标记试剂、合成这样的试剂的方法和检测生物分子的方法

专利名称：标记试剂、合成这样的试剂的方法和检测生物分子的方法
技术领域：
本发明涉及生物分子的新的标记试剂，合成所述标记的方法，以及用于标记生物分子的用途，特别是在采用核酸分析的诊断领域。
现有技术显示，存在许多方法来标记核苷酸、寡核苷酸或核酸。
第一种方法在于，将标记连接在碱基上，不论该碱基是天然的还是经修饰的。第二种方法建议，将标记连接在糖上，在此仍然不论该糖是天然的还是经修饰的。第三种方法的目标是，将标记连接在磷酸上。
在碱基上进行标记尤其用于通过整合入经直接标记的核苷酸而对核酸进行标记的方法中。
在糖上进行标记常常用于通过化学合成制备的核酸探针的情况。
在磷酸上进行标记也用于在化学合成寡核苷酸期间引入功能化的臂和标记。
实际上，必须对核苷酸或者核苷酸类似物或核酸进行标记的本领域技术人员倾向于实施与碱基或糖的连接，这样能够提供更多的方便和选择。此外，可从许多文献的研究中获知，例如对于碱基的EP-A-0.329.198、EP-A-0.302.175、EP-A-0.097.373、EP-A-0.063.879、US-A-5,449,767、US-A-5,328,824、WO-A-93/16094、DE-A-3.910.151、EP-A-0.567.841，或对于糖的EP-A-0.286.898。
将标记连接在磷酸上是比在于功能化碱基或糖的技术更复杂的技术，并且特别是由于磷酸的弱反应性而被使用的情况要少得多(例如参见Jencks W.P.等人，J.Amer.Chem Soc.，82，1778-1785，1960)。同样地，在涉及将探针引入寡核苷酸片段中的方法的由O′Donnel和Mc Laughlin所作的综述(″Reporter groups for the analysis of nucleicacid structure″，p 216-243，″Bioorganic ChemistryNucleic Acids″，EdHecht S.M.，Oxford University Press，1996)中，核苷酸间磷酸二酯的有效烷基化被认为是不可能的。
专利申请WO-A-99/65926描述了标记合成或天然的核糖核酸(RNA)的方法，其在于片段化RNA并在末端磷酸处进行标记。该文献描述了一些能够用于与片段化关联地进行标记的官能团，例如官能团羟基、胺、肼、烷氧基胺、烷基卤、苄基类型的烷基卤，特别是衍生物5-(溴甲基)荧光素。这些官能团使得能够标记核酸，但是必需结合片段化步骤以获得有效标记，因为标记过程是在片段化期间在游离的磷酸上发生的。此外，还必需添加相对于RNA过量的标记试剂以获得有效标记，这就引起了由过量的标记产生的背景噪声的问题。最后，该方法不能有效地功能化双链DNA。
因此，存在对于新的试剂的需求，该试剂从标记收率的角度来看是有效的，其在标记位置的水平上是特异的，特别是不影响在借助于氢键形成双螺旋中所牵涉的碱基的杂交特性，其可用于DNA和RNA，和最后，其使得能够无差别地标记核苷酸、寡核苷酸、核酸，它们是天然的或经酶促扩增而制备的。
申请人已经建议了这样的新型标记，其满足上述条件和使用重氮基甲基官能团作为用于进行标记的反应性官能团。这例如为下列文献中的情况，专利申请WO-A-02/090319和WO-A-02/090584，或Laayoun等人的文章，发表在Bioconjugate Chem.2003，14，1298-1306中，题目为“Aryldiazomethanes for Universal Labelling of Nucleic Acids andAnalysis on DNA Chips”，读者可以参考这些文献以更好地理解这样的组分的合成和使用的方式。
因此，重氮基甲基官能团(式-C(N2)-)已经用于磷酸基团的烷基化，但是存在一些问题。一方面，带有至少一个重氮基官能团的试剂通常自身是不稳定的，这就对在标记试剂盒中应用这些试剂造成了问题，如果经标记的产物具有证明任何样品中生物靶分子的存在的功能，那么这是不可接受的。
最后，具有重氮基甲基官能团并与某些标记如生物素相连的试剂在水中是微溶的，这导致能够将可与水混溶的有机溶剂用于与仅溶于水或水性缓冲液的生物分子的偶联，但这些溶剂在标记反应中以高浓度存在，减慢了反应速度，因此损害了偶联效率。
由上述文献WO-A-02/090319和WO-A-02/090584所推荐的标记试剂也解决这些技术问题。在此引入这些申请的内容作为参考。
但是，即使这些用于进行标记的分子和方法是特别有效的，申请人还是成功地发现了新的分子和新的方法，其进一步改善了标记效率。本发明涉及使用多胺化的臂，其如同乙二醇臂一样，使得生物素远离反应中心(重氮基官能团)。因此，获得了更好的在水性介质中的可溶性，因为引入了亲水性的臂，并可能使胺在中性pH的介质中质子化，这引起带负电的核酸与标记之间的吸引，从而导致下列两个主要结果·更快速的标记过程，这可能对于低浓度的样品来说是特别有益的，和·通过磷酸的负电荷的中和稳定了双螺旋。
此外，这些新的分子使得能够实施能够在酸性介质中功能化的方法，这对于带有重氮基官能团的分子来说是特别有益的。因此，具有重氮基官能团的试剂的选择性在酸性介质中更大。因此，被给予聚酰胺链的可溶性有助于洗涤，同时减小在随后的检测中的背景噪声，甚至纯化步骤的完全和简单的去除。
根据本发明的第一个实施方案，本发明提出了式(0)的温度稳定的标记试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，·A是包含至少一个共价双键的连接臂，其使得重氮基官能团能够与芳环缀合，和u是0和2之间的整数，优选0或1，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，和·p是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数。
根据本发明的第二个实施方案，本发明涉及根据权利要求1的式(1)的标记试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，和·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·m是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，和
·p是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数。
有利地，根据前两个实施方案的变化形式，在试剂的式(0)或(1)中，值p小于或等于值m。
根据本发明的第三个实施方案，本发明提出了根据权利要求1-4中任一项的式(2)的试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，和·q是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数。
根据本发明的第四个实施方案，本发明描述了根据权利要求1-4中任一项的式(3)的试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，
·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，和·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基。
