用于筛查食管癌癌前病变的蛋白质芯片的制作方法

专利名称：用于筛查食管癌癌前病变的蛋白质芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于癌症筛查和/或早期诊断的蛋白质芯片，以及由此蛋白质芯片衍生的筛查试剂盒。具体而言，本发明提供了用于筛查食管癌癌前病变的蛋白质芯片和由此蛋白质芯片衍生的筛查试剂盒及其在健康人群或高危人群中进行食管癌癌前病变的筛查和/或早期诊断中的应用。
背景技术：
食管癌是人类常见肿瘤之一，发病率高、死亡率高，目前食管癌的五年死亡率仍然在90％以上，严重威胁着人类的生命健康。食管癌死亡率高的最重要的原因是食管癌的诊断率低，早期食管癌病人无明显体征，因而到医院就诊的病人绝大多数是中晚期病人。食管癌的发生、发展具有明显的阶段性，通常经历食管炎、食管鳞状上皮不典型增生(包括轻中重三级不典型增生)、原位癌，最终发展为浸润癌。食管鳞状上皮不典型增生是食管癌的癌前病变，这一阶段称之为食管癌发生的癌前阶段。将食管癌癌前病变患者从人群中筛查出来，进行干预性治疗可以将食管癌的发生阻断在癌前阶段，这对于提高食管癌的治愈率及降低死亡率具有重大意义。
目前常用的食管癌癌前病变的诊断技术包括中国食管气囊拉网脱落细胞检查、日本海绵球拖拉脱落细胞检查、胃液隐血检测技术、食管镜检查及食管粘膜碘染色。
二十世纪五十年代末，河南医科大学首先开展了应用“双腔管带网气囊”进行食管拉网脱落细胞学检查。1993年的一组204个病例的报告显示，依据食管拉网细胞学筛查发现和诊断的早期癌手术切除后5、10和25年的生存率分别为92.6％、71.6％和48.0％，效果令人满意。但在普查过程中发现该技术也存在诸多问题。1972到1996年间，在我国食管癌高发区进行的多次共71890人的普查中，食管拉网脱落细胞学检查对食管癌重度不典型增生的检出率在1％-10％之间，差别较大。造成这一问题的原因可能是由于该技术受到拉网操作医生、细胞病理学医生的水平，诊断标准等多因素的影响。1980年后，随着食管内镜技术的普及，发现拉网细胞学检查的敏感性低，漏诊率高。1995年和2002年两次对437人和742人的食管拉网细胞学检查与食管镜及食管粘膜碘染色检查的双盲对比研究发现，食管拉网细胞学检查对不典型增生的敏感性分别为33.6％和30.3％，即有接近70％的患者被漏诊。而且由于食管拉网过程太痛苦，患者的接受率越来越低。
日本海绵球拖拉脱落细胞检查与食管拉网相比，具有操作简单，受检者痛苦少，接受率效率高的优点。但是，但食管上皮脱落细胞收集率低，效果差，敏感性低。一组460例45-65岁高发区的自然人群，每人连续3项三盲检查，先海绵球，然后食管拉网，最后内镜检查(术中加碘染色)，三者最后确诊为食管者分别为0，11，23例，可见日本海绵球拖拉脱落细胞检查普查应用价值不大。
由于吞咽食物和食管蠕动的摩擦，使食管粘膜表面脆弱的病灶易受到损伤并导致病变细胞的脱落和出血。这些细胞和血液可随食物或唾液流入胃内，存入胃液。按此设想，秦德兴设计了胃隐血检测筛查法。在一个速溶胶囊内装棉球，胶囊在胃液中溶化释放棉球，棉球吸附1ml的胃液，拿出体外进行潜血试验。魏德兴报告一组4970例胃液隐血检测，(++)和(+++)阳性者共372例，其中284例接受内镜检查，21例诊断为食管癌。对食管癌的敏感度52.5％，特异度74.9％，漏诊率47.5％，不能检测出食管癌癌前病变。形若齐设计的一组隐血试验和内镜检查的双盲试验(495例)，证明胃隐血检测筛查法对食管癌的敏感度21.3％，特异度90.2％，癌漏诊率达78.7％，对癌前病变的检出率为0。陆建邦1994年对476人的检查结果认为该方法对食管癌及其癌前病变的漏诊率为100％。由于胃隐血检测筛查法的灵敏度低漏诊率高，对食管癌及其癌前病变没有筛查的价值。
食管内镜检查时应用碘染色的检查方法是为了提高食管癌及其癌前病变的发现率和诊断率。1993-1994年日本yokoyama首先将此方法应用于食管癌的筛查。对629例40岁以上的无任何食管癌有关症状的男性进行检查，发现了21例食管癌，其中包括8例原位癌，检出率为3.3％。1995年王国清等在河南林县用此方法筛查食管癌高危人群460例，检出食管癌16例，检出率3.47％。同时发现重度不典型增生26例，检出率5.65％。2002年王国清等报道了一组3022例40-69岁的高危地区人群的筛查结果。用该方法检出食管鳞癌131例，检出率4.33％；轻度不典型增生676例，检出率22.4％；中度不典型增生506例，检出率16.7％；重度不典型增生153例，检出率5.1％；原位癌100例，检出率3.3％。实践说明食管内镜加碘染色的方法重复性高可靠性好，发现食管癌和癌前病变的准确性在99％以上，漏诊率很低。鉴于以上优点，曾考虑用该方法作为筛查的手段。但是，由于该方法成本高，检查效率低，不适合作大规模的人群筛查。另外，由于此方法为侵入性检查，受检者过于痛苦，受检者顺从率低。因此，在我国现有国情下不可能成为大规模食管癌高危人群的普查方法。
随着分子生物学的迅速发展，在研究食管癌病因的同时，也在分子水平上对食管癌发生发展有了更多的了解。已有的研究表明在食管癌发生发展的多阶段过程中，细胞形态的恶性生物学改变伴随着其分子水平的多种基因参与和改变，它们包括癌基因的扩增、过度表达、突变和抑癌基因的缺失、突变、易位、重排等等多种基因的改变。到目前为止，已报道的与食管癌发生相关的基因异常改变约有十余种。最常见的癌基因改变有细胞周期蛋白cyclinD、cyclinE等，表皮生长因子EGF及其受体EGFR和c-erbB-2基因，mdm-2、HER2、myc基因的扩增和过度表达等等。同时发现P53、Rb、p16、Bcl-2、int-2、E-Cadherin等抑癌基因的突变、缺失、转导、易位及甲基化等改变。细胞遗传学和分子生物学技术的分析还发现，多个染色体上某些区段的扩增或缺失与食管癌的发生发展密切相关，如1q、3q2、5p、8q和20q染色体DNA拷贝数增加和3p、9p、13q、18q和Xp拷贝数减少等。为检测这些基因的改变，相继建立和发展起来多种分子生物学检测技术，如各种PCR技术(RT-PCR、PCR-SSCP和PCR-RFLPs)，各种核酸杂交技术(Southern、Northern、比较基因组杂交技术等)，以及近年来发展起来的荧光原位杂交技术(FISH)和微卫星多态性分析技术等。但这些技术对病患的判断均需依赖于病灶组织或病变细胞的获得。然而阳性样本的获取难度较大，而且很难在食管癌的癌前阶段采集到所需的标本，使这些技术在食管癌癌前病变的筛查中难以发挥相应的作用。加之这些技操作复杂，技术难度高，重复性差，需要特殊试剂和仪器，其敏感性、特异性和准确性尚难以定论，目前国内外均未将这些技术作为人群普查筛检食管癌癌前的手段和方法。
目前大约已经发现了50余种人食管鳞癌生物标志物，它们或与人食管鳞癌的易感性相关，或与食管鳞癌发生直接相关，或与食管鳞癌预后相关，或与食管鳞癌转移相关，或与食管鳞癌临床分期相关，或与食管鳞癌耐药相关等等。这些标志物包括P53、p63、MDM2、RB、cdk4、cdk6、cyclin D1、cdk2、cyclin E、P16INK4A、p21Cip1/WAF1 EGFR、c-erbB-2、int-2、hst-1、TGF-beta、Smad 1、Smad 5、TGF-beta R-I、TGF-betaR-II、Fas、Fas ligand、bcl-2、Bcl-xl、E-cadherin、CD44、Integrin、laminin、fibronectin、MMPs-1、MMPs-2、MMPs-4、MMPs-7、MMPs-9、MMPs-12、MT1-MMP、myc、COX-2、annexin I，annexin II，small proline-rich proteins(SPRRs)、calcium-binding S100 proteins(S100A2，S100A8，S100A9)、cytochrome P-450s(CYP2E1，CYP2A6，and CYP2D6)、CYP2E1、CYP2A6、CYP1A1 GSTM1、GSTs(GSTT1，GSTP1)、N-acetyltransferase2(NAT-2)、MGMT、hMLH1、XRCC1等等。