专利名称：作为PPARδ调节标志的PDK的制作方法
过氧化物增殖物激活受体(PPAR)是核激素受体超家族成员。PPAR是调节基因表达和控制多种代谢途径的配体激活型转录因子。已描述了三种PPAR亚型，它们是PPARα、PPARδ(也称作PPARβ)和PPARγ。PPARδ是普遍表达的。PPARα主要表达于肝、肾和心脏。至少有两种主要的PPARγ的同工型。PPARγ1在大多数组织中表达，而另一个更长的同工型PPARγ2近乎专一性的在脂肪组织中表达。PPAR调节多种生理反应，其包括葡萄糖稳态和脂类稳态和代谢的调节、能量平衡、细胞分化、炎症和心血管事件。
接近半数的冠状动脉疾病患者的血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度低。在约25年前首次强调了HDL的抗动脉粥样硬化功能，并且激起了对影响HDL水平的遗传和环境因素的研究。HDL的保护性功能来自它在胆固醇逆向转运过程中的作用。HDL介导了从外周组织细胞，包括动脉壁的动脉粥样硬化损伤中的那些细胞移走胆固醇。随后，HDL将其中的胆固醇递送到肝脏和固醇代谢器官，以便使其转化为胆汁和清除。来自Framingham的研究数据显示，HDL-C水平是患冠状动脉疾病风险的预示，该患病风险不依赖于LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)水平(Gordon等人，Am.J.Med.1977，62，707-714)。据估计，在HDL-C小于35mg/dl的20岁及20岁以上的美国人当中，年龄调整的患病人数是16％(男性)和5.7％(女性)。目前，可以使用多种制剂中的烟酸治疗实现HDL-C的实质性增长。然而，相当大的副作用限制了该方法的治疗潜力。
在美国，被诊断为2型糖尿病的1400万患者中，有90％的人超重或肥胖，而且高比例的2型糖尿病患者脂蛋白浓度异常。总胆固醇＞240mg/dl的患病人数在男性糖尿病患者中是37％，在女性中是44％。对于LDL-C＞160mg/dl患病人数，男女患者的各自比率分别是31％和44％，对于HDL-C＜35mg/dl，分别是28％和11％。糖尿病是由于对胰岛素作用的响应发生部分损伤导致患者对血液中葡萄糖水平的控制能力下降的疾病。II型糖尿病(T2D)又称为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，在发达国家80-90％的糖尿病患者为II型糖尿病。在T2D中，胰腺的郎格汉岛持续产生胰岛素。然而，胰岛素作用的靶器官(主要是肌肉、肝脏和脂肪组织)对胰岛素刺激表现出完全的抗性。身体通过产生非生理性高水平的胰岛素持续补偿，在疾病晚期由于胰腺的胰岛素产生能力耗尽和衰退使胰岛素水平最终下降。因此T2D是伴有包括胰岛素抵抗、血脂异常、高血压、内皮细胞功能异常和炎性动脉粥样硬化在内的多种共病的心血管代谢综合征。
用于血脂异常和糖尿病的一线治疗通常包括低脂和低糖饮食、运动和减轻体重。然而，顺应性可以是适度的，随着疾病发展，需要使用诸如用于血脂异常的他汀类和贝特类脂调节剂和诸如用于胰岛素抵抗的磺酰尿或二甲双胍的低血糖药物治疗多种代谢缺陷。近来引入的一类有前景的新药能够恢复患者对其自身胰岛素的敏感性(胰岛素致敏剂)，由此使血糖和甘油三酯水平恢复正常，并且在很多情况下避免或减少对外源胰岛素的需要。吡格列酮(ActosTM)和罗格列酮(AvandiaTM)属于噻唑烷二酮(TZD)类PPARγ激动剂并且是该类药物中第一个在多个国家获准用于治疗NIDDM的药物。然而，这些化合物受到包括少见但严重的肝毒性(如使用曲格列酮所见)在内的副作用的影响。它们还会增加患者体重。因此，急需新的、更有效的并且具有更高的安全性和更低的副作用发生率的药物。近来研究提供证据表明，PPARδ的激动作用将使化合物具有提高的治疗潜力(即此类化合物应该能够改善脂谱)、与当前所用治疗相比对HDL-C增加具有更好的影响以及对胰岛素水平正常化具有额外积极的影响(Oliver等人；Proc Nat Acad Sci USA 2001；985306-11)。新近观察还表明，PPARδ激动剂除了具有众所周知的降低甘油三酯的功能之外，还对胰岛素致敏具有不依赖于PPARα介导的的影响(Guerre-Millo等人；J BiolChem 2000；27516638-16642)。因此，选择性的PPARδ激动剂或具有额外的PPARα活性的PPARδ激动剂具有更好的治疗功效而没有在使用PPARγ激动剂时所出现的体重增加的副作用。
本发明涉及PPARδ调节的标志以及用于诊断与PPARδ活性调节异常相关疾病的方法、用于监测对患有PPARδ活性调节异常相关疾病的患者的治疗情况的方法和用于鉴定调节PPARδ活性的化合物的方法。
编码丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4(PDK4)的基因被鉴定为PPARδ的直接靶基因，而且该基因可以用作PPARδ的生物标志。PDK4涉及对禁食的代谢反应。
PDK4曾经作为PPARα的靶基因被描述过(Sugden等人，Diabetes.2001；50(12)2729-2736)。然而新近研究提出，在某些组织和细胞中PPARδ对PDK4基因的作用至少与PPARα同样大。特别是在肌细胞中PDK4基因主要由PPARδ激活。
本发明提供PDK4用作检测或监测PPARδ调节的标志的用途。优选地，PDK4用作检测或监测肌细胞中PPARδ调节的标志。PDK4还可以用于确定肌细胞中的毒性。肌细胞可以是骨骼肌细胞或心肌细胞。
如本文所用的术语“调节”涉及PPARδ转录活性的激活或抑制。因此，PDK4可以作为PPARδ活性调节的标志。
如本文所用的术语“标志”意指核酸或多肽。
本发明还涉及将PDK4作为诊断涉及PPARδ活性调节异常的疾病诸如血脂异常、肥胖或胰岛素抵抗的标志。因此，PDK4可以作为检测PPARδ活性调节的标志。
本发明还提供了检测或监测宿主中PPARδ活性的方法，其包括定量PDK4 mRNA的表达水平。代表性的小鼠PDK4 cDNA示于SEQ.IDNO1。
