专利名称：利用维生素k环氧化物还原酶基因单核苷酸多态性确定血管疾病易感性的方法
技术领域：
本发明涉及利用维生素K环氧化物还原酶(VKOR)基因的单核苷酸多态性位点确定患者对血管疾病(如缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层)的易感性的方法，用于该方法的物质、组合物、试剂盒及其用途。
背景技术：
血管疾病如脑卒中和冠心病发病率非常之高，中国人群中每11秒就有一个因此而死亡。能够找到这类疾病的早期预测标记意义非常明显。
已知维生素K环氧化物还原酶(VKOR)的主要功能是参与将维生素K环氧化物还原成维生素K醌形式的反应。而维生素K醌继续被维生素K还原酶还原成维生素K氢醌的形式，在凝血酶原前体转化成凝血酶原的反应中，维生素K氢醌转化成维生素K环氧化物。
维生素K依赖的促凝血蛋白和抗凝血蛋白被认为与动脉硬化和血栓症有关系[1-4]。血栓症和动脉硬化直接导致血管疾病如缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层。近期研究发现VKOR的几个单核苷酸多态性(SNPs)与华法令(warfarin)的剂量相关。
本发明通过大型病例对照研究来调查VKOR的基因单个核苷酸多态性与血管疾病(如脑中风、冠心病和动脉夹层)是否具有相关性，从而得到了利用维生素K环氧化物还原酶(VKOR)基因的单核苷酸多态性位点确定患者对血管疾病(如缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层)的易感性的方法，用于该方法的物质、组合物、试剂盒及其用途。
发明内容
本发明的一个方面，涉及一种用于鉴别选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因的多态性位点-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的工具。具体的，本发明所述工具是维生素K环氧化物还原酶基因的多态性位点-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性，或者(2)用于检测维生素K环氧化酶基因多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的维生素K环氧化酶基因多态性位点的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，所述工具是限制性内切酶。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒，其包含至少一种上述工具，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。
本发明的再一方面还涉及诊断患者包括缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层的血管疾病易感性的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的存在。
本发明的又一方面涉及确定患者包括缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层的血管疾病的易感性方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的存在。
本发明的另一方面涉及分析从患者分离的离体生物样品的方法，包括确定所述样品中选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点。
具体的，在本发明的一个实施方案中，可使用包括选自以下的差异核酸分析技术的试验用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性进行上述多态性位点分析。
本领域普通技术人员知晓，用于上述分析的样品选自来自患者的外周血细胞、白细胞、血清、尿样、唾液、体液和/或(活检)组织样本，任选的，所述样品可以预先进行纯化，例如分离总DNA。
本发明还涉及一种微阵列，其中包含选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的分型寡核苷酸。
在本发明的一个具体实施方案中，所述微阵列是DNA芯片的形式。
本发明再一方面还涉及检测生物学样品中选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的存在的物质在制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于诊断患者包括缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层的血管疾病易感性。
具体的，用于上述用途的物质选自本发明前述的工具；能够特异识别选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的突变的抗体；和能够特异识别选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的引物或者探针或者限制性内切酶。
具体实施例方式
本发明利用维生素K环氧化物还原酶基因作为包括缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层的血管疾病易感候选基因的病例的对照研究，对该基因选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点与包括缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层的血管疾病的关系进行了关联研究，根据统计学结果得出了所述多态性位点等位基因与上述血管疾病的相关性。