(Xing D，Tan W，Lin D.中国人群食管癌的遗传多肽和易感性.肿瘤学报道.2003Sep-Oct；10(5)1615-23.Ferec C，Giroux MA，Audrezet MP，RobaszkiewiczM.肿瘤蛋白P53和食管癌.病理生理(巴黎).1997 Dec；45(10)871-5.Shimada Y，Imamura M.食管癌的预警标志一从分子生物学的观点.日本Gan To Kagaku Ryoho.1996 Jul；23(8)972-81.Streit M，Schmidt R，Hilgenfeld RU，Thiel E，Kreuser ED.胃肠道肿瘤恶性转化过程中的黏附分子.分子医学杂志.1996 May；74(5)253-68.Riddell RH.食管和食管胃连接处的恶性增生的早期发现.美国消化道杂志.1996 May；91(5)853-63.Sasaki H，Watanabe H，Terada M.食管鳞状细胞癌的遗传学改变日本Nippon Rinsho.1996 Apr；54(4)1060-5.Montesano R，Hollstein M，HainautP.食管癌发生的分子机理.法国Ann Ist Super Sanita.1996；32(1)73-84.Tahara E.胃肠道肿瘤的遗传学改变，分子诊断的应用.癌症.1995 Mar15；75(6 Suppl)1410-7.Roth JA.食管癌的细胞及分子生物学.北美胸部外科临床.1994 May；4(2)205-16.Tahara E.人胃肠道肿瘤的生长因子和抑癌基因.临床肿瘤学癌症研究杂志.1990；116(2)121-31.Rhonda F，Souza，MD.上消化道肿瘤的分子和生物学基础-食管癌.北美外科肿瘤临床.2002 11257-272.Alfred King，Y.Lam.食管鳞状细胞癌的分子生物学.肿瘤学及血液学.2000 3371-90.)。这些食管癌相关生物标志物中，多数属于位于胞浆和胞核的类型，另外的EGFR、c-erbB-2、TGF-beta R-I、TGF-beta R-II、Fas、Fas ligand、E-cadherin、CD44、Integrin、laminin、fibronectin等标志物位于食管癌癌细胞表面，大致分为三大类，受体类、细胞表面粘附分子和细胞表面糖蛋白类。总的来说，这些标志物单独诊断食管癌的意义不是太高。
以上方法均是直接检测样品中发生改变的抗原、蛋白或基因。与以上检测方法明显不同，近年来发现肿瘤病人血液中含有针对肿瘤抗原或自身抗原的抗体，某些抗原的相应抗体在正常人和肿瘤病人中的分布呈现一定的特异性，可能具有一定的诊断价值。但目前发现的这些种类的抗原在肿瘤病人当中阳性率低，单独应用或少数几种联合应用时诊断的灵敏度和准确度都不够，不能作为一种新的诊断方法。目前根据研究该类抗原的权威组织统计(http//www2.licr.org/CancerImmunomeDB/SerexSearchDB.php)，在食管鳞状细胞癌中，这类抗原已发现多个，分别是NY-ESO-1、TROP2，SURF1、LOC146223、HOOK2和AGENCOURT_7565913。在其他肿瘤中，也发现了可以与食管癌交叉反应的这类抗原，如NY-ESO-1等。这些抗原在食管癌和食管癌癌前病变的阳性率低，不具有单独的诊断的意义。
综上所述，上述众多的食管癌诊断技术中，目前国内外常用的食管癌前病变的筛检诊断技术主要为食管镜检查及食管粘膜碘染色，但其检查效率低，病人顺从率低。因此，研究开发易于在人群筛查中广泛推广应用的简便、快速、高效、经济、无创无痛的食管癌癌前病变筛查早诊技术是国内外攻克食管癌癌前病变筛查的“关口”的难点和重点。从血液中检测各种分子标志物的技术方法，具有简便、经济、快速、无创无痛易于接受的特点，优于上面所述的各种技术，但是目前尚缺乏敏感性和特异性均较高的检查指标，食管癌癌前病变涉及的多种基因及分子的改变均难以在血清中检出。目前尚未见到任何关于采用多种蛋白质抗原检测血清中相应抗体的含量，并以此判断被检人是否患有食管癌癌前病变的报道。目前也尚未见到多蛋白样品的蛋白质芯片用于检测人血清中相应抗体含量的报道。

发明内容
因此，为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种新的可用于癌症筛查和/或早期诊断的蛋白质芯片。优选地，本发明的蛋白质芯片是用于筛查人食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片，该蛋白质芯片包含但不限于SEQ ID NO1-16所示的多肽或其抗原性片段，通过该蛋白质芯片可以检测来自被检人的样品例如血液(血清、血浆或全血成分)中这些特定的多肽或其抗原性片段的相应抗体的存在和/或含量，联合分析这些多肽或其抗原性片段相应抗体检测的结果，可以用来判定被检人是否患有食管鳞癌癌前病变。
本发明的第二个目的在于提供一类由上述蛋白质芯片衍生制成的癌前病变筛查试剂盒，特别是食管鳞癌癌前病变的筛查试剂盒。
本发明的第三个目的在于如上所述的蛋白质芯片及由其衍生的诊断试剂盒在筛查和/或诊断癌前病变中的应用，优选地，本发明提供了本发明的蛋白质芯片及诊断试剂盒在食管鳞癌癌前病变诊断、健康人群或高危人群食管鳞癌癌前病变筛查中的应用。因此，本发明同时提供了一种癌前病变特别是食管鳞癌癌前病变的诊断方法，其包括使用本发明的蛋白质芯片或诊断试剂盒对来自被检人的生物学样品如血液进行检测并分析。
具体实施例方式
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种新的可用于癌症筛查和/或早期诊断的蛋白质芯片。使用本发明的蛋白质芯片，通过检测生物学样品中针对特定蛋白质抗原的相应抗体的存在和/或含量，可实现对癌症的筛查和/或早期诊断。
优选地，本发明的蛋白质芯片是用于筛查和诊断人食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片，所述蛋白质芯片的特征在于其包含但不限于选自以下一组的多肽或其抗原性片段的斑点(1)具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的H3F3B多肽；(2)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的DNAJA1多肽；(3)具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的TK1多肽；(4)具有SEQID NO4所示氨基酸序列的RBPSUH多肽；(5)具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的PCNA多肽；(6)具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的EIF4G3多肽；(7)具有SEQ ID NO7所示氨基酸序列的RPS3多肽；(8)具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的RPL32多肽；(9)具有SEQ ID NO9所示氨基酸序列的COPB2多肽；(10)具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的TP53多肽；(11)具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的EFHD2多肽；(12)具有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的HNRPA1多肽；(13)具有SEQ ID NO13所示氨基酸序列的RPL6多肽；(14)具有SEQ IDNO14所示氨基酸序列的EEF1A1多肽；(15)具有SEQ ID NO15所示氨基酸序列的TRAF4多肽；(16)具有SEQ ID NO16所示氨基酸序列的MAGE-3多肽。