在上文所述方法的一个实施方案中，PDK4的mRNA表达水平是相对于对照确定的。
宿主可以是动物、组织、细胞或任何其它能够进行RNA转录(包括体外转录)的生物系统。优选地，动物是非人动物。对照可以是不同宿主的PDK4 mRNA表达水平。
此外，本发明提供了确定测试化合物是否调节宿主中PPARδ活性的方法，其包括a)将宿主暴露于测试化合物，和b)定量PDK4的mRNA表达水平。
在上文所述方法的一个实施方案中，PDK4的mRNA表达水平是相对于对照确定的。
宿主可以是动物、组织、细胞或任何其它可以进行RNA转录(包括体外转录)的生物系统。优选地，动物是非人动物。对照是未处理宿主中的PDK4 mRNA表达水平，该宿主可以是处理前的上述宿主或不同的宿主和/或经过适当时间处理后达到处理前正常化水平的上述宿主。在上文所述方法的优选的实施方案中，调节PPARδ活性的化合物是拮抗物或者激动剂。
本发明还提供了用于监测对患有与PPARδ活性调节异常相关疾病例如血脂异常、肥胖或胰岛素抵抗的患者的治疗情况的方法，其包括步骤a)从分离自使用PPARδ活性调节物所治疗患者的肌细胞纯化mRNA，和b)测定PDK4的mRNA表达。
在上文所述方法的一个实施方案中，PDK4的mRNA表达水平是相对于对照确定的。
宿主可以是动物、组织、细胞或任何其它可以进行RNA转录(包括体外转录)的生物系统。优选地，动物是非人动物。对照是未处理宿主中的PDK4 mRNA表达水平，该宿主可以是处理前的上述宿主或不同的宿主和/或经过适当时间处理后达到处理前正常化水平的上述宿主。
本发明还涉及通过上文所述方法鉴定的化合物以及涉及通过上文所述方法所鉴定化合物在制备治疗与PPARδ活性调节异常相关疾病如血脂异常、肥胖或胰岛素抵抗的药物中的用途。
可以使用用于测定PDK4 mRNA表达水平的多种方法。诸如Northern印迹和通过光密度测定对条带定量是本技术领域所熟知的，尽管它们可能不够精确，但可以使用。其它方法包括使用基因芯片、微列阵分析、斑点印迹或不同的定量PCR的方法。优选使用Taqman或实时定量PCR。所转录的PDK4序列的任何部分都可以用作探针。在优选的实施方案中，PDK4的mRNA表达水平通过使用表2所列正向引物和反向引物(SEQ.ID NO4和5)的实时定量PCR确定。优选对肌细胞中的PDK4的mRNA表达水平进行定量。
本发明还提供了检测或监测宿主中PPARδ活性的方法，其包括定量PDK4蛋白的表达水平。SEQ.ID NO3显示小鼠PDK4的蛋白质序列。
在上文所述方法的一个实施方案中，PDK4的蛋白质表达水平是相对于对照确定的。
宿主可以是动物、组织、细胞或任何其它可以进行蛋白质翻译(包括体外翻译)的生物系统。优选地，动物是非人动物。对照是不同宿主中的PDK4的蛋白质表达水平。
此外，本发明提供了确定测试化合物是否调节宿主中PPARδ活性的方法，其包括c)将宿主暴露于测试化合物，和d)定量PDK4的蛋白质表达水平。
在上文所述方法的一个实施方案中，PDK4的蛋白质表达水平是相对于对照确定的。
宿主可以是动物、组织、细胞或任何其它可以进行可以进行蛋白质翻译(包括体外翻译)的生物系统。优选地，动物是非人动物。对照是未处理宿主中的PDK4蛋白质表达水平，该宿主可以是处理前的上述宿主或不同的宿主和/或经过适当时间处理后达到处理前正常化水平的上述宿主。宿主可以用载体处理。该载体可以是能够溶解或重悬化合物的溶剂。在上文所述方法的优选的实施方案中，调节PPARδ活性的化合物是拮抗物或者激动剂。
此外，本发明还提供了用于监测对患有与PPARδ活性调节异常相关疾病如血脂异常、肥胖或胰岛素抵抗的患者的治疗情况的方法，其包括步骤a从分离自使用PPARδ活性调节物所治疗患者的肌细胞纯化蛋白质，和b)测定PDK4的蛋白质表达。
在上文所述方法的一个实施方案中，PDK4的蛋白质表达水平是相对于对照确定的。
宿主可以是动物、组织、细胞或任何其它可以进行蛋白质翻译(包括体外翻译)的物系统。优选地，动物是非人动物。对照是未处理宿主中的PDK4蛋白质表达水平，该宿主可以是处理前的上述宿主或不同的宿主和/或经过适当时间处理后达到处理前的正常化水平的上述宿主。
可以使用用于测定PDK4蛋白质表达水平的几种方法。这些方法包括但不限于二维凝胶分离、质谱分析、抗体结合技术(ELISA、western印迹)和免疫沉淀。优选地，对肌细胞中的PDK4蛋白质表达水平进行定量。
本发明还涉及通过上文所述方法鉴定的化合物以及涉及通过上文所述方法所鉴定化合物在制备治疗与PPARδ活性调节异常相关疾病如血脂异常、肥胖或胰岛素抵抗的药物中的用途。
现已大体描述了本发明，通过参考具体的实施例并结合附图将能够更好地理解本发明，除非另外说明，本文所包括的这些实施例仅旨在阐明本发明而不是限制本发明。
图1使用Affymetrix芯片检测的由表1中的PPAR配体(A300μM、B100nM、C500nM)诱导C2C12小鼠肌细胞中PDK4基因表达改变倍数的图示。PDK4丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4[PPARδ活性标志]，A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸)[PPARα激动剂]，B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸[PPARδ-α共激动剂]，C[外消旋]-(4-{环戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸[PPARδ激动剂]。
