专利名称：用于严重急性呼吸综合征诊断的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及与严重急性呼吸系统综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)相关的蛋白质和蛋白质同种型(isoform)的鉴定，以及它们在SARS的筛选、诊断、预后、治疗和药物开发方面的用途。
背景技术：
SARS是2002年底爆发的人类传染性疾病，又称非典型肺炎，经确认由一种新型的冠状病毒SARS-CoV引起，其传播迅速、感染性强、难以预料的临床进展和高死亡率对全球公共卫生造成严重威胁。所以及时的诊断、有效的治疗该疾病对于减小其危害具有重要意义。
无论从临床表现还是常规的检验项目都很难将早期SARS与一般肺炎区分开，所以尝试新的检测方法来解决。蛋白质组作为新兴的研究技术，针对直接执行生理功能的蛋白质进行系统分析，极大地促进了疾病相关研究。已有报道，Kang X.等人利用SELDI-TOF对健康、感冒、肺炎、早期SARS病人血清进行检测分析，找到SARS特异的蛋白质指纹数据。Chen J.等人利用双向电泳对健康与早期SARS血清进行比较，结合临床常规检测指标，以期对SARS进行早期鉴别。这些报道都说明，早期SARS病人的血清蛋白质水平确实发生了特异的变化，所以可以追踪在进展期与恢复期SARS病人血清蛋白质水平变化，了解疾病进程。临床上SARS的诊断和预后主要依据于医生经验对病人的临床表现进行评估，但SARS的进展常常难以预料，所以结合检验手段来诊断以及评估预后是必要的。这些说明在SARS的诊断中需要鉴定血清标志物。
发明内容
本发明提供了用于SARS的筛选、诊断、预后、以及用于监测SARS治疗有效性和用于药物开发的方法和组合物。
发明的第一方面提供了用于SARS诊断的方法，包括通过双向电泳(two-dimentional electrophoresis，2DE)对血浆或血清样品进行分析，以检测至少一种SARS诊断特征(SF)的水平，例如选自此处公开的SF其中一种。这些方法也适用于筛选、诊断、预后、监测治疗效果和药物开发。
发明的第二方面是提供了用于SARS诊断的方法，包括检测血浆或血清样品中至少一种SARS诊断蛋白质同种型(SPI)的水平，例如选自此处公开的SPI其中一种。这些方法也适用于筛选、诊断、预后、监测治疗效果和药物开发。
以下详述的发明包括用于哺乳动物受试者中SARS筛选、诊断、预后的方法和组合物，以及用于监测治疗效果的方法，用于药物开发的方法。优选地，受试者是人类；更优选地，受试者是成年人。
为了公开清楚而不以任何方式限制，本发明将以血浆样品的分析为例进行描述。但是，作为本领域技术人员应当理解，此处所述的鉴定和技术可以应用于其他类型的病人样品，包括体液(例如血浆、呼吸道灌洗液、痰、尿液)、怀疑含有来源于SARS病变组织的样品(例如肺穿刺活检组织样品)1、SARS诊断特征(SF)本发明的一个方面中，双向电泳用于分析受试者血浆以测量一个或多个SARS诊断特征(SF)的丰度，可用于SARS筛选、诊断、预后、监测SARS的治疗效果、药物的开发。此处双向电泳指一项包括等电聚焦和随后的变性电泳在内的技术。它可以产生分离的多蛋白质的双向胶(2D-gel)。根据生物分子的电泳迁移率和等电点在双向胶中分离得到一个图谱。由此图谱可以产生一个计算机形成的数字图像，代表双向电泳图谱中检测的多种生物分子的特性、表观分子量、等电点和相对丰度，因而能够允许将来对多个生物样品的图谱进行计算机辅助的比较，以及其后的胶上目标蛋白切割。
此处所用术语“SARS诊断特征(SF)”指生物样品经双向电泳后可检出的特征(例如双向电泳中特定位置的一个点)，它以不同的方式表现在一个样品与另外的相关样品中。例如，当用于检测特征的方法(双向电泳或免疫分析)显示第一个样品中与第二个样品中的特征丰度不同时，则此处所用的术语“特征”是相对于第二个样品而言，不同的存在于第一个样品中。