“对应”是指本发明核酸分子或者蛋白质的序列在与参考序列的cDNA序列所示序列最佳比对(alignment)后与该参考序列某位置相对的位置。因此，本发明核酸分子或者蛋白质“对应位置”或者“对应核苷酸”或者“对应氨基酸”不一定是与参考序列编号相同的位置、或者核苷酸或者氨基酸。
维生素K环氧化物还原酶基因单核苷酸多态性位点是指位于启动子区第-1639位多态性A和G(rs9923231)、位于第一个内含子区+1173位多态性T和C(rs9934438)，位于第二个内含子区+1542位多态性C和G(rs8050894)以及+2255位T和C(rs2359612)、位于5’非翻译区的+3730位G和A(rs7294)。
单核苷酸多态性及其检测术语“患者”是指动物，优选哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人类。
术语“多态性”广义上限定为包括已知发生在核苷酸序列中的所有变异，包括插入，缺失，置换和重复序列(包括二重重复)。
人类基因组中的序列变异主要由单核苷酸多态性(″SNP″)组成，其余序列变异是短串联重复(包括微卫星)、长串联重复(小卫星)和其它插入和缺失。SNP是群体中以可测频率(即＞1％)出现两个可替换碱基的位置。SNP被称为是″等位的″，因为由于此多态性的存在，一个物种的一些成员可能具有未突变序列(即，原始“等位基因”)，而其它成员可能具有突变序列(即变体或突变等位基因)。在最简单的情况下，可能仅存在一个突变序列，该多态性被称为二对等位基因多态性。可替换突变的发生可产生三对等位基因多态性等。SNP广泛存在于基因组中，改变基因功能的SNP可能直接有助于表型变异。由于它们的流行和普遍本质，SNP有潜力成为定位参与人类疾病情况的基因的重要工具，见如Wang等，Science 2801077-1082(1998)，它公开了一个探索性研究，其中2,227个SNP被作图定位于一个2.3兆碱基的DNA区域内。
单核苷酸多态性和特定表型之间的关系不表示或需要SNP是该表型的原因。相反，这种关系可能仅表示SNP位于表型决定因子在基因组上的存在位置的附近，由此更可能被发现与这些决定因子关联和由此与感兴趣的表型关联。因此，SNP可能与“真正”的功能变异存在连锁不平衡(LD)。当基因组两个不同位置上的等位基因的相关性比期望的相关性更高时存在LD，又称作等位基因相关(allelic association)。因此，SNP可以用作标记，由于其接近引起特定表型的突变而具有价值。
根据本发明的上述方法可通过使用用于检测单核苷酸变异的任何合适方法而得以施用，比如用质谱对PCR产物的直接质量分析，对侵入性切割产物(invasive cleavage product)的直接分析，直接的序列分析，等位基因特异性扩增(即，ARMSTM-等位基因特异性扩增，ARMS指扩增受阻突变体系(amplification refractory mutationsystem))，ALEXTM(扩增受阻突变系统线性延伸(amplificationrefractory mutation system linear extension)和COPS(竞争性寡核苷酸引发系统)，等位基因特异性杂交(ASH)，寡核苷酸连接试验(OLA)，侵入者试验，DNA芯片分析和限制性片段长度多态性(RFLP)(综述参见基因组研究(Genome Research)，1998年，8卷，769-776页；Pharmacogenomics，2000年，1卷，95-100页；人类突变(Human Mutation)，2001年，17卷，475-492页)。
携有所述多态性核酸的获自患者的样品可以方便地是从个体中获得的，包括但不限于血清、尿样、唾液、体液、(活检)组织样本等。这些样品可以预先进行纯化，例如分离总DNA。可以明了，样品同样可以是对应于试样中序列的核酸序列，也就是说，在等位基因变异分析前，核酸样品中的全部或一部分区域可先用任何一种方便的技术如聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)扩增。
显然，对于对本领域技术人员来说有大量的分析方法可被用于检测在本发明的一个或多个多态位置处变异核苷酸存在与否。一般来说，等位基因变异的检测需要突变辨别技术，任选地扩增反应和任选地信号生成系统。国际专利申请WO00/06768列出了许多扩增技术和突变检测技术，其中一些是基于PCR技术的。这些技术可和许多信号生成系统联合使用，可选的信号生成系统也被列于WO00/06768。
用于检测等位基因变异的许多现行方法综述于Nollau等，临床化学(Clin.Chem.)，1997年，43期，1114-1120页；在标准教科书例如“突变检测实验指南”(Laboratory Protocols for MutationDetection)U.Landegren编辑，牛津大学出版社，1996年和“PCR”第二版Newton &Graham编辑，BIOS Scientific Publishers Limited，1997年。
本发明涉及可被用做检测维生素K环氧化物还原酶基因中多态性的诊断引物的等位基因特异性核酸引物，该诊断引物能够与在序列内于-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点包含多态性(例如维生素K环氧化物还原酶基因位点2255T/G或者其反向互补序列)的核酸杂交。
等位基因特异性引物通常与恒定引物一起用于诸如PCR反应等扩增反应中，通过对位于一个特定序列位置处的一个等位基因的选择性扩增而使等位基因之间得以区分开来，例如用在ARMSTM试验中的引物。等位基因特异性引物的长度优选17-50个核苷酸，更优选大约17-35个核苷酸，最优选大约17-30个核苷酸。