根据与本发明的第四个实施方案相关的变化形式，R2由式(4)的D-生物素残基组成 有利地，不论哪一个前述的试剂的实施方案，R1由CH3组成，以及R3和R4每一个均表示H。
有利地，不论哪一个前述的试剂的实施方案或变化形式，结构-(L)n-由下列组成·精胺或N，N′-双(3-氨基丙基)-1，4-二氨基丁烷NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，或·亚精胺或N-(3-氨基丙基)-1，4-丁二胺H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，或·含有丙氨酸基序NH2-CH2-CH2-COOH的衍生物。
根据本发明的第五个实施方案，本发明还涉及式(6)的温度稳定的标记试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，
·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-·CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，·A是包含至少一个共价双键的连接臂，其使得重氮基官能团能够与芳环缀合，和u是0和2之间的整数，优选0或1，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，和·p是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数。
根据本发明的第六个实施方案，本发明提出了式(7)的温度稳定的标记试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，
·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，和·p是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数。
有利地，不论哪一个前述的试剂的实施方案或变化形式，L包含基序-(O-CH2-CH2)-，其重复1-20次，优选1-10次，更优选2-5次，那么-Z-表示为-NH-、-NHCO-或-CONH-。
本发明还涉及合成标记试剂的方法，根据前面的实施方案，其包括下列步骤a)提供具有反应性官能团R6的标记或标记前体，b)提供式(8)的连接臂R7-(Z-(CH2)p)m-R8，其中，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，·p是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，·R7和R8表示相同或不同的两个反应性官能团，c)在存在至少一种偶联剂的情况下，使所述标记或标记前体的反应性官能团R6与式(8)的连接臂的官能团R7一起反应，以形成共价键，R6和R7是互补的，d)提供式(9)的衍生物 其中，·R1表示H或者烷基或芳基或取代的芳基，
·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·A是包含至少一个共价双键的连接臂，其使得重氮基甲基官能团能够与芳环缀合，和u是等于0或1的整数，和·R9表示与R8互补的反应性官能团，e)在存在至少一种偶联剂的情况下，使式(9)的衍生物的反应性官能团R9与式(8)的连接臂的官能团R8一起反应，以形成共价键，f)使肼或一种其衍生物在酮或醛官能团上反应，以形成腙，和g)通过合适的处理将腙转化成重氮基甲基官能团。
有利地，该合成方法还可以包括·保护化合物(9)的酮或醛官能团的补充步骤，和·使所述的酮或醛官能团去保护的后继补充步骤。
本发明还涉及标记生物分子，特别是核酸的方法，其包括在基本上水性的缓冲液中，在均质溶液中使生物分子与根据前述实施方案的试剂接触。
本发明还涉及经标记的生物分子，其可以通过根据上述的进行标记的权利要求的方法而获得。
本发明还涉及对单链或双链核酸进行标记和片段化的方法，其包括下列步骤·使核酸片段化，·借助于选自根据前述实施方案的试剂的标记试剂，将标记连接至至少一个片段上，所述试剂共价地并且主要地偶联在所述片段的至少一个磷酸上。
有利地，标记和片段化的方法借助于选自式(3)的化合物的标记试剂来实施 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，和·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基。
根据标记和片段化的方法的第一个实施变化形式，片段化和标记以两个步骤实施。
根据标记和片段化的方法的第二个实施变化形式，片段化和标记以一个步骤实施。
不论采用何种标记和片段化的方法，标记在基本上水性的均质溶液中进行。
不论采用何种标记和片段化的方法，片段化通过酶的、物理的或化学的方法来进行。
本发明还涉及所有经标记的核酸，其可以通过前述的标记和片段化的方法而获得。
本发明还涉及检测靶核酸的试剂盒，其包含如上所定义的经标记的核酸。
本发明还涉及在其上固定至少一种如上所定义的试剂的固体支持物。
最后，本发明涉及捕获核酸分子的方法，其包括下列步骤
·提供固体支持物，其上直接或间接地固定有至少一种前面定义的生物分子，或者也是前面定义的核酸，所述生物分子或核酸含有重氮基甲基官能团，·与可能含有游离核酸的生物样品接触，和·洗涤固体支持物，其中所述分子至少以共价方式连接至核酸。
“多聚体结构”意指由化学或生物合成子的重复单元形成的聚合物。实例可提及专利申请WO-A-02/090319的说明书的实施例34.2。如果本领域技术人员发现下文中所显示的信息不足以完全地理解这一主题，请参考该文献。可在本发明中使用的这样的结构的许多变体是已知的，例如·线性聚合物(EP-A-0.561.722、EP-A-0.669.991)，·分枝的聚合物(WO-A-01/92361)，·颗粒(particules)(EP-A-0 827 552)，·树状聚合物(US-A-4,507,466；US-A-4,568,737；US-A-6,083,708)，·多核苷酸，和·多肽。
如果证实是需要的，本领域技术人员还可以参考这些文献以完整地理解这一主题。
“可检测的标记”意指至少一种能够直接或间接地产生可检测的信号的标记。这些标记的非限制性列表如下·产生例如通过比色法、荧光、发光可检测的信号的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，·生色团，例如荧光、发光、染料化合物，·具有通过电子显微镜可检测的电子密度的基团，或者通过其电特性如电导率、电流分析、电量测量、阻抗可检测的基团，·可检测的基团，例如该基团的分子足够大以引入其物理和/或化学特征的可检测的修饰，这种检测可以通过光学方法如衍射、表面等离子体子共振、表面变化、接触角的变化，或者物理方法如原子场光谱学、隧道效应来进行，
·放射性分子，例如32P、35S或125I。
优选地，该标记不是放射性标记，以避免与这些标记相关的安全问题。
在本发明的一个特殊实施方案中，所述标记是可以提供电化学方法检测的，特别地，所述标记是铁的络合物的衍生物，如二茂铁。
还可以使用间接的系统，例如能够与抗-配体反应的配体。配体/抗-配体对是本领域技术人员所熟知的，其例如为下列对的情况生物素/链霉抗生物素蛋白、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/该多核苷酸的互补序列。在这种情况下，配体具有重氮基甲基反应性官能团。抗-配体可以通过前面段落中所描述的标记直接进行检测，或者可以通过另一个配体/抗-配体对而自身进行检测。这种堆叠系统在实施例中进行了阐述。
