专利名称：彩色多形式hcg测试试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物医药领域，特别是医学检验技术，具体是涉及一种彩色多形式HCG测试试纸条。
背景技术：
成熟女性因受精的卵子移动到子宫腔内着床后，形成胚胎，在发育成长为胎儿过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的人绒毛膜促性腺激素(HCG)，可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。HCG在受孕后10～14天开始分泌，35-50天可升至大于2500IU/L，60～70天达到分泌高峰8万万IU/L，是早期妊娠的灵敏指标。与此同时，随着现代医学的发展，人们越来越多地发现HCG的含量与许多肿瘤性疾病有着密切联系，如绒毛膜上皮癌以及生殖系统的恶性肿瘤发生时，尿中会出现异常HCG。另外一些非正常妊娠，如宫外孕，葡萄胎等也会导致尿中HCG异常。因此HCG在尿中浓度的准确检测，不仅可用作早孕诊断，还可作为一种肿瘤性疾病的辅助检测方法。目前在我国复杂自动化仪器及其配套试剂落后于国外的情况下，研制生产特异简便、快速的HCG检测产品对早期妊娠、病理妊娠职宫外孕及胎盘滋养层疾病的诊断、鉴别、治疗及追踪观察等均有着广泛的应用前景及广阔的发展空间。
HCG异常的诊断主要以检测尿液中的HCG为标准，其检查方法以免疫法为主。目前国内外的检测方法主要包括胶乳或血凝抑制试验、放射免疫、酶免疫、胶体金法等。这几种方法相比较有以下一些特点。
胶乳凝集抑制试验(latex agglutination inhibitiontest，LAIT)和血细胞的血凝抑制试验(hemoagglutination inhibition test，HAIT)这两种试验方便简便，灵敏度为100-500mU/ml，适合大批标本检查，但因特异性差，不能定量，已逐渐被取代。
放射免疫试验(RIA)需一定设备，试验手续烦琐，且有核素污染问题，不适用于临床常规应用。
酶联免疫吸附试验(ELISA)操作程序较复杂，易造成假阳性和假阴性，并易造成操作者受害和环境污染，试验时间较长，需要两个小时以上才能得出检测结果。同时必须具备酶标仪和洗板机，这在基层实验室和小型门诊较难达到，且试验受温度等条件限制，给检测带来不便。
而免疫金标法技术(Immunochromatography Assay)是九十年代初发展起来的，因其快速、操作简便、试剂稳定、可室温储运、不易污染的特点得到广泛的应用。它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗体，胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于为干试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。
目前，已有的利用免疫胶体金技术检测HCG的产品具有以下缺点1.采用4条带显色的方法，对于高浓度的样品特异性较差。
2.显带颜色和形式单一。
发明内容
本实用新型的目的是提供一种彩色多形式HCG测试试纸条，其采用两条带显色的胶体金层析法制备，显带颜色丰富(红，兰，黑、紫等)，形式多样(条型，加号形，圆点形，梅花形等)，因而其能更加准确检测出尿液中HCG的含量且能满足不同人群的需求，更加广泛的应用于家庭和个人的自检。
本实用新型所述的彩色多形式HCG测试试纸条，是在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸而形成，包被膜有检测线和控制线，检测线包被HCG抗体，控制线包被抗鼠抗体；所述检测线和控制线的显色颜色具有多样性，是通过控制胶体金颗粒的大小，得到不同颜色的胶体金颗粒，或者采用不同颜色的乳胶微粒；所述检测线和控制线的显色形式具有多样性，是通过调节生产工艺中喷膜机的设置程序，喷制为条形、菱形、圆形、梅花形、十字形多种不同形状的条带。
所述胶乳微粒可以从国外如magsphere等公司购买。
所述包被的HCG抗体为高纯度的抗单克隆抗体和/或多克隆抗体，所述彩色胶体金颗粒或者彩色胶乳颗粒上标记抗β-HCG单克隆抗体。
本实用新型所述的彩色多形式HCG测试试纸条的制备方法，包括以下步骤A.包被膜的制备检测线调试喷膜机，喷液量为20微升/35厘米，用包被缓冲液稀释HCG单克隆抗体，浓度为80μg/ml，机器划线，室温凉干20分钟；控制线调试喷膜机，喷液量为20微升/35厘米，用包被缓冲液稀释抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为2mg/ml，机器划线，两线间隔5mm，应细致均匀，室温凉干二十分钟。37℃封闭60分钟，取出后置37℃烘干处理两小时，封袋备用；B.金标抗体的制备用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.5，按10微克抗体/毫升胶体金加入抗β-HCG单克隆抗体，混匀，静置30分钟，13000rpm离心三十分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，置4℃备用，效期一周；C.将制备好的金标抗体涂覆在玻璃纤维膜或聚酯膜上；所述涂覆金标抗体的玻璃纤维膜可以用普通方法将金标抗原涂覆在玻璃纤维膜上，也可以通过下述方法得到将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺10平方厘米，冷冻干燥，封袋，置4℃备用。
