专利名称：供hplc分析的万古霉素发酵液前处理方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵液的前处理方法，尤其涉及一种供HPLC分析的万古霉素发酵液前处理方法。
背景技术：
万古霉素属于糖肽类抗生素，对革兰氏阳性菌有较强的抗菌作用，尤其是对MRSA有较好的疗效，故万古霉素的生产与研发日益受到重视。最早研究万古霉素是国外Micormick等从一株东方链霉菌的发酵液中分离得到；国内的研究主要有东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis SIPI-43491)(见申请号CN01132048.6的专利申请)及其突变株东方拟无枝酸菌CGMCCNo.1183(见申请号CN200410067197.7的专利申请)，它们的发酵液中都可以分离出万古霉素。很显然，万古霉素发酵液单位的检测在万古霉素的生产与研发中也日益突出。目前最常用的发酵液单位的检测是高效液相色谱法(HPLC)，相对于生物检测或其他方法，高效液相色谱仪(HPLC)法具有快速、准确的优点，所以其应用也日益广泛。在应用HPLC法检测发酵液单位中，发酵液前处理方法的优劣对检测结果的准确性及色谱仪色谱柱的损伤程度影响较大，因而对发酵液前处理方法的改进与提高很有意义。
现有技术中，万古霉素发酵液前处理技术(陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，p8页)是将万古霉素发酵液用4mol/L HCL调pH至4.5，于3500r/min离心10min，去除菌丝体与固体杂质，吸取1mL上清液，在12000r/ml条件下离心10min，上清液样品供HPLC检测，该HPLC柱在分析完50个上清液样品后，柱压上升15％，目的峰的理论塔板数下降10％。此万古霉素发酵液前处理方法缺点在于所用酸的酸性过强易使万古霉素降解，从而影响测定的准确性。这样处理后的上清液中还可能有杂蛋白甚至菌体和其他微小颗粒残留，对HPLC分析及仪器不利。当进行多个发酵液样品分析后，部分杂蛋白会黏附在色谱柱的柱头，有些黏附是不可逆的，会缩短柱寿命，且会使柱压升高，对高效液相色谱仪的泵不利，同时杂质会影响柱的分离效果，以致影响目的物与杂质的分离度，从而影响分析的准确性。
发明内容
本发明的目的旨在提高HPLC分析万古霉素发酵液单位的准确性，提高高效液相色谱柱的分离效果和使用寿命，提供一种供HPLC分析的万古霉素发酵液前处理方法。
本发明的上述目的是通过下列技术方案来实现的本发明的供HPLC分析的万古霉素发酵液前处理方法包括如下步骤1)用有机弱酸将万古霉素发酵液的pH调节至4.0～4.5，过滤得滤液或离心分离得上清液，以去除菌丝体与固体杂质。在本发明中使用有机弱酸处理万古霉素发酵液不会破坏万古霉素的结构，从而确保发酵液单位测定的准确性。
2)将上述的滤液或上清液与甲醇以1∶0.5～2的体积比，较佳地是1∶1的体积比混合均匀，离心，离心后的清液即可作为样品用于高效液相色谱仪(HPLC)分析其万古霉素单位。将步骤1)得到的滤液或上清液进一步使用甲醇处理在确保万古霉素不会降解的同时可以除去很大一部分杂质，减少含万古霉素的样品影响HPLC柱的性能，提高柱的使用寿命。
其中，较佳地是在步骤2)离心后的上清液用孔径为0.22～0.6μm，较佳地是0.45μm的偏氟膜过滤，以进一步除去微小的颗粒杂质。
步骤1)中所述的有机弱酸较佳地为C1～3的有机弱酸，更佳地为醋酸、草酸、或者醋酸和草酸的混合酸，该混合酸可以以任何比例混合。
步骤1)中所述的离心较佳地是在3500～4000r/min下离心8～20分钟，较佳地是15分钟。
步骤2)中所述的离心较佳地是在10000～12000r/min条件下离心8～20分钟，较佳地是10分钟。
在本发明中，所述的万古霉素发酵液是指任何产万古霉素的菌株在适当的条件下发酵产生出来的万古霉素发酵液；较佳地是东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)在可发酵产生万古霉素的发酵培养基中，正常发酵条件下发酵出来的发酵液，如东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalisSIPI-43491(见申请号CN01132048.6的专利申请)和其突变株CGMCCNo.1183(见申请号CN200410067197.7的专利申请)产生的万古霉素发酵液；也可以是现有技术(如陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，p8页)中提到的万古霉素发酵液。
本发明的积极进步效果在于用本发明的发酵液前处理方法处理万古霉素发酵液后，供HPLC分析的样品中的杂质大大降低，连续进行上百个样品分析，未见柱压升高，分析效果良好。
具体实施例方式
实施例1取一定量万古霉素发酵液(同现有技术“陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，p8页”)，用HAC调pH至4.0，于4000r/min离心15min，去除菌丝体与固体杂质；吸取一定量的上清液，按体积比1∶1加入甲醇，混合均匀，在12000r/min条件下离心10min；然后再用0.45μm偏氟膜过滤；过滤后的清液供HPLC检测(HPLC检测条件同“陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，p8页”)。该HPLC柱连续分析50个样品后，柱压为123～125bar，目的峰的理论塔板数为6500～6600；分析前后，柱压没有变化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理论塔板数未下降。
实施例2