间接系统的另一个实例使用配体和抗-配体之间的特定的共价键，例如甲基酮和烷氧基胺。此系统的实例描述在专利申请WO-A-00/40590和WO-A-98/05766中。这些间接检测系统在某些情况下能够引起信号扩增，关于使用聚合物的化学扩增可参考先前的专利申请WO-A-00/07982、WO-A-01/92361和WO-A-95/08000，关于通过堆叠的化学扩增系统可参考申请WO-A-01/44506。
在信号扩增的一个特殊方式中，在标记试剂上存在至少两个标记。
在本发明的一个优选实施方案中，示踪剂是具有小的位阻的荧光化合物，例如荧光素，六氯荧光素(HEX)，丹磺酰(edans)，罗丹明，四甲基罗丹明(5或6-TAMRA)，羧基-X-罗丹明(ROX)，NIR型的生色团(LI-COR Inc，Lincoln NE，USA)，花青类如Cy5和Cy3的衍生物(Randolph J.B.等人，Nucleic Acids Res.，25(14)，p2923-2929，1997)，特别是Cy5的衍生物，或者示踪剂是具有小的位阻的半抗原，例如生物素，联硝基苯(dinitrohenyle)，或松香烷的衍生物(参见申请WO-A-00/07982)。“小的位阻”意指分子量低于1000g/mole。
在荧光团的情况下，优选地，用其发射波长大于450nm，优选大于600nm的荧光团进行工作。
在示踪剂为自身不能产生信号的半抗原如生物素的情况下，检测通过如上所述经标记的抗-配体的识别来进行。在生物素的情况下，优选使用偶联了荧光化合物如荧光素、Cy5或藻红蛋白的链霉抗生物素蛋白或抗-生物素抗体。在松香烷的情况下，使用如专利申请WO-A-00/07982中所述的单克隆抗体。
特别地，本发明的标记试剂在极性溶剂如DMF、DMSO、CH3CN、THF、DMA(二甲基乙酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮)、DME(二甲氧基乙烷)中是可溶的。
优选地，标记试剂在DMSO或水中是可溶的。
“可与水混溶的溶剂”意指可以以至少5体积％的比例与水或含盐的水性缓冲液混溶的溶剂。
有利地，在前述的式中，臂L含有乙二醇或聚乙二醇基序以增加试剂在水中的溶解度。
A是包含至少一个烯型双键的连接臂，其使得重氮基甲基官能团能够与芳环缀合。连接臂A具有使重氮基甲基官能团远离环的功能，以减小位阻，同时保持重氮基甲基官能团的稳定性。“缀合”意指沿着连接臂A的碳链的芳环的电子离域作用。作为实例，臂A可以具有下列结构 其中，·v是1和10之间的整数，优选v是1或2，和·R10是H或烷基，优选R10是H、甲基或乙基。
因此，这些试剂能够在均相中连接在生物分子上，所述均相由基本上水性的溶液组成，即含有至少50％的水。
“生物分子”意指具有至少一个使其能够与生物目标靶分子反应的识别位点的化合物。作为实例，例如可以提及核酸、抗原、抗体、多肽、蛋白质、半抗原这些生物分子。
术语“核酸”表示至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的链，其可选地含有至少一个经修饰的核苷酸，例如至少一个含有经修饰的碱基如肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、二甲基氨基-5-脱氧尿苷、脱氧尿苷、二氨基-2,6-嘌呤、溴-5-脱氧尿苷或者其他允许杂交的经修饰的碱基的核苷酸。该多核苷酸还可以在核苷酸间连接的水平上进行修饰，例如硫代磷酸酯、H-膦酸酯、烷基-膦酸酯，在主链的水平上进行修饰，例如α-寡核苷酸(FR 2 607 507)或PNA(M.Egholm等人，J.Am.Chem.Soc.，114，1895-1897，1992)或2′-O-烷基核糖。核酸可以是天然的或合成的，可以是寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖体RNA、信使RNA、转运RNA、通过酶促扩增技术获得的核酸，所述酶促扩增技术例如为·PCR(聚合酶链反应)，描述于专利US-A-4,683,195、US-A-4,683,202和US-A-4,800,159中，和其衍生形式RT-PCR(逆转录PCR)，尤其是一步形式的RT-PCR，如描述于专利EP-B-0.569.272中，·LCR(连接酶链反应)，例如公开于专利申请EP-A-0.201.184中，·RCR(修复链反应)，描述于专利申请WO-A-90/01069中，·3SR(自动维持序列复制)，见专利申请WO-A-90/06995，·NASBA(基于核酸序列的扩增)，见专利申请WO-A-91/02818，·TMA(转录介导的扩增)，见专利US-A-5,399,491，和·RCA(滚环扩增)(US-6,576,448)。
因此，“扩增子”用于表示通过酶促扩增技术产生的核酸。
这些修饰的每一个可以组合采用，只要核酸中存在至少一个磷酸酯。
“多肽”意指至少两个氨基酸的链。
“氨基酸”意指·编码蛋白质的基本氨基酸，·在酶促作用之后衍生的氨基酸，例如反-4-羟基脯氨酸，·天然的但不存在于蛋白质中的氨基酸，例如正缬氨酸、N-甲基-L亮氨酸、staline(参见Hunt S.，Chemistry and Biochemistry of theamino acids，Barett G.C.，ed.，Chapman and Hall，London，1985)，和·由可用于固体支持物上或液相中的合成的化学官能团所保护的氨基酸，和非天然氨基酸。
术语“半抗原”表示非免疫原性的化合物，即其自身不能通过抗体生成来促进免疫反应，但是能够被通过在已知条件下免疫动物，特别是通过用半抗原-蛋白质缀合物进行免疫而获得的抗体识别。这些化合物的分子量通常小于3000Da，最常见小于2000Da，它们可以例如为糖基化的肽、代谢物、维生素、激素、前列腺素、毒素或各种药物、核苷和核苷酸。
术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体、通过基因重组获得的抗体、和抗体片段如Fab或F(ab’)2片段。
术语“抗原”表示可以产生抗体的化合物。
术语“蛋白质”包括全蛋白质和异蛋白质如核蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金属蛋白和糖蛋白，这些蛋白质为纤维状或球状并且以它们特征性的构象形式存在。
有利地，生物分子具有磷酸基团，即具有至少一个下述基序 或 其或者天然存在于生物分子中，或者可以例如通过化学或酶促修饰而引入。对于蛋白质的化学修饰的实例在″Chemistry of proteinconjugation and cross linking"，S.S.Wong，CRC Press，1991中提供。
优选地，所述生物分子是核酸。
本发明的某些有利的试剂为a)式(10)
b)式(11) c)式(12) 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和·n是等于0或1的整数。
优选地，标记试剂具有下式a)式(13) b)式(14) c)式(15)
其中R1表示甲基或苯基。
不论试剂的实施方案和变化形式如何，L可以包含基序-(NH-CH2-CH2)-，其重复1-20次，优选1-10次，更优选2-5次。
“肼的衍生物”意指具有NH2-NH-官能团的分子。甲苯磺酰基肼是这样的衍生物的一个实例。