图2使用qPCR检测的由表3中的PPAR配体(A300μM、B100nM、C500nM、D500nM)诱导的C2C12小鼠肌细胞中PDK4基因表达改变倍数的图示。PDK4丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4[PPARδ活性标志]，A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸)[PPARα激动剂]，B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸[PPARS-α共激动剂]，C[外消旋]-(4-{环戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸[PPARδ激动剂]，D(2-甲基-4-{甲基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基]-氨基}-苯氧基)-乙酸[PPARδ-α共激动剂]。
实施例除非另外指出，实施例中涉及的商业可得试剂根据产品说明书使用。
实施例1微列阵实验细胞培养C2C12细胞(ATCCCRL1772)细胞在添加了10％热灭活胎牛血清(FCS)的DMEM(5mM葡萄糖)中培养。完全培养基在使用前经过0.2μm孔过滤。当细胞达到汇合时，使用血清减少的培养基(DMEM高葡萄糖、2％FCS)在六孔皿中进行分化实验。而后细胞培养物在37℃、90％湿度和95％-空气-5％-CO2的无菌环境中孵育5天使其分化。
将PPAR配体溶解于100％DMSO并加入培养液调整DMSO终浓度为0.1％(v/v)，并且将细胞与配体在正常生长条件下孵育20小时。每种条件下进行三个重复实验。
RNA提取用Qiagen QIAschredder和RNeasy试剂盒进行RNA提取。
将沉淀的每一样品大约1×106个细胞重悬于350μl含有RLT的硫氰酸胍。将样品加入到QIAshredder柱并全速离心2分钟使裂解液均质化。向流过液中加入350μl乙醇以获得更好的结合条件，之后样品加入到Rneasy spin柱中。对于第一次洗涤步骤，吸取350μl RW1缓冲液加入到柱中。然后将10μl DNase溶液与70μl RDD缓冲液轻轻混合后加于柱中并于室温孵育15分钟以除去基因组DNA。用350μl RW1缓冲液洗去DNase。通过加入500μl RPE缓冲液进行两次洗涤纯化步骤。RNA用水洗脱并保存于-70℃。
cDNA合成使用Roche Diagnostics提供的cDNA合成系统试剂盒并按照产品说明书合成cDNA。整个合成过程在冰上进行。
对于第一链合成，将2μl Oligo d(T7)T24引物(5’GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(T)24VN 3’，200pmol/μl)和重蒸水加入到多达20μg的RNA中，最终反应体积为21μl在热循环器中于70℃温育10分钟并且引物杂交至RNA之后，加入2μl AMV反转录酶和4μl dNTP混合物(10mM)。向混合物中补加8μl RT缓冲液、4μlDTT(0.1 mM)和1μl RNase抑制剂。随后在42℃温育60分钟。
将合成第二链的试剂直接加入到第一链反应管中。将6.5μl的第二链酶混合物加入到混合物中，该酶混合物含有用于在DNA/RNA杂合体的RNA上插入缺口的RNase。这为DNA聚合酶I提供了3’OH引物，DNA聚合酶I和大肠杆菌(E.coli)连接酶一起存在于第二链酶混物中。另外加入1.5μl dNTP混合物、30μl第二链缓冲液和72μl重蒸水并轻轻混合。反应混合物在16℃温育2小时。添加20μl T4聚合酶以保证于16℃温育5分钟之后cDNA末端是平端。随后将样品用RNase处理以除去RNA模板(于37℃下30分钟)并用蛋白酶K处理(37℃，30分钟)。
cDNA纯化使用Quiagen提供的QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。
将850μl PB缓冲液加入到cDNA反应管并混合。将样品加入到QIAquick柱中并于13000转/分离心30秒。将750μl PE缓冲液加入到柱中以洗涤cDNA。随后在最大速度离心使柱子完全干燥。为了洗脱DNA，向膜中心加入50-80μl EB缓冲液(10mM Tris-Cl，pH8.5)并将样品于13000转/分离心1分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检查cDNA质量。
出现从100bp到＞10000bp的成片条带。通过用分光光度计测量260nm和280nm下的吸光度来确定所合成cDNA的量和纯度。
如下计算浓度c[μg/ml]＝A260×50×D，(50dsDNA的特定系数，D稀释系数)。cDNA的A260/A280的比值为1.8-2.1。
体外转录(IVT)使用Ambion的MEGAscript T7试剂盒开展本步骤。
从每种样品取5μg cDNA作为模板并将其与ATP、GTP、CTP、UTP(Ambion)和生物素化的CTP(Bio-11-CTP，ENZO)、生物素化的UTP(Bi0-15-UTP，ENZO)混合。用T7酶混合物于37℃进行RT反应4小时。转录产物用Qiagen的RNeasy试剂盒按照与RNA提取相同的步骤纯化，样品不经过任何DNase处理。
IVT产物的片段化将来自IVT的15μgRNA在小体积(20-30μl)的200mM Tris-乙酸盐pH8.1、500mM KOAc、150mM MgOAc中于95℃片段化35分钟。芯片处理(参考DNA Microarray Protocols V3-200.1.M Wilhelm-Seiler，UCerta)首先将预处理溶液(6.25μl乙酰化BSA(20μg/μl)、12.5μl鲑精DNA(10μg/μl)、125μl2×MES杂交缓冲液、106.25μl水)应用于基因芯片。将基因芯片在回转式烤炉中以60转/分的速度于40℃温育15分钟。
用于杂交的样品制备如下将15μg片段化的RNA与2.5μl对照母液混合，母液含有BioB、BioC、BioD、Cre(内参照)、2.5μl鲑精DNA(10μg/μl)、6.25μl乙酰化BSA(20μg/μl)、125μl2×MES杂交缓冲液、91.25μl水。然后将芯片在回转式烤炉中于45℃旋转(60转/分)温育过夜。
