如权利要求1所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，可以用于全血、血清、尿液的流体介质中的谷丙转氨酶的快速测定。
14.如权利要求1所述的检测谷丙转氨酶的生物传感器，其特征在于，所述用于反应的干试剂，被溶液重新溶解后，其各组分的浓度为L-丙氨酸、浓度为0.1～0.5M；α-酮戊二酸盐、浓度为1.0～20.0mM；谷氨酸酶氧化酶、浓度为0.0～200U；海藻酸钠、浓度为1.0～10mM；羧甲基纤维素、浓度为1.0～20mg。
全文摘要
本发明是一种检测谷丙转氨酶的生物传感器，涉及一种用于快速检测谷丙转氨酶GPT(glutamate－pyruvate transaminase)又称丙氨酸转氨酶ALT(alanine aminotransferas)的生物传感器。本发明的生物传感器采用微电子机械(MEMS)加工工艺生产金属薄膜电极，以及在薄膜电极上通过在电极的表面修饰一层具有氧化还原性质的聚合物薄膜作为电子媒介体，在酶与电极表面间传递电子。本发明的生物传感器响应时间短，灵敏度高，可以用于流体介质中如全血、血清、尿液等的谷丙转氨酶的快速测定。
文档编号G01N33/50GK1900305SQ20051008529
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者李华清, 蔡新霞, 崔大付, 刘春秀, 姜利英, 郭宗慧 申请人:中国科学院电子学研究所