腙转化成重氮基甲基通过常用的方法，特别是通过用MnO2氧化而实现。
也可以使用其他方法，如下列文献中所描述的X.Creary，OrganicSyntheses，WileyNew York，Coll.Vol.VII，p438-443，1990；H.Zollinger，Diazo Chemistry II，VCH，Weinheim，p34-47，1995；T.L.Holton和H.Shechter，J.Org.Chem.，60，4725-4729，1995。
在使用衍生物甲苯磺酰基肼的情况下，方法描述于X.Creary，Organic Syntheses；WileyNew York，Coll.Vol.VII，p438-443，1990中。
在这些合成方法的任一种的特殊实施方案中，所述方法包括·保护化合物(9)的酮或醛官能团(在R1为H的情况下)的补充步骤，和·使所述的酮或醛官能团去保护的后继补充步骤。
所述保护例如可通过缩醛基团来实现。去保护通过合适的手段来进行，例如对于缩醛在酸性介质中。本领域技术人员会根据化合物而确定在合成过程的哪一个步骤处实施保护和去保护这两个步骤。
在信号扩增的情况下，合成方法类似于前述方法。标记前体可以具有下面的式(17) 其中，GP1和GP2表示相同或不同的胺官能团保护基团，和p是1和10之间的整数，有利地2和6之间的整数，优选4。有利地，GP1和GP2是不同的，以便能够加入多个基序，如在下文中所解释的。
可用于本发明的保护基团GP1或GP2的实例在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版，JohnWiley and Sons，New York，1991中提供，优选通常在肽合成中使用的那些，例如Boc(叔丁氧基羰基)、Fmoc(9-芴基亚甲基氧基羰基)、Cbz(羧基苄基)或Alloc(烯丙氧基羰基)。
特别地，GP1和GP2分别为保护基团Boc和Fmoc。
在存在偶联剂的情况下，进行具有羧基官能团的该前体与式(18)的衍生物(见下式)之间的反应，以形成酰胺键， 在这两个保护基团之一的常用条件下，例如对于Fmoc使用碱如哌啶，进行去保护，在去保护之后，使用游离的胺官能团用于偶联另一个式(17)的分子。该过程重复根据需要的次数，以获得大量由保护基团如Boc官能团保护的NH2官能团。以重复1-100次，优选1-20次加入基序。
使肼在来自衍生物二苯酮的酮官能团上反应以形成腙，然后在MnO2存在下进行氧化以形成重氮基甲基残基。然后，在将具有Boc基团的胺官能团去保护之后，将示踪剂如通过N-羟基琥珀酰亚胺基团活化的生物素偶联至胺官能团上，以产生其中的基序R2-(L)n-如式(5)所示的试剂。
本发明的另一个目标是描述一种用于标记生物分子(特别是核酸)的方法以及通过该方法获得的产物，该方法包括在基本上水性的均质溶液中，在溶液中使生物分子与根据本发明的标记试剂接触。
“基本上水性的溶液”意指含有至少50％的水的溶液。该溶液优选含有盐，如缓冲溶液。
“均质溶液”意指单相的溶液，例如水/DMSO溶液，而不是两相的溶液，例如水/氯仿溶液。标记反应的具体条件根据生物分子和标记而有所不同。关于核酸，5和8之间的pH使得能够进行有效的标记。特别地，5.5和7.0之间的pH对于本发明的全部试剂都是优选的。使用式(11)的试剂时，用于进行标记的pH范围更大。对于该试剂，3和8之间的pH可获得良好的标记效率。
该标记和片段化的方法在这样的情况下是特别有用的，即经标记的核酸必须与许多在预先确定的位置处固定在固体支持物上以形成DNA芯片的核酸(特别是寡核苷酸)杂交。“DNA芯片”意指小尺寸的固体支持物，在其上于预先确定的位置处固定有捕获探针。事实上，固定在固体支持物上的核酸的密度在杂交期间造成显著的空间阻碍，和片段化使得能够改善这一杂交步骤。这些DNA芯片的实例例如提供在下列出版物中G.Ramsay，Nature Biotechnology，16，p40-44，1998；F.Ginot，Human Mutation，10，p1-10，1997；J.Cheng等人，Molecular diagnosis，1(3)，p183-200，1996；T.Livache等人，NucleicAcids Research，22(15)，p2915-2921，1994；J.Cheng等人，NatureBiotechnology，16，p541-546，1998。
片段化和标记以一步或者以两步进行，和标记可以无区别地于片段化之前、之后或同时进行。
优选地，标记和片段化同时进行，即将这两个步骤所需的试剂与例如核酸在基本上水性的均质溶液中混合在一起。对于化学或酶促片段化的情况尤其是如此。在通过物理手段进行机械片段化的情况下，“标记和片段化同时进行”是指将物理手段施加于基本上水性的均质溶液，该溶液至少含有核酸和标记试剂。
核酸的片段化通过酶促、化学或物理方式来进行。
例如通过核酸酶来实现核酸的通过酶促方式的片段化。
例如通过超声处理或辐射来实现核酸的通过物理方式的片段化。
如果核酸是RNA，通过常用的方法(参见例如Oivanen M.等人，Chem.Rev，98，961-990，1998)来实现通过化学方式的片段化。
金属络合物可用于DNA或RNA的片段化，例如在G.Pratviel等人的综述，Adv.Org.Chem.，45，p251-312，1998，或G.Pratviel等人的综述，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，34，p746-769，1995中所述的那些。
在第一个实施方案中，RNA的化学片段化通过与或不与化学催化剂联合的金属阳离子来进行。在这种情况下，金属阳离子为Mg2+、Sr2+、Ba2+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Ru3+、Ce3+、Eu3+、Tb3+、Tm3+、Yb3+或Lu3+离子，化学催化剂的组成为咪唑，取代的类似物如N-甲基-咪唑，或者任何具有对于RNA的亲和力和带有咪唑核的化学分子或取代的类似物。借助于金属的片段化的条件充分地描述于专利申请WO-A-99/65926中。有利地，金属为Mg2+、Mn2+、Zn2+、Tb3+或Ce3+，优选Mg2+、Mn2+、Zn2+。
有效的片段化条件为，2-100mM的金属阳离子如Mn++浓度，2-100mM的咪唑浓度。
特别有效的条件为，3-15mM的阳离子如Mn++浓度，20-50mM，特别是30mM的咪唑浓度。
反应的pH必须是微碱性的。有利地，pH为8.5-9，这代表了对于用RNA进行标记和片段化组合非常有益的折衷方案。
在第二个实施方案中，RNA的化学片段化通过多胺如精胺、腐胺或尸胺的作用来进行。5-100mM的浓度使得能够进行片段化。从10mM的多胺开始，片段化是完全的。
在第三个实施方案中，RNA的化学片段化通过人工核酸酶(参见G.Pratviel等人，Adv.Inorg.Chem.，45，p251-312，1998；D.S.Sigman等人，Chem.Rev.，93，p2295-2316，1993)的作用来实现，例如与金属阳离子如铁、铜或锌联合的1，10-菲咯啉。这些阳离子分别来自溶液中的FeSO4或CuCl2或ZnCl2。对于RNA的片段化使用浓度为2-50mM的1，10-菲咯啉，特别是4-10mM。