通过检测人的样品如血液样品中所述的蛋白质、多肽或其抗原性片段的相应抗体的存在和/或含量，以通过联合分析各蛋白质相应抗体的检测结果可以判断被检人是否存在食管鳞癌癌前病变。
在本发明中，术语“抗原”是指能够在体内引发免疫应答的肿瘤相关性蛋白质。优选地，所述抗原为具有选自SEQ ID NO1-16的氨基酸序列的蛋白质、多肽或其抗原性片段，也可以是包含上述氨基酸序列的任何多肽、蛋白质或融合蛋白质。在本发明中，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”具有相同的含义。因为本发明是采用这些蛋白质抗原检测可以与之结合的抗体，因此显而易见的是，只要采用包含上述氨基酸序列的任何多肽、蛋白质或融合蛋白质，或者是所述多肽或蛋白质的抗原性片段，均可以具有几乎相同的免疫学特性，从而也可以用于检测可以与这些蛋白质抗原结合的抗体。
根据本发明的一个实施方式，本发明的相应于SEQ ID NO1至SEQID NO16的16种抗原是经采用混合人食管鳞癌癌前病变组织(包括3例中度不典型增生、10例重度不典型增生、1例食管鳞癌)建立表达cDNA文库，并通过54例自体和异体食管鳞癌癌前病变病人血清进行免疫印迹筛选、削减抑制杂交筛选、去Ig背景筛选后获得的在食管鳞癌癌前病变病人血清中存在相应抗体的抗原，在筛选完1×106pfu的库之后，共获得了75个可与食管鳞癌癌前病变病人血清反应的蛋白质抗原克隆。
将上述抗原的基因克隆入带有正确读码框的原核表达载体(例如pET30-b(+))，通过IPTG诱导表达，提取包函体并初步纯化，获得了该食管鳞癌癌前病变抗原的重组蛋白。采用上述重组蛋白，以适量浓度点于免疫印迹膜上，采用食管鳞癌癌前病变32例、食管癌和正常人血清各20例，并采用酶联免疫印迹法检测，挑选正常人的阳性率与食管鳞癌癌前病变病人的阳性率有较大差异的克隆。按此方法获得了22个与正常人血清反应的阳性率与食管鳞癌癌前病变患者有较大差异的抗原克隆。
可采用本领域已知的任何合适的方法制备本发明的蛋白质芯片。例如，可将前述获得的抗原的重组蛋白采用生物芯片点样机点样于醛基化的玻璃基片上，每点的浓度约1-2mg/ml，点样量约4-10nl。此外，可采用任何合适的方法例如免疫荧光的方法检测被检样品(例如血清)中针对这些抗原的抗体。本发明人共采用上述方法检测了323例食管鳞癌癌前病变患者血清，291例食管鳞癌病人血清和462例正常人血清，结果显示，其中16种抗原在食管鳞癌癌前病变患者血清和正常人血清中的相应抗体存在较大的差异，联合分析诊断食管鳞癌癌前病变的灵敏度可达91.3％，而准确度也可达76％。其中对癌前轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生、原位癌的敏感性和特异性分别为92％和78％、94％和94％、93.8％和80％、95％和90％。这16种抗原分别是(1)H3F3B多肽；(2)DNAJA1多肽；(3)TK1多肽；(4)RBPSUH多肽；(5)PCNA多肽；(6)EIF4G3多肽；(7)RPS3多肽；(8)RPL32多肽；(9)COPB2多肽；(10)TP53多肽；(11)EFHD2多肽；(12)HNRPA1多肽；(13)RPL6多肽；(14)EEF1A1多肽；(15)具TRAF4多肽；(16)MAGE-3多肽。
以上结果说明，采用含上述16种蛋白质抗原的蛋白质芯片检测血液中针对上述16种抗原的相应抗体的含量，并且进行联合分析，有助于判断被检人是否患有食管鳞癌癌前病变，这种联合分析对于食管鳞癌癌前病变诊断具有较高的灵敏度和特异度，具有非常重要的应用价值。在本发明中，术语“食管癌癌前病变”指的是各类食管不典型增生，也包括食管原位癌。
因此，本发明提供了一种新的可用于筛查人食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片，该蛋白质芯片可用于联合检测分析来自被检人的样品中16种特定抗原的相应抗体的存在和/或含量，从而判断被检人是否为食管鳞癌癌前病变患者。优选地，该蛋白质芯片采用被检人的血液样品为检测样品。可采用各种适宜的方法分别检测16种特定抗原的相应特异性抗体在样品中的相对含量，每种抗原相应抗体的相对含量都有一个相应的阈值，被检血样高于(或低于)此值的被判断为阳性，联合分析这16种抗原相应抗体阳性的总数，当被检人的16种抗原阳性总数的值大于一个相应的阈值时，该被检人被判为阳性，即被诊断为食管鳞癌癌前病变疑似患者。该蛋白质芯片经在323人的食管鳞癌癌前病变患者和462人的正常人中验证，其灵敏度为91.3％，准确度为76％。
本发明的蛋白质芯片的优越之处在于1)检测的指标是特定抗原的相应抗体在被检人血清中的含量，即被检人在体内自发产生的针对这些抗原的自身抗体的水平，而不是这些抗原本身在被检人体内的表达水平。相对于直接检测抗原本身来说，抗原的相应抗体在癌症发生的早期就可以产生，此时抗原也许尚不能在血液中被检出，因而比直接检测抗原来说可诊断的癌前病变可能更小；抗原的相应抗体更容易进入血液循环而被检测到，同时人体可以对微量抗原产生相当多的相应抗体，具有一定的放大作用；另外，人体对这些抗原产生相应抗体的情况也在一定程度反映了人体抗癌前病变(例如食管鳞癌癌前病变癌)免疫反应的状态，在一定程度上加强了检测结果反映被检人是否患有癌前病变癌的准确性。
2)结果判定是在联合分析多种抗原相应抗体检测结果的基础上做出的，具有更好的灵敏度和准确度。例如，现行的食管鳞癌癌前病变诊断技术方法目前均采用单一指标，所以诊断的灵敏度和准确度往往达不到很高。本发明所采用的16种抗原单独检测食管鳞癌的灵敏度和准确度都不是很高，但联合分析之后该方法诊断食管鳞癌的灵敏度和准确度都大大提高，达到了一个大规模人群筛查可接受的水平。多标志物联合分析的观点与现在公认的食管鳞癌发生是一个多基因、多过程参与的观点是相一致。
3)本发明的蛋白质芯片所采用的16种抗原中有7种(H3F3B多肽、TK1多肽、PCNA多肽、RPS3多肽、EFHD2多肽、RPL6多肽、具TRAF4多肽)目前尚未见到食管鳞癌癌前病变病人体内存在相应抗体的报道，也尚未见到其用于诊断、检测食管鳞癌癌前病变的报道。
根据本发明的第二个方面，提供了由本发明的蛋白质芯片衍生的筛查癌前病变例如食管鳞癌癌前病变的试剂盒。这类筛查食管鳞癌癌前病变的试剂盒可用于非侵入性地诊断人食管鳞癌癌前病变。本发明的筛查试剂盒可以采用但不限于采用在此具体使用的蛋白质芯片，实际上，这些试剂盒可以在本领域共知的范围内，加上其它一些对照以便进行结果的标准化判断，或是在上述具体提及的16种蛋白质抗原的基础上，再增加其它的检测指标来联合判断。另外，由本发明提供的食管鳞癌癌前病变筛查方法衍生的试剂盒也可以采用本领域共知的范围内的多种技术手段来检测各抗原相应抗体的含量，实现本发明的目的，例如免疫荧光、免疫印迹、放射免疫、酶联免疫吸附等，检测抗原相应抗体的手段的不同并不会影响对被检人是否为食管鳞癌癌前病变患者的判断。
根据本发明提供的筛查人食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片，很容易获得由该蛋白质芯片衍生的各种诊断试剂盒。本发明提供的可用于食管鳞癌癌前病变诊断的蛋白质芯片的核心关键在于该芯片包含选自具有SEQ ID NO1-16的氨基酸序列的蛋白质抗原，从而可以通过该蛋白质芯片检测这些特定抗原相应抗体在被检人血液中的含量。从本技术领域的普通专业知识很容易推出，采用何种技术手段检测抗原相应抗体的存在和/或含量，以及采用何种抗原的存在形式(天然抗原、重组蛋白抗原、合成多肽)来检测均不会影响该方法对被检人是否患有食管鳞癌癌前病变的判断；可以预期的是，在任何食管鳞癌癌前病变诊断试剂盒中只要包含了检测在此所述的16种抗原的相应抗体的检测指标，该试剂盒检测食管鳞癌癌前病变的灵敏度和特异度就应该至少达到本发明涉及的方法的灵敏度和准确度，额外地增加其它食管鳞癌癌前病变相关的检测指标一般均能在本发明涉及的方法的基础上进一步提高诊断灵敏度和准确度。不过，使用在此具体给出多肽中的一部分多肽或其片段制备的蛋白质芯片也能够在一定程度上有助于判断被检人是否患有食管鳞癌癌前病变。