将样品移出并保存于-20℃。用6×SSPE以射流技术洗涤芯片5分钟。然后用230μl MES洗涤缓冲液洗涤已于45℃以60转/分温育30分钟的芯片。
将芯片与下列溶液温育15分钟进行染色，所述溶液为125μl 2×染色缓冲液、91.25μl乙酰化BSA、2.5μl链霉抗生物素蛋白(1mg/ml)。
移去染色液，将芯片用6×SSPE以射流技术洗5分钟后用扩增溶液处理，扩增溶液为125μl 2×染色缓冲液、99μl水、1μl生物素化的抗-链霉抗生物素蛋白(500μg/ml)、25μl乙酰化BSA(20μg/μl)。在回转式烤炉中于40℃以60转/分温育30分钟。用6×SSPE以射流技术洗涤芯片之后，将芯片与藻红蛋白溶液(125μl 2×染色缓冲液、91.25μl水、31.25 μl乙酰化BSA、2.5μl藻红蛋白(1mg/ml))于40℃以60转/分温育。
溶液12×MES母液 70.4g MES游离酸一水合物、193.3g MES钠盐，调节pH至6.6，加三蒸水至1000ml2×MES杂交缓冲液 8.3ml 12×MES母液、17.7ml 5M NaCl、4ml 0.5MEDTA、0.1ml 10％吐温20、19.9ml三蒸水MES洗涤缓冲液 83.3ml 12×MES母液、5.2ml 5M NaCl、1ml 10％吐温20、加三蒸水至1000ml6×SSPE吐温 300ml 20×SSPE、1ml 10％吐温20，加三蒸水至1000ml2×染色缓冲液 41.7ml 12×MES母液、92.5ml 5M NaCl、2.5ml
10％吐温20、113.3ml三蒸水用Affymetrix扫描仪进行扫描，用Affymetrix的基因芯片软件得到结果。
芯片数据分析使用Race A软件(Bioinformatic Roche)分析数据。对于每种条件使用三次重复实验的结果并计算出每种条件下相对于对照(未处理细胞样品)的比较。对于每一基因的分析，要考虑几个标准每一条件下的p值、调用平均数(Call average)、总平均差、变化系数和离散度，以获得受到所研究化合物调节的、最有统计地相关性的基因。
结果使用Affymetrix微列阵实验鉴定新的选择性的PPARδ生物标志基因(见图1)PDK4(丙酮酸脱氢酶同工酶4)(SEQ.ID NO2)。该标志基因使得可以区分PPARα与PPARδ的活性。
测试的配体是PPARα激动剂(A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸))、PPARδ激动剂(C[外消旋]-(4-{环戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸)和PPARδ-α共激动剂(B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸)。
如表1和图1所示，所鉴定标志基因PDK4对PPARδ激动剂(C)和PPARδ-α共激动剂(B)的反应大于对PPARα特异性配体(A)的反应。
表1使用Affymetrix芯片测量的由PPAR配体(A300μM、B100nM、C500nM)引起的C2C12小鼠肌细胞中PDK4基因表达倍数的改变。(A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸)是PPARα激动剂，B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸是PPARδ-α共激动剂，C[外消旋]-(4-{环戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸是PPARδ激动剂)
实施例2定量PCR如实施例1所述进行C2C12小鼠肌细胞的培养、RNA提取、cDNA合成和纯化。
PCR引物设计使用PE Applied Biosystems的软件Primer express 1.0基于Medline的mRNA/cDNA序列设计引物对。对每一引物的标准是长度为19-21个核苷酸、60±1℃的熔解温度、40-60％的G/C含量以及避免形成二级结构如发夹或引物二聚体。此外，由于较短的扩增子比较长的扩增子更有效扩增并且对反应条件有更大的宽容度，因此要控制扩增子的长度(一般～100bp)。将引物溶解于DEPC处理水(Ambion)中得到100μM的浓溶液，保存于-20℃。
表2S12基因(内参照)和PDK4基因的正向引物和反向引物
使用Corbett RG3000和ABI 7000进行的qPCR使用Qiagen的Quantitech SYBR Green试剂盒按照产品说明书进行RT-PCR。将每种成分(25μl预混液、0.16μl每种引物(100μM贮存液)、22.7μl水和2μl cDNA)加入96孔板。
荧光染料SYBR green I结合于双链DNA的小沟，使得可以对每次循环的DNA的量进行检测。该程序由三个不同步骤组成模板的起始变性和Taq DNA聚合酶的热激活(95℃、15分钟)、循环(95℃变性、60℃引物-模板退火、72℃延伸、荧光获取)和最后的熔解(熔解曲线从55-95℃，每上升0.5℃测量一次)。通过熔解曲线可以区分特异性扩增产物和非特异性扩增产物(引物二聚体)。
使用实时PCR进行的相对定量相对定量是基于相对于参考基因的靶基因的相对表达量。域值荧光的概念被定义为荧光高于背景荧光之上且能够对基因表达进行精确和可重复性定量的点。到达域值荧光时的循环数被称为ct值。在扩增反应的指数阶段，ct值和起始分子对数值之间的关系为线性的。因此在该阶段的定量是可靠的并且将不受成分的任何限制性作用的影响。相对于内参ct值的靶基因的相对ct值在对照或未处理样品中表示为Δct对照＝ct内参对照-ct靶基因对照，在处理的未知样品中表示为Δct样品＝ct内参样品-ct靶基因样品。
理论的PCR反应表示为N＝N0×2n(N扩增后的分子数，N0起始分子数，n扩增循环数)，其中底数2代表最佳效率(每一循环则倍增一次)。该方程式使得可以阐明mRNA拷贝数的差异表达而不是ct值得到具有理论效率的指数值2Δct。