DNA的通过化学方式的片段化通过将核酸与形成无碱基(abasique)位点的化学手段放在一起来进行。无碱基位点的形成是由于切割了连接糖2-脱氧核糖与核碱基的N-糖苷键。这涉及通过失去带负电的嘌呤(鸟嘌呤、腺嘌呤)的脱嘌呤化，或在失去带正电的嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶)的情况下的脱嘧啶化。
该脱嘌呤化在生理条件(pH 7.4，37℃)下是自发的，但是反应速度非常慢，为3×10-11脱嘌呤/秒这样的级别，即不能用于有效的片段化。为了加快反应速度，使用使得N-糖苷键变得不稳固的烷基化试剂，或者对于整合有尿嘧啶的DNA使用尿嘧啶-DNA糖基化酶(glycosilase)。
通过脱嘌呤或脱嘧啶获得的无碱基位点是非常不稳定的。在碱性介质中于环境温度下获得了在该位点水平上的片段化。在酸性介质中，升高温度也可以加速该片段化。使用能够起始β-消除现象的分子也可加速此片段化。
片段化的优选实施方案是通过使用酸性pH，即低于5的pH而获得的。有利地，pH为3。
pH为3的甲酸钠缓冲液使得能够根据本发明有效地进行片段化。该缓冲液与一步标记的条件是相容的，如将在实施例中所证明的。更有利地，使用酸性介质(HCl、碳酸盐、H2SO4)。
在本发明的一个特殊的实施方案中，意欲进一步增强片段化，脱氧核糖核酸含有至少一个可以更容易地产生无碱基位点的经修饰的碱基。
可以使用多种经修饰的碱基，例如N7-烷基嘌呤、N3-烷基嘌呤、O6-烷基嘌呤、8-溴嘌呤、8-硫代嘌呤、8-烷基硫代嘌呤、8-叠氮基嘌呤或8-烷基磺酰基嘌呤。
当待标记的核酸通过酶促扩增技术如PCR来产生时，使用8-溴嘌呤使得能够在扩增过程中获得有效的整合，这同样有助于本发明的片段化和标记方法，同时保持对于酶促扩增步骤的优异的灵敏度。
本发明描述了经标记的生物分子，特别是经标记的核酸，其可以通过根据本发明的方法中的任一种方法而获得。
本发明还涉及检测生物分子，特别是靶核酸的试剂盒，其包含根据本发明的标记试剂。根据试剂盒的应用，在该试剂盒中还整合了其他元件，例如裂解(微生物和/或细胞)的手段和/或浓缩的手段(例如二氧化硅或磁性颗粒)和/或酶促扩增的手段。
本发明涉及如上所述的经标记的生物分子，特别是经标记的核酸的用途，其用作检测靶生物分子，特别是靶核酸的探针。
本发明还涉及如上所述的核酸的用途，其用作能够结合至捕获探针的经标记的靶标。
为了能够检测和/或定量和/或纯化靶生物分子，经标记的生物分子能够与靶生物分子形成复合物。作为实例，为了证明核酸类型的靶分子，经标记的核酸以足够的程度与靶标互补，以便根据反应条件，特别是反应介质的温度和盐浓度而特异地杂交。
该检测方法可用于测序，信使RNA的表达特性图谱的绘制，或为了研究目的的突变的筛选，以及在制药工业中筛选药物，传染性或遗传性疾病的诊断，食品或工业的控制。
在诊断方面，特别是诊断传染性疾病(例如AIDS或结核病)，趋势是降低灵敏度水平，直至可检测样品中的单个分子，所述样品在抽取血液或尿液类型的液体或者脑脊液的情况下可以为几个毫升。如果从取样开始至给出结果的所有步骤都进行了优化，也仅能获得该灵敏度水平。本发明的多种手段使得能够毫无困难地实现这一优化，因为本发明的试剂、方法和过程可以以非常广泛的方式应用于各种不同的生物分子。特别是在需要酶促扩增步骤以获得所需的灵敏度(病毒或细菌感染，如HIV、HCV或结核病)的情况下，如本发明所述的，标记和/或片段化的方法使得能够不影响扩增技术的灵敏度，这或许是因为不需要替换在酶促扩增技术中所用的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或许是因为整合入的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸不改变灵敏度。
从反应性和特异性的观点来看，本发明所述的接枝(greffage)化学具有这样的特征，下面描述了其他应用·在第一个实施方案中，该接枝化学用于将核酸共价固定在固体支持物上。
·在该方法的第一个变化形式中，在化学合成过程中引入重氮基甲基官能团的前体例如前述的酮或肼，和在第二个步骤中将重氮基甲基官能团引入至核酸上。
·在该方法的第二个优选变化形式中，将重氮基甲基官能团引至固体支持物上，并借助于核酸的磷酸，特别是末端(5′或3′)磷酸，将核酸固定在固体支持物上。
核酸的3′或5′末端的磷酸的引入是熟知的(参见"Protocols forOligonucleotides and Analogs，Synthesis and Properties″，S.Agrawal编，Humana Press，Totowa，New Jersey)。
在这样的固体支持物的一个特殊实施方案中，将具有配体，特别是半抗原如生物素或松香烷的标记试剂结合在固体支持物上，在所述固体支持物上以共价方式或通过吸附结合有抗-配体，如链霉抗生物素蛋白或抗体。这些固体支持物在现有技术中是熟知的，并且甚至可商购获得(例如微量滴定板-链霉抗生物素蛋白或胶乳-链霉抗生物素蛋白)。在此情况下，标记的功能不再允许进行检测，但允许标记试剂结合在固体支持物上。从而，重氮基甲基官能团可用于与核酸反应。式(13)、(14)、(15)的衍生物或衍生物PDAM是可用于制备这样的固体支持物的试剂的实例。单克隆抗体技术使得能够制备针对大量的标记如荧光素或Cy5的衍生物的抗体。本领域技术人员通过该固体支持物间接制备方法可以没有过多困难地运用具有本发明的标记试剂的固体支持物，在所述间接制备方法中，使用配体/抗-配体反应来将重氮基甲基官能团固定在固体支持物上。
固体支持物的第二个实施方案涉及特殊的支持物，如胶乳。多种不同的聚合方式可以用于制备具有重氮基甲基官能团的颗粒，该制备从可聚合的功能性单体开始，所述单体具有重氮基甲基官能团或者优选地具有重氮基甲基官能团的前体官能团如醛或酮，和特别地·称为“批式聚合(batch)”的封闭式反应器聚合在反应开始之前，将单体与其他成分引入反应器中，以后不再添加。由于单体的反应性的差异，该方法常常导致出现组成的偏移。这一点通过获得组成随着转化而明显发生变化的大分子而表现出来。该方法对于表面整合具有较低的有效性，因为存在很大一部分的功能性单体在颗粒内部或者以水溶性聚合物的形式而损失掉这样的风险。当与具有极性性质的单体以“分批”进行共聚时，获得了大量的更小的颗粒，但是转化有限。该行为与这些单体在水中的高溶解度有关，这归因于均相成核机制的优势。
·半连续聚合至少一部分单体在反应开始和结束之间这一段时间内引入反应器中。该再添加可以以固定的速度或者根据给定的特性来进行。目的是控制单体混合物的添加以获得具有受控的组成的共聚物(控制界面的组成)；就是这样，常常采用这样的添加条件，从而聚合的速度比添加的速度更快。
·称为“爆发式聚合(shot)”的通过延迟添加的聚合一旦进行聚合反应，就将功能性单体单独地或者在基础单体(monomère de base)存在下以受控方式引入系统中。因此，该操作的成功取决于对于共聚动力学的现有知识程度。这是促进表面整合的有效方法。实验条件(添加时的转化程度、单体混合物的组成和浓度)的选择使得能够优化表面的产率。
·种子聚合其在于将功能性单体引入含有胶乳的系统中，该胶乳已经形成并经完全地表征。功能性单体可以单独添加或者以与种子的基础单体的混合物进行添加，添加可以是一步的或半连续的。
种子聚合、通过延迟添加的聚合、半连续聚合的技术是优选的，因为它们导致最大化地在表面上引入具有重氮基甲基官能团的前体的衍生物。具有醛官能团的颗粒的实例例如提供在B.Charleux等人，DieMakromolecular Chem.，193，p 187和p.205，1992或者专利EP-B-0.350.407中。