下面举一些简单的制备本发明涉及的筛查食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片衍生的试剂盒的例子。可以通过以下方法获得本发明的试剂盒，但不只限于下列方法。在大肠杆菌中表达包含有本发明所述的16种抗原特征氨基酸序列的重组蛋白或重组融合蛋白，纯化分离这些目标蛋白，使其纯度达到80％以上，在各抗原以及人IgG、人IgM(以上两种为对照，以便进行横向参比)中加入适量的生物素化的BSA，以适宜的浓度点样于经醛基化处理的玻璃基片上，抗原将共价交联于基片之上，采用牛血清封闭剩余的交联位点，干燥后低温干燥保存，这就是试剂盒中的检测玻片；将人IgG及人IgM抗体标准品进行倍比稀释，选择适宜的浓度梯度点样于经醛基化处理的玻璃片基上，抗体标准品将共价交联于基片之上，采用牛血清封闭剩余的交联位点，干燥后低温干燥保存，这就是试剂盒中的检测校正玻片；将含10％牛血清的PBS(0.01mol/Lm，pH7.4)无菌过滤装瓶，这就是样品稀释液；将含0.02％Tween20的PBS(0.01mol/Lm，pH7.4)无菌过滤装瓶，这就是洗涤液；将含有适宜稀释度的链霉亲和素-Cy5荧光标记二抗、链霉亲和素-Cy3荧光标记二抗、羊抗人IgG-Cy5荧光标记二抗及羊抗人IgM-Cy3荧光标记二抗装瓶，这就是荧光二抗。以上五种成分即可组装成一种由本发明所述方法衍生的食管鳞癌诊断试剂盒，应用时，在检测玻片的点样区加入荧光标记的链霉亲和素37℃下保湿孵育1小时，采用洗涤液洗涤3次。将被检人血清取2μl，以样品稀释液稀释至20μl，取10μl加在检测玻片上覆盖点样区，37℃下保湿孵育1小时；而取10ul的稀释液加在检测校正玻片上覆盖点样区。采用洗涤液洗涤3次，加入与链霉亲和素标记荧光不同的抗人IgG或人IgM荧光二抗(例如，链霉亲和素为Cy-3标记，则加入羊抗人IgG-Cy5荧光标记二抗)，37℃下保湿孵育1小时，采用洗涤液洗涤5次，干燥后在激光共聚焦芯片读片机上读取各点样点荧光的颜色和强度。各抗原点样点的荧光强度代表了相应抗体的相对含量，生物素化的BSA与链霉亲和素反应的荧光强度可作为抗原抗体反应的内参照，人IgG、IgM的荧光强度可作为各被检人横向参比的对照，而由不同稀释度的人IgG或IgM抗体标准品的荧光强度绘制的标准曲线可作为抗体含量的量化标准和批间反应的对照。按预先确定好的各抗原的阈值分析各抗原荧光强度的数据，可判断被检人该抗原相应抗体是否为阳性，累加16种抗原的阳性数，再根据预先确定的阳性数阈值即可判断该被检人是否为食管鳞癌患者。在上述衍生试剂盒的基础上，可再增加检测指标，例如，将NY-ESO-1抗原额外作为1种抗原也点于玻片上，就可以衍生出另外一种试剂盒，并可能增加该试剂盒诊断食管鳞癌癌前病变癌的灵敏度和准确度。
根据本发明的第三方面，本发明还提供了所述的筛查人食管鳞癌癌前病变癌的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒在食管鳞癌癌前病变诊断、健康人群或高危人群食管鳞癌癌前病变筛查中的应用。因此，本发明还提供了食管鳞癌癌前病变的诊断方法。
针对人群中被怀疑为食管鳞癌癌前病变的被检者，可抽取其血液样品，采用本发明所涉及的筛查食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒，检测被检人血液中是否存在与在此所述的抗原相应的抗体及其含量，进而判断被检者是否为食管鳞癌癌前病变患者。由于检测方法或试剂盒的各种对照的差异，判断被检者是否为食管鳞癌的标准并不是唯一的，一旦被检者被采用本发明判断涉及的诊断方法或由该方法衍生的试剂盒判断为患有食管鳞癌癌前病变，则应高度怀疑被检者为食管鳞癌癌前病变患者，并采用各种检测手段进行各种临床确诊，如临床不能发现病灶，则应密切随访监测被检者食管鳞癌癌前病变发生发展的情况。
对于普通的健康人群或医学上定义的食管鳞癌癌前病变高危人群，则可以采用本发明所涉及的筛查人食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒对他们进行普查筛检，抽取被检人群的血液样本，按上述方法判定其是否患有食管鳞癌癌前病变，一旦被检者被采用本发明判断涉及的诊断方法或由该方法衍生的试剂盒判断为患有食管鳞癌癌前病变，则应采用各种检测手段进行各种临床确诊，如临床不能发现病灶，则应密切随访监测被检者食管鳞癌癌前病变发生发展的情况。
总的来说，利用本发明提供的新的筛查人食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒，可以非常方便、快捷、无创、高效地从食管鳞癌癌前病变高危人群，以及参加检测的正常健康人群中普查筛检食管鳞癌癌前病变患者。
下面将结合实施例来说明如何实施本发明所述的新的筛查人食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片，如何由该蛋白质芯片衍生出相应的试剂盒，以及如何用上述新的筛查人食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒诊断、普查、筛检食管鳞癌癌前病变疑似患者、食管鳞癌高危人群以及健康人群。
实施例通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
实施例1制备新的筛查人食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片并检测被检血清样本将本方法涉及的16种抗原吸附或共价交联于适宜的固相支持物上。这16种抗原可以是提纯的天然蛋白，或是重组表达的蛋白，或是重组表达的含有各抗原特征氨基酸序列的重组融合蛋白，或是直接合成的各抗原特征氨基酸序列的多肽。所指的固相支持物可以是玻片、免疫印迹膜、免疫吸附所用的各种微孔板等。可以采用静电作用的方式将抗原直接吸附于固相支持物上，也可以采用共价交联的方式交联于固相支持物上。具体举例为，取适量生物素化的BSA加入到这12种纯化后的抗原重组蛋白中，然后加入终浓度为0.05％的Tween-20，充分混匀后以1mg/ml-2mg/ml的浓度点样于醛基化的玻璃基片表面，此时这12种抗原被以共价交联的方式交联于玻片表面，即已经制备成功可用于诊断人食管鳞癌的蛋白质芯片。然后再采用牛血清封闭玻片表面的其它未交联的反应位点。
封闭后首先将Cy3或者Cy5标记的链霉亲和素与吸附或共价交联这12种抗原的固相支持物表面混合孵育。经通常免疫学技术采用的各种洗涤剂洗涤后，加入被检血样品与固相支持物表面混合孵育，使得被检血样品中的这12种抗原的相应抗体与固相支持物表面的抗原结合，从而间接地吸附于固相支持物表面。再经通常免疫学技术采用的各种洗涤剂洗去非特异吸附的杂蛋白，在固相支持物表面留下相应的人抗体和荧光标记的链霉亲和素。具体举例，将1∶80稀释的Cy5标记的链霉亲和素或者1∶800稀释的Cy3标记的链霉亲和素与已封闭的玻片37度保湿孵育1小时后，采用0.01mol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗玻片3次。然后将1∶10稀释的被检血清与上述已封闭后的玻片室温保湿孵育1小时，弃被检血清，采用0.01mol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗玻片3次。