核蛋白体蛋白S12基因表达作为定量研究的内参。它在所有样品中以相同的水平组成型表达。荧光域值的设定由光循环软件确定。将获得的ct值(对于一个样品两次重复，对于每种条件取两个样品)输出到微软Excel中并且进行如上所述的分析。
结果由Affymetrix的芯片实验鉴定出的新的选择性的PPARδ生物标志基因(SEQ.ID.NO2)(见图1)用qPCR(定量聚合酶链式反应)进行确定。
所检测的配体是PPARα激动剂(A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸))、PPARδ激动剂(C[外消旋]-(4-{环戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸)和两种PPARδ-α共激动剂(B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸和D(2-甲基-4-{甲基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基]-氨基}-苯氧基)-乙酸)。
如表3和图2所示，PDK4标志基因对PPARδ激动剂(C)和PPARδ-α共激动剂(B和D)的反应大于对PPARα特异性配体(A)的反应。
表3使用qPCR测量的由PPAR配体(A300μM、B100nM、C500nM、D500nM)诱导的C2C12小鼠肌细胞中PDK4基因表达倍数的改变。(A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸)是PPARα激动剂，B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸是PPARδ-α共激动剂，C[外消旋]-(4-{环戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸是PPARδ激动剂，D(2-甲基-4-{甲基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基]-氨基]-苯氧基)-乙酸是PPARδ-α共激动剂)。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffmann-La Roche)<120>作为PPARδ调节标志的PDK<130>22518<160>7<170>Patent In版本3.2<210>1<211>3499<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4(PDK4)<222>(1)..(3499)<223>UniGene ID Mm.235547基因的代表性cDNA(完整cds)(到2004年3月25日为止为BC026134)<400>1ccacgcgtcc gaacccttca cccaggctcg agcacccggg accctgggac cacaacgcac 60ttgctccctc tcgaccgcgc tcctgacccg cagccctcgc caaccctacg gatcctaacc120accgccagcc taggtgggcg tcaggatgaa ggcagcccgc ttcgtgatgc gcagcgccag180ctcgctgagc agcgccagcc tggtccccag ggaggtcgag ctgttctccc gctacagccc240gtccccgctg tccatgaagc agctgctgga ctttggttca gaaaatgcct gtgaaagaac300gtcctttgct tttctgcggc aagagctgcc cgtccgcctg gccaatatcc tgaaggagat360tgacatcctg cctgaccgct tagtgaacac tccttcggtg cagctggtga agagctggta420tatccagagc ctgatggatt tggtggagtt ccatgagaag agcccagaag accagaaagc480cctgtcagag tttgtagaca cgctggtcaa agttcgaaac agacatcata atgtggtccc540tacaatggct caaggcatcc tggagtataa agacacctgc acagtggacc ccgttaccaa600tcaaaatctt cagtattttt tagaccggtt ttacatgaac cgcatttcta ctcggatgct660catgaatcag cacatcctca tattcagtga ctcaaagacg ggaaacccaa gccacattgg720aagtatcgac ccaaactgtg atgtggtagc agtagtccaa gatgcctttg agtgtgcaaa780gatgctctgc gaccagtatt atctaacatc gccagaatta aacctcacac aagtcaatgg840aaaatttcca ggccaaccaa tccacattgt gtacgttcct tcacaccttc accacatgct900cttcgaactc ttcaagaatg ccatgagggc cacggtcgag catcaagaaa accgtccttc960