固体支持物的第三个实施方案在于提供含有第一亲核或亲电子反应性基团例如NH2、SH、OH、O-NH2、烷基酮、醛、异氰酸盐(酯)、异硫氰酸盐(酯)、马来酰亚胺、烷基卤、N-羟基琥珀酰亚胺的酯、甲苯磺酸盐(酯)的固体支持物，然后与结合中间体反应，该结合中间体含有与固体支持物的第一反应性官能团互补的反应性官能团。固体支持物与结合中间体之间的该反应可选地在存在偶联剂的情况下进行以形成共价键。
根据上述多种不同的实施例的、含有至少一个重氮基甲基官能团的这样的固体支持物，特别是其上间接地固定有本发明的标记试剂的固体支持物，也是本发明的目标，以及含有借助于重氮基甲基官能团而固定在固体支持物上的核酸的固体支持物。
这样的固体支持物的第一种应用是制备DNA芯片。存在有将核酸于离散并预定的位置处分散在固体支持物上的方法。
专利US-A-6,110,426推荐了借助于毛细管制备这些DNA芯片的方法，其中将所述毛细管与固体表面接触以递送受控制的体积的液体。在毛细管的末端和固体支持物之间发生有效的接触，以便通过毛细作用滴上一滴。类似地，专利US-A-6,083,763描述了一套毛细管，其在装置中滑动，从而补偿它们中的每一个的高度差异。将它们与平的表面接触，以便通过毛细作用放置下特异的寡核苷酸。
专利US-A-6,083,762推荐了一种液滴分配系统，其包含与压电换能器联接的微分散器，以便将小于纳升的液滴体积喷射到固体表面上。类似的结果可以通过在毛细管壁上施加热源以形成喷射指定体积的液体的泡而获得(参见T.Okamoto等人，Nature Biotechnology，18，p438-441，2000)。
因此，重氮基甲基官能团使得能够将核酸以共价的方式接枝到支持物上。该接枝过程是简单的，连接是稳定的，尤其是相对于吸附来说，相关于末端磷酸，该反应的选择性使得能够将核酸定向偶联到固体支持物上，这就相应地有助于随后的杂交步骤，因为减小了位阻。
根据本发明的固体支持物的第二种应用是纯化核酸。
在纯化的情况下，纯化是直接的(带有重氮基甲基官能团的固体支持物与待纯化的核酸反应)或间接的(捕获核酸固定在固体支持物上)。这些捕获核酸以足够的程度与待捕获的靶标互补，以便以所希望的特异性程度进行杂交，正是“捕获核酸/固体支持物”这一复合物使得能够纯化靶核酸。
固体支持物优选为分散的形式以用于纯化，例如胶乳颗粒，如磁性颗粒。
“纯化步骤”尤其意指分离微生物的核酸与在裂解步骤中释放的细胞组分，所述裂解步骤在纯化核酸之前进行。这些裂解步骤是熟知的；作为象征性的实例，可以使用如下列专利申请中所述的裂解方法-WO-A-00/60049，超声裂解，-WO-A-00/05338，磁性和机械混合裂解，-WO-A-99/53304，电裂解，和-WO-A-99/15621，机械裂解。
本领域技术人员可以使用其他熟知的裂解方法，例如热激或渗透压震扰或用离液剂(例如胍盐)处理(专利US-A-5,234,809)。
这一步骤通常使得能够浓缩核酸。作为实例，可以使用磁性颗粒(关于这一主题请参见专利US-A-4,672,040和US-A-5,750,338)，从而通过洗涤步骤来纯化结合在这些磁性颗粒上的核酸。如果希望随后扩增所述的核酸，这一纯化核酸的步骤是特别有益的。这些磁性颗粒的一个特别有益的实施方案描述在专利申请WO-A-97/45202和WO-A-99/35500中。
本文所使用的术语“固体支持物”包括任何能够在其上固定核酸的材料。合成的材料或天然的材料，可选地经化学修饰的材料，可以用作固体支持物，尤其是多糖，例如基于纤维素的材料，例如纸、纤维素衍生物如乙酸纤维素和硝化纤维素，或者葡聚糖；聚合物，共聚物，尤其是具有苯乙烯型单体的那些，天然纤维如棉花，和合成纤维如尼龙；矿物材料，例如二氧化硅、石英、玻璃、陶瓷；胶乳；磁性颗粒；金属衍生物，凝胶等。固体支持物可以是微量滴定板、膜、颗粒或基本上平的玻璃或硅或衍生物的板的形式。
最后，本发明涉及捕获核酸的方法，其包括下列步骤·提供固体支持物，其上直接或间接地固定有至少一种含有重氮基甲基官能团的分子，·与可能含有游离核酸的生物样品接触，和·洗涤固体支持物，其中所述分子至少以共价方式连接至核酸。
补充的信息可以在本发明人的另一个专利申请WO02/090584(以2001年5月4日的优先权提交的)中找到。
所附的实施例和附图提供了特殊的实施方案，而并不能认为是限制了本发明的范围。


图1表示在本发明中使用的多种试剂的结构式以及名称的缩写(o-表示邻，m-表示间，p-表示对)图2表示m-bio-TETA-PMDAM根据其浓度的对于rpoB的信号平均值和相似性百分数。
实施例1参考试剂的合成间-BioPMDAM·间-苯乙酮生物素化合物1a将D-生物素(1.0克(g)，4.1毫摩尔(mmol))溶解在45毫升(mL)热的无水DMF中。在氩气气氛中冷却至0℃，然后依次添加N-甲基吗啉(590微升(μL)，5.33mmol)和氯甲酸异丁酯(840μl，6.60mmol)。将混合物搅拌30分钟(min)，然后加入在10mL DMF中的3-氨基苯乙酮(824mg，6.10mmol)和N-甲基吗啉(480μL，4.35mmol)。将溶液于0℃下搅拌，并保持2小时(h)，然后蒸发至干。取出残留物并置于3mL MeOH中，然后加入50mL水。过滤获得的沉淀，用水、CH2Cl2和乙醚洗涤，得到1.2g(80％)的粗产物1a。在MeOH-H2O对中重结晶，得到白色粉末状的1a(1.01g，70％)。
Mp 145℃.-IR(KBr)3280，2931，2857，1691，1590，1540，1487，1434，1298，1266cm-1.-1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝1.3-1.7(m，6H)；2.33(t，J＝8Hz，2H)；2.55(s，3H)；2.58；(d，J＝12Hz，1H)；2.83(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.13(m，1H)；4.15(m，1H)；4.31(m，1H)；6.34(s，1H)；6.41(s，1H)；7.44(t，J＝8Hz，1H)；7.64(d，J＝8Hz，1H)；7.85(d，J＝8Hz，1H)；8.17(S，1H)；10.05(S，1H).-MS(FAB/甘油)，m/z362[M+H]+.
·间-腙化合物2a将1a(500mg，1.38mmol)与肼一水合物(200μL，4.15mmol)在无水乙醇(8mL)中的溶液回流加热2h。冷却至环境温度后，过滤白色沉淀，用水洗涤，然后用乙醚洗涤，并干燥。因此获得385mg(74％)白色粉末状的产物2a。
Mp 185℃.-IR(KBr)3298，2931，2857，1698，1665，1626，1541，1494，1470，1446，1330，1265cm-1.-1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝1.3-1.7(m，6H)；1.98(s，3H)；2.26(t，J＝8Hz，2H)；2.56；(d，J＝12Hz，1H)；2.81(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.11(m，1H)；4.13(m，1H)；4.29(m，1H)；6.39(s，3H)；6.42(s，1H)；7.22(m，2H)；7.50(d，J＝8Hz，1H)；7.84(s，1H)；9.82(s，1H).-MS(FAB/甘油)，m/z376[M+H]+.