取一定量的万古霉素发酵液(同现有技术“陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，p8页”)，用草酸调pH至4.5，于4000r/min离心15min，去除菌丝体与固体杂质；吸取一定量的上清液，按上清液∶甲醇＝1∶2的体积比加入甲醇，混合均匀，在10000r/min条件下离心10min；然后再用0.45μm偏氟膜过滤；过滤后的清液样品供HPLC检测分析(HPLC检测条件同“陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，p8页”)。该HPLC柱连续分析50个清液样品后，柱压为123～125bar，目的峰的理论塔板数6500～6600；分析前后，柱压没有变化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理论塔板数未下降。
实施例3取一定量的万古霉素发酵液(同申请号CN200410067197.7的专利申请)，用草酸与醋酸的混合物(质量比为1∶1)调pH至4.5，于4000r/min离心15min，去除菌丝体与固体杂质；吸取一定量的上清液，按上清液∶甲醇＝2∶1的体积比加入甲醇，混合均匀，在10000r/min条件下离心10min；然后再用0.22μm偏氟膜过滤，过滤后的清液样品用HPLC检测分析(HPLC检测条件同“陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，p8页”)。该HPLC柱连续分析50个清液样品后，柱压为123～125bar，目的峰的理论塔板数为6500～6600；分析前后，柱压没有变化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理论塔板数未下降。
实施例4取一定量的万古霉素发酵液(同申请号CN200410067197.7的专利申请)，用草酸与醋酸的混合物(质量比为1∶1)调pH至4.5，于4000r/min离心15min，去除菌丝体与固体杂质；吸取一定量的上清液，按上清液∶甲醇＝1∶1的体积比加入甲醇，混合均匀，在10000r/min条件下离心10min；然后再用0.45μm偏氟膜过滤，过滤后的清液样品用HPLC检测分析(HPLC检测条件同“陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，p8页”)。该HPLC柱连续分析50个清液样品后，柱压为123～125bar，目的峰的理论塔板数为6500～6600；分析前后，柱压没有变化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理论塔板数未下降。
实施例5取一定量的万古霉素发酵液(同申请号CN01132048.6的专利申请)，用丙酸调pH至4.3，过滤，去除菌丝体与固体杂质；吸取一定量的滤液，按滤液∶甲醇＝1∶1的体积比加入甲醇，混合均匀，在11000r/min条件下离心10min；离心后的清液样品用HPLC检测分析(HPLC检测条件同“陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，p8页”)。该HPLC柱连续分析50个清液样品后，柱压为127～129bar，目的峰的理论塔板数为6500～6600；分析前后，柱压略有升高(上升约3.2％)，HPLC的分析效果良好，目的峰的理论塔板数未下降。
权利要求
1.一种供HPLC分析的万古霉素发酵液前处理方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)用有机弱酸将万古霉素发酵液的pH调节至4.0～4.5，过滤得滤液或离心分离得上清液；2)将上述的滤液或上清液与甲醇以1∶0.5～2的体积比混合均匀，离心。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中离心后的上清液用孔径为0.22μm～0.6μm偏氟膜过滤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2)中离心后的上清液用孔径为0.45μm偏氟膜过滤。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于步骤1)中所述的有机弱酸为C1～3的有机弱酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤1)中所述的有机弱酸为醋酸和/或草酸。
6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于步骤1)中所述的离心是在3500～4000r/min下离心8～20分钟。
7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于步骤2)中所述的滤液或上清液与甲醇以1∶1的体积比混合均匀。
8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于步骤2)中所述的离心是在10000～12000r/min下离心8～20分钟。
全文摘要
本发明公开了一种供HPLC分析的万古霉素发酵液前处理方法，该方法包括如下步骤1)用有机弱酸将万古霉素发酵液的pH调节至4.0～4.5，过滤得滤液或离心分离得上清液；2)将上述的滤液或上清液与甲醇以1∶0.5～2的体积比混合均匀，离心。用该方法预处理发酵液后，供HPLC分析的样品中的杂质大大降低，连续进行上百个样品分析，未见柱压升高，分析效果良好，而且分析的万古霉素准确率高。
文档编号G01N1/28GK1861629SQ200510110958
公开日2006年11月15日 申请日期2005年11月30日 优先权日2005年11月30日
发明者陈代杰, 刘垚, 李继安, 戈梅, 陶正利, 叶卫东 申请人:上海医药工业研究院