可以采用多种常用免疫学方法探测上述存留于固相支持物表面的相应人抗体，例如免疫荧光法、免疫酶法、化学发光法、放射免疫法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法等。具体举例，可采用免疫荧光法。在与Cy3-链霉亲和素反应后的玻片内加入羊抗人IgG-Cy5二抗，而在与Cy5-链霉亲和素反应后的玻片内加入羊抗人IgM-Cy3二抗，保湿孵育1小时。弃荧光二抗液，采用0.01mol/L的pH7.4的PBS冲洗玻片3次，去离子水冲洗玻片1次。空气干燥，于激光共聚焦芯片扫描仪下读取635nm和530nm的各点荧光强度和面积。其中635nm下该点的总荧光量(或平均荧光强度)代表被检血清中该点抗原相应的IgG抗体的相对含量，530nm下该点的总荧光量(或平均荧光强度)代表被检血清中该点抗原相应的IgM抗体的相对含量。然后进行数据的处理首先，将检测所得抗原点的荧光强度与点内生物素及链霉亲和素反应的荧光强度相除。其次，如果检测的抗体类型为IgG，在此步骤将经过第一步处理后的数据与经同样处理的IgG标准品的数值相除；如果检测的抗体类型为IgM，在此步骤将经过第一步处理后的数据与经同样处理的孔内IgM标准品的数值相除。第三，将IgG或者IgM标准片的数据同样按照以上两个步骤进行处理。然后根据IgG或者IgM抗体的稀释度，绘制标准曲线。通过不同批次标准曲线的不同，对不同批次的实验数据进行校正。然后将第二步的数据代入标准曲线的公式计算抗原在血清中的相应抗体含量。参照设立的对照并与相应的判断标准进行比较，可以判断该被检人的该抗原的相应抗体是否为阳性。
确定单个抗原是否为阳性后，联合分析16个抗原的结果，计算总的抗原阳性的个数，再与相应的判断标准进行比较，凡大于规定标准值者即可判断为食管鳞癌癌前病变患者。
实施例2SEQ ID NO1-16相应抗原的制备编码本发明所述的(1)H3F3B多肽；(2)DNAJA1多肽；(3)TK1多肽；(4)RBPSUH多肽；(5)PCNA多肽；(6)EIF4G3多肽；(7)RPS3多肽；(8)RPL32多肽；(9)COPB2多肽；(10)TP53多肽；(11)EFHD2多肽；(12)HNRPA1多肽；(13)RPL6多肽；(14)EEF1A1多肽；(15)具TRAF4多肽；(16)MAGE-3多肽的DNA片段已预先采用EcoR I和Xho I酶克隆在pBluescript SK(+/-)原核克隆载体中。EcoR I和Xho I双酶切重组表达载体pET30-b(+)，回收约5.4kb的双酶切片段备用。EcoR I和Xho I双酶切含各多肽基因的pBluescript SK(+/-)载体，回收各抗原相应的双酶切片段，分别克隆入回收的pET30-b(+)表达载体中。再分别采用EcoR I和Xho I双酶切筛选重组克隆。采用碱裂解法大量提取质粒，以0.1μg的DNA转化BL21大肠杆菌。挑取转化克隆，在LB培养基中培养至OD600约0.6，加入终浓度为2mM的IPTG诱导表达，4小时以后离心收获菌体。超声波震荡破碎菌体，离心收集沉淀，沉淀为含有目的抗原蛋白的包函体。8M尿素溶解沉淀，4度放置12小时以上，离心去除不溶物，与Ni亲和层析柱混合结合1小时。结合后装柱，采用pH6.5的8M尿素洗涤层析柱20倍柱体积，然后采用pH5.9的8M尿素洗脱层析柱10倍柱体积，分部收集，最后采用pH4.5的8M尿素洗脱层析柱10倍柱体积，分部收集。洗脱各组分分别上样进行SDS-PAGE分析，选择目的蛋白所在的组分进行复性。将目的蛋白所在的组分合并后调整蛋白浓度至0.25mg/ml，对含2M尿素的缓冲液透析，4度透析12小时，再对含0.2M尿素的缓冲液透析，4度透析12小时，再对含0.02M尿素的缓冲液透析，4度透析12小时，再对不含尿素的缓冲液透析，4度透析12小时。采用PEG20000吸水浓缩的方法浓缩各抗原至最终浓度为1mg/ml-2mg/ml。离心去沉淀，Lowrry法测定蛋白含量，获得各抗原的重组蛋白。
实施例3筛查食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片的衍生试剂盒的制备(蛋白芯片诊断试剂盒)(一)试剂盒的组成1.预点抗原的蛋白芯片。
2.IgG/IgM抗体标准片。
3.样品稀释液。
4.洗涤液浓缩液。
5.荧光标记抗人抗体二抗的浓缩液。
6.荧光标记链霉亲和素的浓缩液。
7.试剂盒说明书。
(二)试剂盒各组成成份的制备1.预点抗原的蛋白芯片的制备购买商品化的BSA包被并经醛基化处理后的载体玻片，例如美国CEL Associates公司的CSS-100型玻片。采用实施例2制备的16种抗原的纯化重组蛋白，以及人IgG(0.2mg/ml)、人IgM(0.2mg/ml)标准品作为样品，加入适量的生物素化的BSA和tween-20，采用生物芯片点样机将上述18种样品点于载体玻片上形成微阵列，每玻片点10个平行的微阵列，每个微阵列之间采用贴上适宜大小的塑料膜分割开来，每个样品每点点样约4nl、2个平行点。点样结束后保湿放置4小时促进样品交联于玻片之上，然后在玻片表面加上一层含20％胎牛血清的PBS，室温保湿放置1小时后4℃放置过夜，以充分封闭玻片上的非特异蛋白交联或结合位点。弃去液体，空气干燥，将玻片放置于铝箔塑料袋中充氮干燥密封，置于4℃下保存。以上过程制备成功预点抗原的蛋白芯片。
2.IgG/IgM抗体标准片的制备采用0.01mol/L的pH7.4的PBS对IgG和IgM抗体的标准品进行稀释，分别配制6个稀释度的抗体溶液，包括0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml和160ug/ml。在每份抗体样品中加入适量的生物素化的BSA，然后加入终浓度为0.05％的Tween-20，充分混匀。采用生物芯片点样机将上述抗体标准品样品点于载体玻片上形成微阵列，每玻片点10个平行的微阵列，每个微阵列之间采用贴上适宜大小的塑料膜分割开来，每个样品每点点样约4nl、2个平行点。点样结束后保湿放置4小时促进样品交联于玻片之上，然后在玻片表面加上一层含20％胎牛血清的PBS，室温保湿放置1小时后4℃放置过夜，以充分封闭玻片上的非特异蛋白交联或结合位点。弃去液体，空气干燥，将玻片放置于铝箔塑料袋中充氮干燥密封，置于4℃下保存。以上过程制备成功预点抗体标准品的蛋白芯片。
3.样品稀释液配制含10％胎牛血清的PBS(0.01mol/L，pH7.4)，加入终浓度为0.02％的Tween 20，无菌过滤分装，每瓶2ml。
4.洗涤液浓缩液配制10倍浓缩的PBS(0.01mol/L，pH7.4)，无菌过滤分装，每瓶20ml，使用前采用去离子水稀释至200ml。
5.荧光标记抗人抗体二抗的浓缩液使用市售的抗人IgG-Cy5荧光标记二抗和抗人IgM-Cy3荧光标记二抗在分别滴定适宜的稀释度后，分装于棕色小瓶。
6.荧光标记链霉亲和素的浓缩液使用市售的链霉亲和素-Cy5荧光标记二抗和链霉亲和素-Cy3荧光标记二抗在分别滴定适宜的稀释度后，分装于棕色小瓶。
7.试剂盒说明书说明书应包含以下内容，试剂盒的组成、存放条件、使用操作步骤、结果分析判断方法、注意事项等。
(三)试剂盒的操作方法与结果判断操作方法1.将密封的预点芯片从4℃下取出，室温预温15分钟以上。
2.将180ml去离子水加入20ml洗涤液浓缩液，配制好洗涤液。
3.打开预点抗原和抗体标准品芯片密封袋，取出芯片平放。采用样品稀释液按标签上标定的稀释度稀释荧光标记链霉亲和素的浓缩液，将稀释好的工作液各取20μl，加入各个微阵列样品池，均匀覆盖样品池的所有表面，但不要溢出样品池。
4.37℃下保湿孵育1小时。
5.快速甩去芯片上的液体，以20ml以上的洗涤液均匀流过玻片表面洗涤玻片，共洗涤玻片3次。
6.采用样品稀释液按照预定的比例稀释血清样品，推荐采用1∶10稀释。
7.将稀释好的样品各取20μl，加入预点抗原芯片的微阵列样品池，均匀覆盖样品池的所有表面，但不要溢出样品池。在预点抗体标准品的芯片微阵列样品池内加入稀释液。