·间-重氮甲烷化合物3a将2a(180mg，0.48mmol)溶解在2mL DMF中。然后加入MnO2(340mg，3.9mmol)。在常温下搅拌30分钟后，将混合物通过含有硅藻土(厚度0.5cm)和粉末状的3_分子筛(0.5cm)的烧结漏斗过滤。将反应混合物浓缩至大约0.5mL的体积，然后加入5mL乙醚。过滤得到的沉淀，用乙醚洗涤，然后干燥。得到粉红色粉末状的化合物3a(170mg，95％)。
Mp 160℃.-IR(KBr)3278，2935，2859，2038，1704，1666，1605，1577，1536，1458，1430，1263cm-1.-1H NMR(300 MHz)δ＝1.3-1.7(m，6H)；2.11(s，3H)；2.28(t，J＝8Hz，2H)；2.57；(d，J＝12Hz，1H)；2.81(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.11(m，1H)；4.13(m，1H)；4.29(m，1H)；6.33(s，1H)；6.41(s，1H)；6.60(m，1H)；7.25(m，3H)；9.84(s，1H)).
实施例2试剂N-(3，6，9-三胺壬基)-生物素酰胺(Bio-TETA)(1)的合成将D-生物素(2.80g，11.40mmol)溶解在30mL无水DMF中。加入羰基二咪唑(1.5当量；2.78g)，几分钟后形成沉淀。活化30分钟后，将得到的悬浮液小心地加至三亚乙基四胺(2当量；5.00g)在20mL DMF中的悬浮液之中。反应在60℃的油浴中进行2h。
通过在硅胶上的快速色谱法纯化产物，使用CH2Cl2/MeOH/NH4OH 20∶80∶3作为洗脱剂。蒸发浓缩的级分后，获得1.94g白色粉末状的产物(46％)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝7.75(s，1H，-NH-CO-)；6.40(d，2H，-NH-biot)；4.30(t，1H，-CH-biot)；4.15(d，1H，-CH-biot)；3.30(m，12H，-CH2-NH-)；3.11(m，1H，-CH-S-)；2.8(dd，2H，-CH2-S-)；2.55(m，5H，-NH-CH2-&-NH2)；2.04(t，2H，-CH2-CO-)；1.52(m，6H，-CH2-).
N-(3’-乙酰苯基)-琥珀酰胺(ACBA)(2)将3-氨基苯乙酮(5.0g；37mmol)在氩气气氛中溶解在50mL无水乙腈中。加入琥珀酸酐(1.3当量；4.62g)，并在氩气气氛中反应1小时。产物2以沉淀的形式出现。在沉淀经过过滤并用乙醚洗涤之后，获得7.29g白色粉末(84％)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝12.10(s，1H，-OH)；10.17(s，1H，-NH-)；8.19(s，1H)；7.82(d，1H)；7.66(d，1H)；7.50(t，1H)；2.56(m，7H，-(CH2)2-和-CH3).
N-(3’-乙酰苯基)-N’-(3，6-二胺-9-生物素酰基氢基壬基)-琥珀酰胺 (Bio-(TETA)-AP)(3)将ACBA(2)(1.03g；4.39mmol)在氩气气氛中溶解在20mL无水DMF中。在冰上冷却该介质，并依次加入N-甲基吗啉(1.25当量；725μL)和氯甲酸异丁酯(1当量；690μL)介质在30分钟后变混浊。同时，将Bio-TETA(1)(0.8当量；1.94g)在热的条件下溶解在50mLDMF和三乙胺(0.8当量；750μL)中。将其加入在0℃活化30分钟的ACBA中。然后在环境温度下静置过夜。纯化通过硅胶上的快速色谱法来进行，使用CH2Cl2/MeOH/NH4OH 85∶30∶3作为洗脱剂。合并含有产物3的级分，并蒸发掉溶剂。获得1.01g片状的白色固体(33％)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝10.16(s，1H，Ph-NH-CO-)；8.18(s，1H)；7.97(s，1H，-CO-NH-CH2-)；7.80(d，1H)；7.85(s，1H，-CH2-NH-CO-)；7.60(d，1H)；7.43(t，1H)；6.38(d，2H，-NH-biot)；4.3(t，1H，-CH-biot)；4.10(d，1H，-CH-biot)；3.35(m，12H，-CH2-NH-)；3.10(m，1H，-CH-S-)；2.80(dd，2H，-CH2-S-)；2.60(s，4H，-CH2-CO-)；2.55(s，3H，-CO-CH3)；2.50(m，2H，-CH2-CH2-CO-)；2.15(m，2H，-NH-)；1.40(m，6H，-CH2-).
N-[3’-(1-亚肼基-乙基)苯基]-N’-(3，6-二胺-9-生物素酰基氨基壬基)-琥珀酰胺(Bio-(TETA)-Hv)(4)将Bio-(TETA)-AP(3)(1.0g；1.71mmol)悬浮在25mL热的(60℃)乙醇中。在回流情况下，加入肼一水合物(9当量；750μL)。让反应在回流条件下进行2h，然后在冰上冷却。短时间后形成了沉淀。分离两相，并将沉淀置于真空中。获得690mg絮状固体(68％)。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.95(s，1H，Ph-NH-CO-)；8.0(s，1H，-CO-NH-CH2-)；7.90(s，1H)；7.80(s，1H，-CH2-NH-CO-)；7.5(d，1H)；7.28(m，2H)；6.41(s，1H，-NH-biot)；6.36(d，3H，-NH-biot & -NH2)；4.64(t，1H，-CH-biot)；4.30(d，1H，-CH-biot)；3.43(m，12H，-CH2-NH-)；3.12(m，1H，-CH-S-)；2.80(dd，2H，-CH2-S-)；2.60(s，4H，-CH2-CO-)；2.50(s，3H，-CO-CH3)；2.10(m，2H，-CH2-NH-CH2-)；1.50(m，6H，-CH2-).
N-[3’-(1-重氮基-乙基)苯基]-N’-(3，6-二胺-9-生物素酰基氨基壬基)-琥珀酰胺(m-Bio-(TETA)-PMKAM)(5)
在氩气气氛中，将Bio-(TETA)-Hy(4)(150mg；250.4μmol)溶解在1mL无水DMSO中。与MnO2(s)(15当量；330mg)反应30分钟，然后在含有硅藻土(厚度0.5cm)和3_分子筛(厚度0.5cm)的烧结漏斗上过滤。100μL用于NMR，其中添加380μL DMSO-d6和20μL甲醇-d4。用无水DMSO和4％甲醇调节终体积为4.5mL。在工具箱(une boite àgants)中，于氩气气氛下等分成250μL的等分试样。化合物是品红色的。通过1H NMR和UV-可见光(UV-vis)分光光度测定法(重氮基甲基的吸收峰在516nm)检查纯度(重氮基甲基含量)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝9.93(s，1H，Ph-NH-CO-)；7.3(s，3H，H芳族)；6.6(s，1H，H芳族)；6.4(s，1H，-NH-biot)；6.3(s，1H，-NH-biot)；4.3(t，1H，-CH-biot)；3.3(m，12H，-CH2-NH-)；3.3(m，1H，-CH-S-)；2.9(dd，2H，-CH2-S-)；2.5(4H，-CH2-CO-)；2.1(s，3H，-CH3)；2.0(m，2H，-CH2-NH-CH2-)；1.50(m，6H，-CH2-).