cttgacccca gtagaggcca ctgtcgtctt gggaaaagaa gaccttacaa tcaagatttc 1020tgaccgagga ggcggtgttc ctctgaggat tactgaccgc ctctttagtt acacgtactc 1080cactgctcca acacctgtga tggacaattc ccggaatgcc cctttggctg gttttggtta 1140tggcttgcca atttctcgtc tctacgccaa gtattttcaa ggagatctga atctctactc 1200tatgtcaggt tatgggacag acgctatcat ctacttaaag gctttatctt ctgagtctgt 1260agaaaagctc ccagtcttta acaagtcagc cttcaaacat tatcagatga gctccgaagc 1320tgatgactgg tgtatcccaa gcagggaacc gaagaacctg gcgaaggaga agctggcagt 1380gtgaagcgga tgacgcctga cattttacgg gatcaaagtg ggtctgtggc attgctgctt 1440cgtgaatgtg tgtggactct agtttccgca aaacaacgca acacaaaacc aagcaagcaa 1500aacacaaaca cgagtacaaa ccttgacctg atgagggaca gagcttggtt ggatgacccg 1560ggagaagtca gggcagggct ccaggggata acaggtgtcc tgcttctcct ttggcaatgc 1620aaaatgactc ctgactgttc caaatactga aaagaagtct gcctctgagt tacagctctt 1680tctcaacaag tacagagttt gaggcttgca gttgcaacag ctggatgttt ggtggttctt 1740gctgccagcc aaataaattg gtgtttagtg aacattttca gtgtttcccc gccatgcaaa 1800gcttggcgcc ttgggagaaa tgtgtgtaaa tgtacattgt ataggtatta gtgtgctcta 1860gaaaggacag gatggaagga atcaaagcac tttatcgagc ttgtggctga gcattgcagc 1920ctatgtgcaa acccagagga aaagtatctc tgtcaagaca gctccagtat catgcagctt 1980tttatgtttg cactcaaaaa gccagtgcct tctggctggt gccgaggctt gggtgaaatg 2040ttaaatatgc actgacctca gaaagtcgag ttcaaaaggg agataaaatt gccaaagtga 2100tccaaggatt gtgcatgttg ggaaacccat atgagagaaa ggattctcat acttagaact 2160ttcctatgaa gaaatggtgg taaactttct ctacctagaa gtagtggaaa tttcaaggtc 2220atcttaaaaa agatgtgcgt tgtatatttt aactacattc tctacactct aacattaaca 2280tatctattca aatttgtcta gttgccaatt gtcttcagag tgtgaaaatt taaatccttc 2340ttgaagtatc tttcgtgaga gtagtatgga agtaaaacgt tctcatatca ggaggatgtc 2400atttgtgaag catggggaca tcatgaacta gtgatgtgcg tgaggcttgg gaggctgaag 2460ggtaaggatc agcgggaggc catccatgta ggagagagaa ttaaaacgag gagcgaggga 2520agcaatggag agagggaagc aagaaaggaa ccagaaggct ggcatcatcc tatttcccac 2580aggctaaccc aagggatgct ctgtgccttt cctggggagg gaaggggatg aactggtaga 2640tttgaaagca gtatggcttc ttctgtgggt ctccctctta ctagacaagg tgaaatgata 2700
attcgtgtca aattaatgtg aaattttttt cctgcattgt aatattatga ggcctgagtc 2760gcagttgagt ttgaaatttg tatttaattt cacagtgacc tagagctaag gtgctcccgg 2820ttgtggcaat aggagccaca agtattttct ttctttcttt cgttctttct ttctttcttt 2880ctttctttct ttctttcttt ctttctttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt 2940ccttccttcc ttcttccttt ccttttcttt tctcttctct tcttttcttt tttctgtttc 3000tttttctttt tttgcattgt agatgttgtc cttaaaagat cagggcagtg actttcacag 3060caggactttg actcccacat tggttgatca cacaaaactg tcagcatttg ggtaatctga 3120tgtatagttg ttttgttgct gatgtttcca ttgaaatttc agctctgagt ttgtgcacat 3180gaatacttac ttgtgtttac caaaggtcta aggcatttgg ttacttaacc caaatatcct 3240gaactgtgcg taaagtaata gagaaaagct ttagggtctc aatagtgtca cctgtgtaaa 3300tcaaatcaaa atagccttcc ctattattta tgaacccatg ggagacttta aactcttgta 3360gatagatgct aaatgcccag gcccacttaa cttattaatg tgtgaattac atttatgttt 3420ttagtttata tgcaaagaat tgtgataatt ttataataaa tatttttatt ataaaaaaaa 3480aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3499<210>2<211>3449<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4(PDK4)<222>(1)..