D.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
所述包被缓冲液和封闭液的配方及制备方法是本领域通用的技术。
本实用新型采用双抗体夹心法，可用来检测女性尿液样本。与现有检测试剂盒比较，由于对金标抗体进行特殊的处理，使其能够产生多种的颜色；同时对检测线(T线)和控制线(C线)进行了特殊的处理，使其能够产生各种检测形式，如条形、圆形、加号形，梅花形等。所述检测线和控制线是通过调节生产工艺中喷膜机的设置程序，喷制成不同形状的条带，从而满足不同人、不同年龄层对检测形式多样性的需求。
本实用新型利用现代国际最先进的胶体金及胶乳免疫层析技术，提供一种用于医院或个人家庭自测等检测早早孕的快速诊断试剂。该试剂具有高度特异性、灵敏度、检测速度快等优点，特别是显带颜色丰富，形式多样的特点。且不需使用仪器设备，成本低廉，操作简便，能广泛应用于医院、家庭及个人对于HCG的检测。该试纸条可以直接使用，也可以装配在塑料装置中以检测板、检测笔形式使用。
图1为本实用新型所述试纸条的结构示意图。
图2为检测结果示意图。
图3为检测结果示意图。
具体实施方式
本实用新型所述的彩色多形式HCG测试试纸条，如图1所示，该试纸条是在底衬1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜3、包被膜4以及吸水纸5而形成，包被膜4有检测线6和控制线7，检测线6包被HCG抗体，控制线7包被抗鼠抗体；所述检测线6和控制线7的显色颜色具有多样性，是通过控制胶体金颗粒的大小，得到不同颜色的胶体金颗粒，或者采用不同颜色的乳胶微粒；所述检测线6和控制线7的显色形式具有多样性，是通过调节生产工艺中喷膜机的设置程序，喷制为条形、菱形、圆形、梅花形、十字形多种不同形状的条带。
制造方法如下A抗原制备采用高纯度的抗β-HCG单克隆抗体作为包被抗原。
B抗原膜的制备包被缓冲液的制备0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液为包被溶液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，效期一周。
封闭液的配制配制0.01M pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μ膜滤过，置4℃备用，效期一周。配制封闭工作液2％BSA，2％脱脂奶，0.01M pH7.0PBS，0.22μ膜滤过，置4℃备用，效期三天。
检测线制备调试喷膜机，喷液量为20微升/35厘米，用包被缓冲液稀释HCG单克隆抗体，浓度为80μg/ml，机器划线，室温凉干二十分钟。
控制线制备调试喷膜机，喷液量为20微升/35厘米，用包被缓冲液稀释抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为2mg/ml，机器划线，两线间隔5mm，应细致均匀，室温凉干二十分钟。37℃封闭60分钟，取出后置37℃烘干处理两小时，封袋备用。
C标抗体的制造规程氯金酸的配制用双蒸水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用，效期三天。1000ml 1％氯金酸溶液配方10g氯金酸；1000ml双蒸水。
柠檬酸三钠的配制用双蒸水溶解柠檬酸三钠，配成1％溶液，置4℃备用，效期三天。
1000ml 1％柠檬酸三钠溶液配方10g柠檬酸三钠；1000ml双蒸水。
0.1M碳酸钾的配制用双蒸水配制，0.22μ膜滤过，置4℃备用，效期一周。1000ml 0.1M碳酸钾溶液配方13.8g碳酸钾；1000ml双蒸水。
3％PEG-20000的配制用双蒸水配制，0.22μ膜滤过，置4℃备用，效期一周。1000ml 3％PEG溶液配方30g PEG-20000；1000ml双蒸水。
标记洗涤液的配制2％BSA，0.01M pH7.0PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，效期两周。1000ml标记洗涤液配方20gBSA；1000ml0.01M pH7.0PBS溶液。
金标抗体保存液的配制1％BSA，0.5％脱脂奶，5/万NaN3，0.1％Tween-20，0.01MpH7.0 PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，效期十五天。1000ml金标抗体保存液配方10g BSA；5g脱脂奶；0.5gNaN3；1ml Tween-20；1000ml0.01M pH7.0PBS溶液。
胶体金的烧制用双蒸水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100毫升0.01％氯金酸加入4毫升1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物。