实施例3核酸DNA和RNA的制备实施例3.1DNA扩增子的制备采用来自Roche的Fast Start试剂盒，使用0.2mM的每种脱氧核糖核苷酸(d-ATP、d-CTP、d-GTP、d-TTP)、0.3μM的引物和0.4μL的酶，从结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)16S基因组DNA靶标(10+4拷贝作为起始靶标)开始通过PCR产生DNA扩增子。
PCR的参数如下-95℃4分钟，然后35个循环(95℃30秒；55℃30秒；72℃30秒)，然后4℃。
通过琼脂糖凝胶电泳(1.5％，TBE 0.5X)来定量分析扩增子。加载的体积为5μL，迁移在100伏特(V)进行20分钟。PCR产物的显像在用溴化乙锭染色后于UV灯下进行。
分枝杆菌的培养、提取条件，以及扩增引物在专利申请WO-A-99/65926中提供。
实施例3.2转录的RNA的制备从PCR靶标(结核分枝杆菌的16S RNA的片段)开始进行转录，其使用来自Ambion的MEGAscript试剂盒7.5mM的每种核苷酸(ATP、CTP、GTP和UTP)和2μL的酶(RNA聚合酶)。温育时间为3小时(h)，于37℃。PCR的扩增引物具有T3或T7聚合酶启动子，如申请WO-A-99/65926或文章J.Clin Microbiol.37(1)，p49-55，1999中所述的，其使得能够实现扩增。
通过琼脂糖凝胶电泳(1.5％；TBE 0.5X)来分析转录物。加载的体积为5μL，迁移在100V进行20分钟。转录物的显像在用溴化乙锭染色后于UV灯下进行。
从本发明的观点来看，相同的结果可以使用其他扩增技术如NASBA或TMA来获得，这些扩增技术直接产生RNA扩增子。
权利要求
1.式(0)的温度稳定的标记试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，·A是包含至少一个共价双键的连接臂，其使得重氮基官能团能够与芳环缀合，和u是0和2之间的整数，优选0或1，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，和·p是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数。
2.根据权利要求1的式(1)的标记试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，和·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·m是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，和·p是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数。
3.根据权利要求1或2中任一项的试剂，其特征在于p小于或等于m。
4.根据权利要求1-4中任一项的式(2)的试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，和·q是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数。
5.根据权利要求1-4中任一项的式(3)的试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，和·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基。
6.根据权利要求5的试剂，其特征在于R2由式(4)的D-生物素残基组成
7.根据权利要求1-6中任一项的试剂，其特征在于R1由CH3组成，以及R3和R4每一个均表示H。
8.根据权利要求1-7中任一项的试剂，其中结构-(L)n-由下列组成·精胺或N，N′-双(3-氨基丙基)-1，4-二氨基丁烷NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，或·亚精胺或N-(3-氨基丙基)-1，4-丁二胺H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，或·含有丙氨酸基序NH2-CH2-CH2-COOH的衍生物。
9.式(6)的温度稳定的标记试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，·A是包含至少一个共价双键的连接臂，其使得重氮基官能团能够与芳环缀合，和u是0和2之间的整数，优选0或1，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，和·p是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数。
10.根据权利要求9的式(7)的标记试剂 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，和·p是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数。
11.根据权利要求1-10中任一项的试剂，其特征在于L包含基序-(O-CH2-CH2)-，其重复1-20次，优选1-10次，更优选2-5次，那么-Z-表示为-NH-、-NHCO-或-CONH-。
12.根据权利要求1-11中任一项的标记试剂的合成方法，其包括下列步骤a)提供具有反应性官能团R6的标记或标记前体，b)提供式(8)的连接臂R7-(Z-(CH2)p)m-R8，其中，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，·p是1和10之间的整数，优选1和3之间的整数，·R7和R8表示相同或不同的两个反应性官能团，c)在存在至少一种偶联剂的情况下，使所述标记或标记前体的反应性官能团R6与式(8)的连接臂的官能团R7一起反应，以形成共价键，R6和R7是互补的，d)提供式(9)的衍生物 其中，·R1表示H或者烷基或芳基或取代的芳基，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·A是包含至少一个共价双键的连接臂，其使得重氮基甲基官能团能够与芳环缀合，和u是等于0或1的整数，和·R9表示与R8互补的反应性官能团，e)在存在至少一种偶联剂的情况下，使式(9)的衍生物的反应性官能团R9与式(8)的连接臂的官能团R8一起反应，以形成共价键，f)使肼或一种其衍生物在酮或醛官能团上反应，以形成腙，和g)通过合适的处理将腙转化成重氮基甲基官能团。
13.根据权利要求12的合成方法，其特征在于该方法包括·保护化合物(9)的酮或醛官能团的补充步骤，和·使所述的酮或醛官能团去保护的后继补充步骤。
14.标记生物分子，特别是核酸的方法，其包括在基本上水性的缓冲液中，在均质溶液中使生物分子与根据权利要求1-11中任一项获得的试剂接触。
15.经标记的生物分子，其可以通过根据权利要求14的方法而获得。
16.对单链或双链核酸进行标记和片段化的方法，其包括下列步骤·使核酸片段化，·借助于选自根据权利要求1-11中任一项获得的试剂的标记试剂，将标记连接至至少一个片段上，所述试剂共价地并且主要地偶联在所述片段的至少一个磷酸上。
17.根据权利要求16的方法，其特征在于所述标记试剂选自式(3)的化合物 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可检测的标记或者通过至少一个多聚体结构而相互连接的至少两个可检测的标记，·L是包含至少两个共价键的直链的连接臂，和n是等于0或1的整数，和·R3和R4彼此独立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R为烷基或芳基。
18.根据权利要求16或17中任一项的方法，其特征在于片段化和标记以两个步骤实施。
19.根据权利要求16-17中任一项的方法，其特征在于片段化和标记以一个步骤实施。
20.根据权利要求18-17中任一项的方法，其特征在于标记在基本上水性的均质溶液中进行。
21.根据权利要求16-20中任一项的方法，其特征在于片段化通过酶的、物理的或化学的方法来进行。
22.经标记的核酸，其可以通过根据权利要求16-21中任一项的方法而获得。
23.检测靶核酸的试剂盒，其包含根据权利要求22的经标记的核酸。
24.固体支持物，其上固定根据权利要求1-11中任一项的试剂。
25.捕获核酸的方法，其包括下列步骤·提供固体支持物，其上直接或间接地固定有至少一种根据权利要求15的生物分子，或者根据权利要求22的核酸，所述生物分子或核酸含有重氮基甲基官能团，·与可能含有游离核酸的生物样品接触，和·洗涤固体支持物，其中所述分子至少以共价方式连接至核酸。
全文摘要
本发明涉及具有式(0)的温度稳定的标记试剂，其中R
文档编号G01N33/58GK1938329SQ200580009785
公开日2007年3月28日 申请日期2005年3月24日 优先权日2004年3月26日
发明者A·拉尤恩, E·伯纳尔-门德兹 申请人:拜奥默里克斯公司