(3449)<223>UniGene ID Mm.235547基因的代表性cDNA(到2004年3月25日为止为NM_013743)<400>2gagcacccgg gaccctggga ccacaacgca cttgctccct ctcgaccgcg ctcctgaccc 60gcagccctcg ccaaccctac ggatcctaac caccgccagc ctaggtgggc gtcaggatga 120aggcagcccg cttcgtgatg cgcagcgcca gctcgctgag cagcgccagc ctggtcccca 180gggaggtcga gctgttctcc cgctacagcc cgtccccgct gtccatgaag cagctgctgg 240actttggttc agaaaatgcc tgtgaaagaa cgtcctttgc ttttctgcgg caagagctgc 300ccgtccgcct ggccaatatc ctgaaggaga ttgacatcct gcctgaccgc ttagtgaaca 360ctccttcggt gcagctggtg aagagctggt atatccagag cctgatggat ttggtggagt 420tccatgagaa gagcccagaa gaccagaaag ccctgtcaga gtttgtagac acgctggtca 480aagttcgaaa cagacatcat aatgtggtcc ctacaatggc tcaaggcatc ctggagtata 540
aagacacctg cacagtggac cccgttacca atcaaaatct tcagtatttt ttagaccggt 600tttacatgaa ccgcatttct actcggatgc tcatgaatca gcacatcctc atattcagtg 660actcaaagac gggaaaccca agccacattg gaagtatcga cccaaactgt gatgtggtag 720cagtagtcca agatgccttt gagtgtgcaa agatgctctg cgaccagtat tatctaacat 780cgccagaatt aaacctcaca caagtcaatg gaaaatttcc aggccaacca atccacattg 840tgtacgttcc ttcacacctt caccacatgc tcttcgaact cttcaagaat gccatgaggg 900ccacggtcga gcatcaagaa aaccgtcctt ccttgacccc agtagaggcc actgtcgtct 960tgggaaaaga agaccttaca atcaagattt ctgaccgagg aggcggtgtt cctctgagga 1020ttactgaccg cctctttagt tacacgtact ccactgctcc aacacctgtg atggacaatt 1080cccggaatgc ccctttggct ggttttggtt atggcttgcc aatttctcgt ctctacgcca 1140agtattttca aggagatctg aatctctact ctatgtcagg ttatgggaca gacgctatca 1200tctacttaaa ggctttatct tctgagtctg tagaaaagct cccagtcttt aacaagtcag 1260ccttcaaaca ttatcagatg agctccgaag ctgatgactg gtgtatccca agcagggaac 1320cgaagaacct ggcgaaggag aagctggcag tgtgaagcgg atgacgcctg acattttacg 1380ggatcaaagt gggtctgtgg cattgctgct tcgtgaatgt gtgtggactc tagtttccgc 1440aaaacaacgc aacacaaaac caagcaagca aaacacaaac acgagtacaa accttgacct 1500gatgagggac agagcttggt tggatgaccc gggagaagtc agggcagggc tccaggggat 1560aacaggtgtc ctgcttctcc tttggcaatg caaaatgact cctgactgtt ccaaatactg 1620aaaagaagtc tgcctctgag ttacagctct ttctcaacaa gtacagagtt tgaggcttgc 1680agttgcaaca gctggatgtt tggtggttct tgctgccagc caaataaatt ggtgtttagt 1740gaacattttc agtgtttccc cgccatgcaa agcttggcgc cttgggagaa atgtgtgtaa 1800atgtacattg tataggtatt agtgtgctct agaaaggaca ggatggaagg aatcaaagca 1860ctttatcgag cttgtggctg agcattgcag cctatgtgca aacccagagg aaaagtatct 1920ctgtcaagac agctccagta tcatgcagct ttttatgttt gcactcaaaa agccagtgcc 1980ttctggctgg tgccgaggct tgggtgaaat gttaaatatg cactgacctc agaaagtcga 2040gttcaaaagg gagataaaat tgccaaagtg atccaaggat tgtgcatgtt gggaaaccca 2100tatgagagaa aggattctca tacttagaac tttcctatga agaaatggtg gtaaactttc 2160tctacctaga agtagtggaa atttcaaggt catcttaaaa aagatgtgcg ttgtatattt 2220taactacatt ctctacactc taacattaac atatctattc aaatttgtct agttgccaat 2280