优选地，特征在多个样品中的相对丰度是通过两个步骤来确定的。首先，参照一个适当的背景参数将依赖于样品中所发现特征而得到的信号进行标准化，例如，参照分析样品中的总蛋白质(例如上样到胶条上的总蛋白质)。其次，一个或一组样品中已标准化的信号与另一个或一组样品的标准化信号比较。
通过优选的方法，鉴定出相对于非SARS健康受试者血清，在患SARS受试者血清中明显变化的SF。这些SF可以用表观分子量(molecular weight，M.W.)和等电点(pI)表述如下表1SARS不同期的诊断特征SF
作为熟练的技术人员应当容易理解，一个给定特征或蛋白质同种型的测定分子量和等电点会根据具体实验规程而在一定范围内变动。当按照参考规程，样品以双份平行或更多数目平行测定时，测得的SF平均等电点的偏差小于±1％，平均分子量偏差小于±5％。
SF可用于SARS的诊断、预后、监测或药物开发。SF在SARS进展期与恢复期的变化是不同的，定量的检测这些SF的水平相对正常的变化倍数，提示SARS的存在和临床进程状态，指导诊断治疗。
2、SARS诊断蛋白质同种型(SPI)本发明的另一方面是分析受试者血清，以定量检测一个或多个SARS诊断蛋白的同种型(SPI)，这些SPI可用于SARS的筛选、诊断、预后、监测治疗效果或药物开发。此处所用术语“SARS诊断蛋白质同种型”是指不同的存在于SARS患者血清与非SARS受试者血清中的蛋白质同种型。本领域公知，单基因的蛋白质产物可能表达成变构体(同种型)(1)不同的翻译后修饰的结果(如糖基化、磷酸化、乙酰化)，以至于具有相同氨基酸序列的蛋白质可以有不同的等电点、分子量或两者皆不同；(2)氨基酸组成不同(如另外的mRNA剪接)通过部分氨基酸测序，已鉴定相对于非SARS正常受试者血清，SARS患者血清发生明显变化的SPI。这些SPI的分子量、等电点和部分氨基酸序列列于表，如下表2SARS诊断蛋白同种型SPI
本发明的SPI可以用本领域技术人员知晓的任何方法加以分析。在实施方案中，SPI由于其分子量和等电点而在双向胶中得到分离，通过对凝胶染色而显现出来。
另外，SPI可以用分析方法测定，例如免疫分析方法，而用于SARS的诊断、预后、监测或药物开发。在实施方案中，在能够产生免疫特异结合的条件下，与来自要检测的受试者的样品与一种抗-SPI的抗体接触，然后检测或测量所有被抗体免疫特异性结和的量。优选地，抗-SPI抗体优先结合SPI，而不是同一蛋白质的其他同种型。
可以使用的免疫分析方法包括但不限于竞争和非竞争系统，使用技术例如western印迹、放射免疫分析、ELISA、夹心式免疫分析、免疫沉淀、沉淀素反应、凝集分析、荧光免疫分析等，此处仅指出其中一些。
图1是由正常人血清的双向电泳得到的图像，显示鉴定出了27个SARS诊断特征SF。
具体实施例方式
结合临床资料评估，从10例SARS进展期患者(发病20天内)、10例SARS恢复期患者(发病30天后)和9例非SARS健康受试者的血清中，使用下面的参考试验规程，用等电聚焦以及随后的SDS-PAGE进行分析，每个样品重复3次。样品制备部分优选地，可以预先将血清中的白蛋白和免疫球蛋白G进行去除。
1、样品制备血清样品首先进行总蛋白定量(Bio-Rad DC protein Assay)，按相当于总蛋白300μg进行等量分装，待后续分析。
2、双向电泳分析胶内溶胀上样样品和溶胀液1(尿素7M，硫脲2M，CHAPS 2％，DTT 20mM，IPG buffer 0.5％，痕量溴酚蓝)共350μl。溶胀和IEF的操作参数见表