优选地，等位基因特异性引物与待检测的等位基因完全地相对应，但是也可以考虑其衍生物，其中3’端大约有6到8个核苷酸与待检测的等位基因对应而不超过10个，比如不超过8，6，4，2或者1个剩余核苷酸在不显著影响引物特性的情况下可以发生变化。常常在第2和/或第3位(相对于3’端)的核苷酸被错配以优化差异引物结合和优先仅从正确的等位基因辨别引物延伸。
本发明还涉及用于检测维生素K环氧化物还原酶基因中多态性的的寡核苷酸探针，该探针能够与在序列内于-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点包含多态性(例如维生素K环氧化物还原酶基因位点2255T/G或者其反向互补序列)的核酸杂交。
术语“寡核苷酸探针”指长度至少有17个核苷酸的一种核苷酸序列，此序列与部分或全部的人类促血管生成素-1基因，特别是表达多态性的人类促血管生成素-l基因部分对应。优选长度17到50个核苷酸。一般来说这样的探针包含与基因中相应的野生型或变体座位完全互补的碱基序列。
然而，如果需要，可以引入一个或多个错配，前提是寡核苷酸探针的辨别能力不被过度影响。本发明的探针可以携有一个或多个标记以便于检测，比如在Moleaular Beacons中。
本发明还涉及一种用于检测维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的试剂盒，其包含至少一种维生素K环氧化物还原酶基因选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性分型寡核苷酸，或是限制性内切酶。本发明中所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的多态性，或者(2)用于检测维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒中任选的含有适于所述检测反应的缓冲体系和显色体系。
在一些实施方案中，一种组合物含有用于同时探测两个或更多个多态性位点的寡核苷酸身份的两个或更多个不同标记的基因分型寡核苷酸。也可考虑含有两套或更多套等位基因特异性引物对以允许同时靶向和扩增含多态性位点的两个或更多个区域的引物组合物。
本发明的维生素K环氧化物还原酶基因多态性位点分型寡核苷酸也可以固定在固体表面或在固体表面合成，如芯片、珠或玻片(如见WO 98/20020和WO 98/20019)。这种固定的基因分型寡核苷酸可以用于各种多态性检测试验，包括但不限于探针杂交和聚合酶延伸试验。本发明的固定的维生素K环氧化物还原酶基因分型寡核苷酸可以包括为同时快速筛选DNA样品在多个基因中的多态性而设计的有序寡核苷酸阵列。
本发明等位基因特异性寡核苷酸引物优选具有与特定SNP的仅一种核苷酸互补的3’末端核苷酸，或优选地3’倒数第二个核苷酸，由此只有存在含该核苷酸的等位基因时其才可以用作聚合酶介导的延伸反应的引物。与编码链或非编码链杂交的等位基因特异性寡核苷酸引物包括在本发明中。
本发明其它基因分型寡核苷酸与位于这里所述的多态性位点之一下游一个至几个核苷酸处的靶区域杂交。这种寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法中以检测这里所描述的多态性之一，因此这种基因分型寡核苷酸这里称作“引物延伸寡核苷酸”。在优选实施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是与多态性位点紧临的核苷酸互补的脱氧核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括包装在分开容器中的至少两个基因分型寡核苷酸的试剂盒。该试剂盒也可以含有包装在分开容器中的其它成分如杂交缓冲液(此时寡核苷酸待用作探针)。可供选择地，当寡核苷酸待用于扩增靶区域时，该试剂盒可以含有包装在分开容器中的聚合酶和用于聚合酶介导的引物延伸如PCR的经优化反应缓冲液。
本发明还涉及一种诊断患者包括缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层的血管疾病的易感性的体外方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的存在。
本发明还涉及一种确定患者包括缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层的血管疾病的易感性的体外方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的存在。
本发明还涉及一种分析从患者分离的离体生物样品的方法，包括确定所述样品中维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的核苷酸。在本发明所述方法中，使用包括选自以下的差异核酸分析技术的试验用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性。
在本发明所述方法中，其中所述来自患者的样品选自血清、尿样、唾液、体液和/或(活检)组织样本，任选的，所述样品可以预先进行纯化，例如分离总DNA。
本发明还涉及一种用于检测维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的微阵列，其中包含前述定义的维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的分型寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，所述微阵列是DNA芯片的形式。