8. 37℃下保湿孵育1小时。
9.快速甩去芯片上的液体，以20ml以上的洗涤液均匀流过玻片表面洗涤玻片，共洗涤玻片3次。
10.采用样品稀释液按标签上标定的稀释度稀释荧光二抗工作液，将稀释好的荧光二抗工作液各取20μl，加入各个微阵列样品池，均匀覆盖样品池的所有表面，但不要溢出样品池。
11. 37℃下保湿孵育1小时。
12.快速甩去芯片上的液体，以20ml以上的洗涤液均匀流过玻片表面洗涤玻片，共洗涤玻片3次。
13.以20ml以上的去离子水均匀流过玻片表面洗涤玻片，共洗涤玻片1次。
14.空气干燥，于适宜的仪器上读取各点在635nm、530nm的荧光强度。
结果判断1.对于单个微阵列的单个点样点来说，按以下方法判断其是否阳性分别计算该点的635nm荧光强度与该点的532nm荧光强度的比值和人IgG点635nm荧光强度与该点的532nm荧光强度的比值，取二者的比值，然后根据人IgG标准品预点片的抗体标准曲线的公式计算该抗原相应的抗体含量。采用该数值与预定的标准比，判断该点抗原IgG抗体是否阳性，阳性则计数为1，阴性计数为0；分别计算该点的532nm荧光强度与该点的635nm荧光强度的比值和人IgM点532nm荧光强度与该点的635nm荧光强度的比值，取二者的比值，然后根据人IgM标准品预点片的抗体标准曲线的公式计算该抗原相应的抗体含量。采用该数值与预定的标准比，判断该点抗原IgM抗体是否阳性，阳性则计数为1，阴性计数为0。
2.对于某个微阵列对应的被检人来说，其阳性抗原数按以下方法计算按1.所述方法判断单点阳性数后，阵列中12种抗原单点阳性数的总和即为被检人的阳性抗原数。
3.将被检人阳性抗原数与预定标准对比，当被检人阳性抗原数大于或等于预定标准值时，即被判断为食管鳞癌阳性。
实施例4采用新的筛查食管鳞癌癌前病变的蛋白质芯片及衍生试剂盒诊断、普查、筛检食管鳞癌癌前病变疑似患者、食管鳞癌癌前病变高危人群以及健康人群采用实施例3所述的试剂盒(采用蛋白芯片加免疫荧光法)检测食管鳞癌癌前病变患者800例食管鳞癌癌前病变、食管鳞癌癌前病变高危人群3000例、健康人群(普通社区人群)2000例。采用实施例4所述的食管鳞癌癌前病变诊断标准进行结果判断。
结果被检的800例食管鳞癌癌前病变患者中被判为食管鳞癌癌前病变的730例，被该方法判断为非食管鳞癌癌前病变的70例。说明该方法可以诊断出90％以上的食管鳞癌癌前病变。
被检测的食管鳞癌癌前病变高危人群3000例中840例被判断为食管鳞癌癌前病变，采用食管镜检查及食管粘膜碘染色检测已经诊断这840例被检人中338例属于食管鳞癌癌前病变。这说明该方法可以以较高的灵敏度将食管鳞癌癌前病变患者从被检人群中筛检出来，从而可以用于初步筛查食管鳞癌癌前病变危人群，在将这些高度疑似食管鳞癌癌前病变的人群进行临床确诊和随访。
被检测的健康人群(普通社区人群)2000例中480例被判断为食管鳞癌癌前病变，其中临床确诊1例食管鳞癌癌前病变。说明采用该方法可以将食管鳞癌患者从健康人群中筛检出来。
序列表<110>中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所<120>用于筛查食管癌癌前病变的蛋白质芯片<130>I200501569MB<160>16<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>136<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>H3F3B抗原片段<400>1Met Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala1 5 10 15Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ser20 25 30Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala35 40 45Leu Arq Glu Ile Arq Arq Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg50 55 60Lys Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys65 70 75 80Thr Asp Leu Arq Phe Gln Ser Ala Ala Ile Gly Ala Leu Gln Glu Ala85 90 95Ser Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Ala100 105 110Ile His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala115 120 125Arg Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala130 135<210>2<211>339<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>DNAJA1抗原片段
<400>2Met Val Lys Glu Thr Thr Tyr Tyr Asp Val Leu Gly Val Lys Pro Asn1 5 10 15Ala Thr Gln Glu Glu Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys20 25 30Tyr His Pro Asp Lys Asn Pro Asn Glu Gly Glu Lys Lys Gln Ile Ser35 40 45Gln Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys Arg Glu Leu Tyr Asp50 55 60Lys Gly Gly Glu Gln Ala Ile Lys Glu Gly Gly Ala Gly Gly Gly Phe65 70 75 80Gly Ser Pro Met Asp Ile Phe Asp Met Phe Phe Gly Gly Gly Gly Arg85 90 95Met Gln Arg Glu Arg Phe Arg Gly Lys Asn Val Val His Gln Leu Ser100 105 110Val Thr Leu Glu Asp Leu Tyr Asn Gly Ala Thr Arg Lys Leu Ala Leu115 120 125Gln Lys Asn Val Ile Cys Asp Lys Cys Glu Gly Arg Gly Gly Lys Lys130 135 140Gly Ala Val Glu Cys Cys Pro Asn Cys Arg Gly Thr Gly Met Gln Ile145 150 155 160Arg Ile His Gln Ile Gly Pro Gly Met Val Gln Gln Ile Gln Ser Val165 170 175Cys Met Glu Cys Gln Gly His Gly Glu Arg Ile Ser Pro Lys Asp Arg180 185 190Cys Lys Ser Cys Asn Gly Arg Lys Ile Val Arg Glu Lys Lys Ile Leu195 200 205Glu Val His Ile Asp Lys Gly Met Lys Asp Gly Gln Lys Ile Thr Phe210 215 220His Gly Glu Gly Asp Gln Glu Pro Gly Leu Glu Pro Gly Asp Ile Ile225 230 235 240Ile Val Leu Asp Gln Lys Asp His Ala Val Phe Thr Arg Arg Gly Glu245 250 255