等电聚焦完成后，将IPG胶条分放入10ml平衡液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.80.5ml，尿素3.6g，甘油3ml，SDS 0.2g，痕量溴酚蓝)中，其中DTT浓度为20mM，振荡15min。然后将胶条放入等量平衡液中烷基化15分钟，其中加入100mM/LIAA。二相有两种运行方案，一种利用Protean II垂直电泳单元，配制大小为200×200×1mm3，12.5％的均一胶。将平衡后的IPG胶条移至凝胶的上方，用0.5％的琼脂糖/电泳缓冲液封闭。电泳缓冲液为Tris-Glycine-SDS系统(500ml，5×，7.5g Tris碱，2.5g SDS，36g甘氨酸)。在14-15℃时，以每一胶条20mA恒流运行40min，再加大电流至每块胶30mA恒流运行至溴酚蓝前沿到玻璃板下缘为止。另一种在Ettan DALTsix运行，采用Ettan预制胶体系(12.5％均一胶)。下槽为4.5升Tris-Glycine-SDS缓冲液，上槽为0.8升2×Tris-Glycine-SDS缓冲液，先以2.5W每块胶运行30分钟，再以15W每块胶运行5-8小时。电泳完成后，立即将凝胶从电泳槽移出进行染色。荧光染料采用SYPRO Ruby(MolecularProbe)的使用说明进行操作。
3、凝胶成像分析染色后利用ImageScanner光学扫描仪，在256色灰度和300dpi的分辨率下，扫描并备份凝胶图像。凝胶点的检测(Spot detection)，背景消减(Backgroundsubstraction)、分子量和等电点校正、归一化处理(Volume normalization)等分析用ImageMaster 2D Elite 3.01来完成。构成一个胶内蛋白质点的所有象素点强度值的总和被定义为该蛋白质点的绝对量，将整块胶中每个点的绝对量累加，每一个蛋白点的量占累加值的百分含量(％Vol)可代表该蛋白质点的相对丰度。
在每一个样品组中，分析图形以鉴定和选择至少50％以上的图形中存在的那些特征。然后比较每组间差别在2倍以上的那些特征，作为SARS诊断特征(SF)。对每一个SF，使用方差分析比较各组间统计学意义。
4、目标蛋白的鉴定将扫描后的凝胶图像分析后，选取要作进一步鉴定的蛋白质点。利用EttanSpotpicker(AB)自动切胶仪将蛋白点从电泳胶上切下并转移至96孔板(Vitagene，杭州)中相应的位置。采用经优化后的胶内酶切条件，首先，胶粒用100μl 50％乙腈/25mM碳酸氢铵浸泡至少半个小时，用50μl纯乙腈脱水，吸出乙腈后，在室温放置10分钟，待胶粒完全干燥。在每一个样品孔中加入10μl10ng/μl测序级胰蛋白酶，于4℃放置30分钟使胶粒充分溶胀。用不干胶片(Vitagene)密封96孔板后放于37℃水浴中酶切过夜。用8μl 0.1％TFA/50％ACN超声提取(KQ-250B，昆山超声仪器有限公司，江苏)20分钟后准备点靶用于质谱分析。
5、结果与健康血清比较，SARS进展期血清展示了8个明显降低的特征，个19明显升高的特征；SASR恢复期血清展示了2明显个降低的特征，9个明显升高的特征。这些SF的详细资料列于表1。通过表1的SF可以特异的筛选、诊断SARS，结合表1的SF，可以选取SF作为监测SARS治疗效果的标志或用于药物开发。
这些SF中不同存在的SPI的部分氨基酸序列已鉴定出，详细资料见表2。通过单独或组合检测SPI可以特异的筛选、诊断SARS；通过单独或组合检测SPI可以监测SARS治疗效果或用于药物开发。
参考文献1Kang X，Xu Y，Wu X，Liang Y，Wang C，Guo J，Wang Y，Chen M，Wu D，Wang Y，Bi S，QiuY，Lu P，Cheng J，Xiao B，Hu L，Gao X，Liu J，Wang Y，Song Y，Zhang L，Suo F，Chen T，Huang Z，Zhao Y，Lu H，Pan C，Tang H.Proteomic fingerprints for potential application to early diagnosis ofsevere acute respiratory syndrome.Clin Chem.2005 Jan；51(1)56-64.