金标抗体的制备用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.5，按10微克抗体/毫升胶体金加入抗β-HCG单克隆抗体，混匀，静置30分钟，13000rpm离心三十分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，置4℃备用，效期一周。
D金标抗体的干燥将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺10平方厘米，干燥，封袋，置4℃备用。
E金标抗体包被的玻璃纤维膜宽度的确定将胶体金玻璃纤维膜裁成4毫米、5毫米、6毫米规格，与包被膜组成测试条，每条宽4毫米。选择能检出室内质控样本，无非特异性反应的金标玻璃纤维膜宽度定为使用宽度。
F金标抗体玻璃纤维膜的裁切根据滴配实验确定的宽度，将金标抗体玻璃纤维膜进行裁切，置干燥房间备用。
G吸水纸的裁切用裁纸机将吸水纸切成35厘米长，4.2厘米宽，置干燥房间备用。
H玻璃纤维膜的裁切将玻璃纤维膜切成长35厘米，宽2厘米的长条，置干燥房间备用。
I大板的粘贴按要求把包被膜、吸水纸、冻干金标抗体、玻璃纤维膜粘贴在塑料底板上，组成大板。组装车间温度控制在25℃，湿度20％-30％。
J切条用切条机将大板切成单个人份，每人份宽度3毫米，随机抽检，灵敏度能检出室内质控，条带显色程度达到一个“+”号，无非特异性条带，能够通过卫生部Panel。
K封装与组盒将100人份已切好的试纸条与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，放入试剂盒，每盒一份说明书。于4-30℃避光保存，不得冻存。
本实用新型所述的彩色多形式HCG测试试纸条，采用高纯度的抗β-HCG单克隆抗体作为包被抗原进行特异的HCG检查。其原理是试纸条中含均匀分布的胶体金标记β-HCG单克隆抗体，抗β-HCG抗体及抗鼠IgG抗体分别固定于硝酰膜上并呈两条线上下排列，抗鼠IgG抗体在上方为阴性对照，抗α-HCG抗体在下方为检测线。当被检尿样中含有HCG抗原时，β-HCG先和金标记的β-HCG抗体进行特异性吸附，形成Ag-Abβ复合物。由于微孔滤膜的毛细管作用和层析作用，反应复合物沿硝酰膜向前移动，待行至抗α-HCG抗体线时，形成Abα-Ag-Abβ-Au复合物而富集在包被线上，最终形成一条红色沉淀线，是为HCG阳性反应。而试纸条上无关的金标记鼠IgG随尿液继续上行至抗鼠IgG抗体处，与之形成红色标记的抗原抗体复合物是为阴性对照。
用于检测时，观察检测线6和控制线7的显色和形状来判断阳性还是阴性。如图2(a1)所示，当检测线6和控制线7均显色时，结果为阳性；如图2(a2)所示，当控制线7显色而检测线6不显色时，结果为阴性。
所述检测线6和控制线7的显色形式具有多样性，是通过调节生产工艺中喷膜机的设置程序，喷制为条形、圆形、梅花形、十字形多种不同形状的条带。如图2(a1)和图2(a2)所示，检测线6和控制线7的显色为条形；如图2(b1)和图2(b2)所示，检测线6和控制线7的显色为菱形、圆形、梅花形。
如图3(a)所示，出现十字形条带，即检测线6和控制线7交叉为十字形，结果为阳性；如图3(b)所示，只在控制线7显示条形带的，结果为阴性。
权利要求1.彩色多形式HCG测试试纸条，其特征在于该试纸条是在底衬(1)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(2)、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜(3)、包被膜(4)以及吸水纸(5)而形成，包被膜(4)有检测线(6)和控制线(7)，检测线(6)包被HCG抗体，控制线(7)包被抗鼠抗体；所述检测线(6)和控制线(7)的显色颜色具有多样性，是通过控制胶体金颗粒的大小，得到不同颜色的胶体金颗粒，或者采用不同颜色的乳胶微粒；所述检测线(6)和控制线(7)的显色形式具有多样性，是通过调节生产工艺中喷膜机的设置程序，喷制为条形、菱形、圆形、梅花形、十字形多种不同形状的条带。
2.根据权利要求1所述的彩色多形式HCG测试试纸条，其特征在于所述包被的HCG抗体为高纯度的抗单克隆抗体和/或多克隆抗体，所述彩色胶体金颗粒或者彩色胶乳颗粒上标记抗β-HCG单克隆抗体。
专利摘要本实用新型属于医学检验领域，具体是涉及一种彩色多形式HCG测试试纸条。所述的试纸条是在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸而形成，包被膜有检测线和控制线，检测线包被HCG抗体，控制线包被抗鼠抗体；所述检测线和控制线的显色颜色具有多样性，是通过控制胶体金颗粒的大小，得到不同颜色的胶体金颗粒，或者采用不同颜色的乳胶微粒；所述检测线和控制线的显色形式具有多样性，是通过调节生产工艺中喷膜机的设置程序，喷制为条形、菱形、圆形、梅花形、十字形多种不同形状的条带。本实用新型显带颜色丰富，形式多样，因而其能更加准确检测出尿液中HCG的含量且能满足不同人群的需求，更加广泛的应用于家庭和个人的自检。
文档编号G01N33/52GK2779402SQ200520056329
公开日2006年5月10日 申请日期2005年3月30日 优先权日2005年3月30日
发明者王继华 申请人:王继华