本发明还涉及检测生物学样品中维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的的多态性位点的存在的物质在制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于诊断患者缺血性脑卒中(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞)的易感性。在本发明中，所述物质选自用于检测维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的工具，例如，维生素K环氧化物还原酶基因中多态性位点+2255T/C多态性分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的的多态性位点的多态性，或者(2)用于检测维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的寡核苷酸探针，其能特异地与具有维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的的多态性位点的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸；能够特异识别维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的的多态性位点的突变的抗体；和能够特异识别维生素K环氧化物还原酶基因中选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的的多态性位点的引物或者探针或者限制性内切酶。
以下实施例用于对本发明作进一步举例说明，而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例首先我们通过测序分析VKOR的2Kb的3’非翻译区、整个编码区，内含子，以及2Kb的5’非翻译区的单个核苷酸的多态性。在50个中风病人和50个正常人中的测序结果发现频率在5％以上的SNPs有5个，分别是-1639A/G(rs9923231)位于启动子区，+1173T/C(rs9934438)位于第一个内含子区，+1542C/G(rs8050894)和+2255T/C(rs2359612)位于第二个内含子区，+3730G/A(rs7294)位于5非翻译区。并且通过连锁不平衡分析，我们发现这5个SNPs存在严重的连锁不平衡(D’＞0.9，r2＞0.9)，这样也就是说其中任何一个SNP都能够反应整个这个区域的单倍型。
于是我们挑选了2255这个位点进行大规模临床分析。病例为1811个脑中风病人，740个冠心病病人，253动脉夹层病人，其中脑中风病人分为3个亚型-798个脑缺血，514个腔梗，499个脑出血；2968个对照(1811个匹配脑中风，740个匹配冠心病，417个与动脉夹层对照)。全部通过医学检查确认(脑卒中通过CT，MRI检查；冠心病至少1支70％狭窄；动脉夹层通过UFCT和超声检查，排除动脉炎、外部损伤等病人)。
所有受试者均取空腹12小时静脉血，EDTA抗凝，离心分离血细胞，采用低渗缓冲液溶血法从白细胞中提取基因组DNA，PCR扩增相应的+2255T/C的目的片断。+2255T/C位点基因分型上游引物5’-TCTGAACCATGTGTCAGCCAGGACC-3’和下游引物5’-GAACAGAGAGAGGAACCAAGGGAGTGGA-3’PCR产生一个198bp的片断。NcoI(New England Biolabs)酶37℃孵育一个小时，A等位基因型产生出2个DNA片断，分别是172和26bp，用4％琼脂糖凝胶电泳分离。G等位基因型不能够切开。测序验证PCR产物(ABI prism 377，Perkin Elmer)以确认分型结果。Spss10.0软件包统计结果，组间差异采用卡方检验或不配对t检验。OR值和95％的置信区间采用多元logistic回归分析校正，最后通过年龄、性别、体重指数、收缩血压、舒张血压、吸烟、饮酒、血糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三脂校正得到校正OR值。采用双侧检验P＜0.05认为差异显著。CC+CT基因型在+2255位点病人组出现频率明显高于对照组。脑中风-19.7％vs 11.7％，OR＝1.95(1.58-2.41)，P＜0.001；冠心病-16.9％vs 11.2％，OR＝1.72(1.24-2.38)，P＜0.01；动脉夹层-17.0％vs 10.1％，OR＝1.90(1.04-3.48)，P＜0.05。在缺血型脑卒中中更为显著。+2255位点CC+CT基因型频率病人组高于对照组1.95倍(95％CI，OR＝2.33(1.76-3.06)；P＜0.001)。这里所有的OR值经过性别、年龄、体重指数、血压、吸烟、饮酒、血糖、高密脂蛋白、低密脂蛋白、总胆固醇、甘油三脂多元回归调整。为了进一步确认这种相关性，我们检测了2255位点基因型和血清中维生素K依赖性蛋白PIVKA-II和undercarboxylated-osteocalcin的浓度是否具有相关性。这两种蛋白都是非羧基化的蛋白。当维生素K的γ羧化作用增强时，这两种蛋白的含量降低，反之升高。我们选择了49个正常样本，2255位点基因型TT的26个，TC的18个，CC的5个。Spearman相关系数分别时rs＝-0.219(P＝0.021，undercarboxylated-osteocalcin)和-0.567(P＜0.001，PIVKA-II)。The comparison TT和CC携带者的血清中抗原水平是明显的(P＝0.021在undercarboxylated-osteocalcin中和P＜0.001在PIVKA-II中).这个结果表明C等位基因导致一个高的VKOR活性。