Asp Leu Phe Met Cys Met Asp Ile Gln Leu Val Glu Ala Leu Cys Gly260 265 270Phe Gln Lys Pro Ser Pro Asp Lys Leu Ser Leu Leu Glu Lys Leu Leu275 280 285Pro Glu Arg Lys Glu Val Glu Glu Thr Asp Glu Met Asp Gln Val Glu290 295 300Leu Val Asp Phe Asp Pro Asn Gln Glu Arg Arg Arg His Tyr Asn Gly305 310 315 320Glu Ala Tyr Glu Asp Asp Glu His His Pro Arg Gly Gly Val Gln Cys325 330 335Gln Thr Ser<210>3<211>234<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TK1抗原片段<400>3Met Ser Cys Ile Asn Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Lys1 5 10 15Thr Arg Gly Gln Ile Gln Val Ile Leu Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys20 25 30Ser Thr Glu Leu Met Arg Arg Val Arg Arg Phe Gln Ile Ala Gln Tyr35 40 45Lys Cys Leu Val Ile Lys Tyr Ala Lys Asp Thr Arg Tyr Ser Ser Ser50 55 60Phe Cys Thr His Asp Arg Asn Thr Met Glu Ala Leu Pro Ala Cys Leu65 70 75 80Leu Arg Asp Val Ala Gln Glu Ala Leu Gly Val Ala Val Ile Gly Ile85 90 95Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Met Glu Phe Cys Glu Ala Met100 105 110Ala Asn Ala Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr Phe115 120 125
Gln Arg Lys Pro Phe Gly Ala Ile Leu Asn Leu Val Pro Leu Ala Glu130 135 140Ser Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Glu Cys Phe Arg Glu Ala145 150 155 160Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Thr Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly165 170 175Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser Val Cys Arg Leu Cys Tyr Phe Lys Lys180 185 190Ala Ser Gly Gln Pro Ala Gly Pro Asp Asn Lys Glu Asn Cys Pro Val195 200 205Pro Gly Lys Pro Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro210 215 220Gln Gln Ile Leu Gln Cys Ser Pro Ala Asn225 230<210>4<211>486<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>RBPSUH抗原片段<400>4Met Ala Trp Ile Lys Arg Lys Phe Gly Glu Arg Pro Pro Pro Lys Arg1 5 10 15Leu Thr Arg Glu Ala Met Arg Asn Tyr Leu Lys Glu Arg Gly Asp Gln20 25 30Thr Val Leu Ile Leu His Ala Lys Val Ala Gln Lys Ser Tyr Gly Asn35 40 45Glu Lys Arg Phe Phe Cys Pro Pro Pro Cys Val Tyr Leu Met Gly Ser50 55 60Gly Trp Lys Lys Lys Lys Glu Gln Met Glu Arg Asp Gly Cys Ser Glu65 70 75 80Gln Glu Ser Gln Pro Cys Ala Phe Ile Gly Ile Gly Asn Ser Asp Gln85 90 95Glu Met Gln Gln Leu Asn Leu Glu Gly Lys Asn Tyr Cys Thr Ala Lys100 105 110
Thr Leu Tyr Ile Ser Asp Ser Asp Lys Arg Lys His Phe Met Leu Ser115 120 125Val Lys Met Phe Tyr Gly Asn Ser Asp Asp Ile Gly val Phe Leu Ser130 135 140Lys Arg Ile Lys Val Ile Ser Lys Pro Ser Lys Lys Lys Gln Ser Leu145 150 155 160Lys Asn Ala Asp Leu Cys Ile Ala Ser Gly Thr Lys Val Ala Leu Phe165 170 175Asn Arg Leu Arg Ser Gln Thr Val Ser Thr Arg Tyr Leu His Val Glu180 185 190Gly Gly Asn Phe His Ala Ser Ser Gln Gln Trp Gly Ala Phe Phe Ile195 200 205His Leu Leu Asp Asp Asp Glu Ser Glu Gly Glu Glu Phe Thr Val Arg210 215 220Asp Gly Tyr Ile His Tyr Gly Gln Thr Val Lys Leu Val Cys Ser Val225 230 235 240Thr Gly Met Ala Leu Pro Arg Leu Ile Ile Arg Lys Val Asp Lys Gln245 250 255Thr Ala Leu Leu Asp Ala Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu His Lys Cys260 265 270Ala Phe Tyr Leu Lys Asp Thr Glu Arg Met Tyr Leu Cys Leu Ser Gln275 280 285Glu Arg Ile Ile Gln Phe Gln Ala Thr Pro Cys Pro Lys Glu Pro Asn290 295 300Lys Glu Met Ile Asn Asp Gly Ala Ser Trp Thr Ile Ile Ser Thr Asp305 310 315 320Lys Ala Glu Tyr Thr Phe Tyr Glu Gly Met Gly Pro Val Leu Ala Pro325 330 335Val Thr Pro Val Pro Val Val Glu Ser Leu Gln Leu Asn Gly Gly Gly340 345 350Asp Val Ala Met Leu Glu Leu Thr Gly Gln Asn Phe Thr Pro Asn Leu355 360 365Arg Val Trp Phe Gly Asp Val Glu Ala Glu Thr Met Tyr Arg Cys Gly370 375 380