2Chen JH，Chang YW，Yao CW，Chiueh TS，Huang SC，Chien KY，Chen A，Chang FY，WongCH，Chen YJ.Plasma proteome of severe acute respiratory syndrome analyzed by two-dimensionalgel electrophoresis and mass spectrometry.Proc Natl Acad Sci USA.2004 Dec7；101(49)17039-44.
3Ren Y，He QY，Fan J，Jones B，Zhou Y，Xie Y，Cheung CY，Wu A，Chiu JF，Peiris JS，Tam PK.The use of proteomics in the discovery of serum biomarkers from patients with severe acuterespiratory syndrome.Proteomics.2004 Nov；4(11)3477-84.
权利要求
1.一种用于人类受试者中SARS的筛选、诊断、预后、监测向人类受试者施用的治疗SARS药物或治疗效果的方法，包括a)用双向电泳分析受试者血清或血浆样品，以产生特征的电泳图谱；b)对于强度与SARS的存在与否或进展相关的至少两个所选特征，将所选特征中的每一个特征在样品中的强度与对照血清或血浆中的特征的强度比较。其中，依赖样品所选特征的强度对SARS进行诊断。
2.一种用于人类受试者中SARS的筛选、诊断、预后、监测向人类受试者施用的治疗SARS药物或治疗效果的方法，包括a)用双向电泳分析受试者血清或血浆样品，根据等电点和电泳迁移率分离多种蛋白；b)定量检测至少一种下列SARS诊断特征(SF)SF-1、SF-2、SF-3、SF-4、SF-5、SF-6、SF-7、SF-8、SF-9、SF-10、SF-11、SF-12、SF-13、SF-14、SF-15、SF-16、SF-17、SF-18、SF-19、SF-20、SF-21、SF-22、SF-23、SF-24、SF-25、SF-26、SF-27。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于(b)步骤包括定量检测至少一种下列SARS诊断特征(SF)SF-1、SF-2、SF-3、SF-4、SF-5、SF-6、SF-15、SF-16、SF-17、SF-18、SF-19、SF-20、SF-21、SF-22、SF-26、SF-27。
4.一种用于人类受试者中SARS的筛选、诊断、预后、监测向人类受试者施用的治疗SARS药物或治疗效果的方法，包括在受试者血浆或血清中样品中，定量检测至少一种下列SARS诊断蛋白同种型(SPI)SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5、SPI-6、SPI-7、SPI-8、SPI-9、SPI-10、SPI-11、SPI-12、SPI-13、SPI-14、SPI-15、SPI-16、SPI-17、SPI-18、SPI-19、SPI-20、SPI-21、SPI-22、SPI-23、SPI-24、SPI-25、SPI-26、SPI-27。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包括定量检测至少一种下列SARS诊断蛋白同种型(SPI)SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5、SPI-6、SPI-15、SPI-16、SPI-17、SPI-18、SPI-19、SPI-20、SPI-21、SPI-22、SPI-26、SPI-27。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于其中定量检测的步骤包括检测至少一个样品等份，所述检测步骤包括a)将针对预选SPI的免疫特异性抗体与等份样品接触；且b)检测是否样品等份中至少一种成分与抗体之间发生结合
7.权利要求2定义的一个或多个SF在人类受试者中的SARS筛选、诊断、预后中的用途，或用于监测抗SARS药物的作用中的用途
8.权利要求4定义的一个或多个SPI在人类受试者中的SARS筛选、诊断、预后中的用途，或用于监测抗SARS药物的作用中的用途
9.免疫特异性针对权利要求4定义的一个或多个SPI的一种或多种抗体在人类受试者中的SARS筛选、诊断、预后中的用途，或用于监测抗SARS药物的作用中的用途。
全文摘要
本发明提供了用于严重急性呼吸综合征(SARS)筛选、诊断、预后、监测SARS治疗效果和药物开发的方法，描述了可以使用双向电泳分析血清或血浆来测定的SARS诊断特征，以及SARS诊断蛋白质同种型SPI、针对SPI的免疫特异性抗体。
文档编号G01N33/569GK1932502SQ20051010247
公开日2007年3月21日 申请日期2005年9月14日 优先权日2005年9月14日
发明者贺福初, 钱小红, 万佳, 孙薇, 李晓海, 应万涛, 姜颖 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所