由以上结果可见，VKOR的单倍域G-C-G-C-A(-1639～+1173～+1542～+2255～+3730)导致较高的血管疾病如中风、冠心病和动脉夹层的风险。也就是VKOR的SNPs与中风、冠心病、动脉夹层存在相关性，并且独立于其他传统的这些血管疾病的危险因素。因此VKOR的SNPs可作为新的预示心血管事件的基因标记。
参考文献1.Burns P，等人，维生素K依赖性凝血因子在与缺血性心脏疾病密切相关的年轻成人中增高，J Lab Clin Med.1993；122720-727.2.Meade TW，等人，凝血功能与缺血性心脏病Northwick Park心脏研究的原理性结果，Lancet.1986；2533-537.
3.Meade TW，等人，纤维蛋白溶解性活性、凝集因子和NorthwickPark心脏研究中的长期缺血性心脏病的发病率，Lancet.1993；3421076-1079.
4.Reitsma PH等人，具有症状蛋白C缺陷型I的40个荷兰家庭中遗传缺陷谱异源和发现者效应，Blood.1991；78890-894.
权利要求
1.用于鉴别选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因的多态性位点-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的工具。
2.权利要求1的工具，它是维生素K环氧化物还原酶基因的多态性位点-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性，或者(2)用于检测维生素K环氧化酶基因多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有选自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的维生素K环氧化酶基因多态性位点的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。
3.根据权利要求2的工具，其是限制性内切酶。
4.一种试剂盒，其包含至少一种权利要求1-3中任一项的工具，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。
5.诊断患者包括缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层的血管疾病易感性的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的存在。
6.确定患者包括缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层的血管疾病的易感性方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的存在。
7.分析从患者分离的离体生物样品的方法，包括确定所述样品中选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点。
8.权利要求5-7中任一项的方法，其中使用包括选自以下的差异核酸分析技术的试验用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性。
9.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述来自患者的样品选自外周血细胞、白细胞、血清、尿样、唾液、体液和/或(活检)组织样本，任选的，所述样品可以预先进行纯化，例如分离总DNA。
10.一种微阵列，其中包含权利要求2所定义的选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的分型寡核苷酸。
11.权利要求10的微阵列，它是DNA芯片的形式。
12.检测生物学样品中选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的存在的物质在制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于诊断患者包括缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层的血管疾病易感性。
13.权利要求12的用途，其中所述物质选自权利要求1-3的工具；能够特异识别选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的突变的抗体；和能够特异识别选自如下的维生素K环氧化物还原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多态性位点的引物或者探针或者限制性内切酶。
全文摘要
本发明涉及利用维生素K环氧化物还原酶(VKOR)基因的单核苷酸多态性位点确定患者对血管疾病(如缺血性脑卒中、冠心病以及出血性脑卒中、动脉夹层)的易感性的方法，用于该方法的物质、组合物、试剂盒及其用途。
文档编号G01N33/50GK1952173SQ20051010937
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月17日 优先权日2005年10月17日
发明者惠汝太, 汪一波, 郑翼, 杨涛, 杨旭, 张禅那, 陈敬洲 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院