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<223>TP53抗原片段<400>10Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln1 5 10 15Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu20 25 30Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp35 40 45Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro50 55 60Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro65 70 75 80Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser85 90 95Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly100 105 110Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro115 120 125
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<223>EFHD2抗原片段<400>11Met Ala Thr Asp Glu Leu Ala Thr Lys Leu Ser Arg Arg Leu Gln Met1 5 10 15Glu Gly Glu Gly Gly Gly Glu Thr Pro Glu Gln Pro Gly Leu Asn Gly20 25 30Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro Asp Glu Ala Ala Glu Ala Leu35 40 45Gly Ser Ala Asp Cys Glu Leu Ser Ala Lys Leu Leu Arg Arg Ala Asp50 55 60Leu Asn Gln Gly Ile Gly Glu Pro Gln Ser Pro Ser Arg Arg Val Phe65 70 75 80Asn Pro Tyr Thr Glu Phe Lys Glu Phe Ser Arg Lys Gln Ile Lys Asp85 90 95Met Glu Lys Met Phe Lys Gln Tyr Asp Ala Gly Arg Asp Gly Phe Ile100 105 110Asp Leu Met Glu Leu Lys Leu Met Met Glu Lys Leu Gly Ala Pro Gln115 120 125Thr His Leu Gly Leu Lys Asn Met Ile Lys Glu Val Asp Glu Asp Phe130 135 140Asp Ser Lys Leu Ser Phe Arg Glu Phe Leu Leu Ile Phe Arg Lys Ala145 150 155 160Ala Ala Gly Glu Leu Gln Glu Asp Ser Gly Leu Cys Val Leu Ala Arg165 170 175Leu Ser Glu Ile Asp Val Ser Ser Glu Gly Val Lys Gly Ala Lys Ser180 185 190Phe Phe Glu Ala Lys Val Gln Ala Ile Asn Val Ser Ser Arg Phe Glu195 200 205
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<223>TRAF4抗原片段
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<223>MAGE-3抗原片段<400>16
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权利要求
1.一种筛查人食管癌癌前病变的蛋白质芯片，其包含选自以下一组的多肽或其抗原性片段(1)具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的H3F3B多肽；(2)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的DNAJA1多肽；(3)具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的TK1多肽；(4)具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的RBPSUH多肽；(5)具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的PCNA多肽；(6)具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的EIF4G3多肽；(7)具有SEQ ID NO7所示氨基酸序列的RPS3多肽；(8)具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的RPL32多肽；(9)具有SEQ ID NO9所示氨基酸序列的COPB2多肽；(10)具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的TP53多肽；(11)具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的EFHD2多肽；(12)具有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的HNRPA1多肽；(13)具有SEQ ID NO13所示氨基酸序列的RPL6多肽；(14)具有SEQ ID NO14所示氨基酸序列的EEF1A1多肽；(15)具有SEQ ID NO15所示氨基酸序列的TRAF4多肽；和(16)具有SEQ ID NO16所示氨基酸序列的MAGE-3多肽。
2.如权利要求1所述的蛋白质芯片，其中所述的多肽为重组表达的多肽。
3.一种筛查人食管癌癌前病变的试剂盒，其包括如权利要求1或2所述的蛋白质芯片。
全文摘要
本发明涉及一种新的筛查人食管癌癌前病变的蛋白质芯片，以及由此蛋白质芯片衍生的筛查试剂盒。该蛋白质芯片包含了16种特定人蛋白质的蛋白斑点，使用该蛋白质芯片可以检测来自被检人的样品中这16种蛋白质各自相应抗体的存在和/或存在，联合分析这16种蛋白质的相应抗体的检测结果，可以判断被检人是否存在食管癌癌前病变。本发明进一步提供了该蛋白质芯片在健康人群或高危人群中筛查食管癌癌前病变的应用。
文档编号G01N33/53GK1955737SQ20051011673
公开日2007年5月2日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者杨治华, 冉宇靓, 李江伟, 胡海 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所