tgtcttcaga gtgtgaaaat ttaaatcctt cttgaagtat ctttcgtgag agtagtatgg 2340aagtaaaacg ttctcatatc aggaggatgt catttgtgaa gcatggggac atcatgaact 2400agtgatgtgc gtgaggcttg ggaggctgaa gggtaaggat cagcgggagg ccatccatgt 2460aggagagaga attaaaacga ggagcgaggg aagcaatgga gagagggaag caagaaagga 2520accagaaggc tggcatcatc ctatttccca caggctaacc caagggatgc tctgtgcctt 2580tcctggggag ggaagggggt gaactggtag atttgaaagc agtatggctt cttctgtggg 2640tctccctctt actagacaag gtgaaatgat aattcgtgtc aaattaatgt gaaatttttt 2700tcctgcattg taatattatg aggcctgagt cgcagttgag tttgaaattt gtatttaatt 2760tcacagtgac ctagagctaa ggtgctcccg gttgtggcaa taggagccac aagtattttc 2820tttctttctt tcgttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc 2880cttccttcct tccttccttc cttccttcct tccttccttc cttcttcctt tccttttctt 2940ttctcttctc ttcttttctt ttttctgttt ctttttcttt ttttgcattg tagatgttgt 3000ccttaaaaga tcagggcagt gactttcaca gcaggacttt gactcccaca ttggttgatc 3060acacaaaact gtcagcattt gggtaatctg atgtatagtt gttttgttgc tgatgtttcc 3120attgaaattt cagctctgag tttgtgcaca tgaatactta cttgtgttta ccaaaggtct 3180aaggcatttg gttacttaac ccaaatatcc tgaactgtgc gtaaagtaat agagaaaagc 3240tttagggtct caatagtgtc acctgtgtaa atcaaatcaa aatagccttc cctattattt 3300atgaacccat gggagacttt aaactcttgt agatagatgc taaatgccca ggcccactta 3360acttattaat gtgtgaatta catttatgtt tttagtttat atgcaaagaa ttgtgataat 3420tttataataa atatttttat tataatagt 3449<210>3<211>412<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4(PDK4)<222>(1)..(412)<223>UniGene ID Mm.235547基因的蛋白质序列(到2004年3月25日为止为070571)<400>3Met Lys Ala Ala Arg Phe Val Met Arg Ser Ala Ser Ser Leu Ser Ser1 5 10 15
Ala Ser Leu Val Pro Arg Glu Val Glu Leu Phe Ser Arg Tyr Ser Pro20 25 30Ser Pro Leu Ser Met Lys Gln Leu Leu Asp Phe Gly Ser Glu Asn Ala35 40 45Cys Glu Arg Thr Ser Phe Ala Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Arg50 55 60Leu Ala Asn Ile Leu Lys Glu Ile Asp Ile Leu Pro Asp Arg Leu Val65 70 75 80Asn Thr Pro Ser Val Gln Leu Val Lys Ser Trp Tyr Ile Gln Ser Leu85 90 95Met Asp Leu Val Glu Phe His Glu Lys Ser Pro Glu Asp Gln Lys Ala100 105 110Leu Ser Glu Phe Val Asp Thr Leu Val Lys Val Arg Asn Arg His His115 120 125Asn Val Val Pro Thr Met Ala Gln Gly Ile Leu Glu Tyr Lys Asp Thr130 135 140Cys Thr Val Asp Pro Val Thr Asn Gln Asn Leu Gln Tyr Phe Leu Asp145 150 155 160Arg Phe Tyr Met Asn Arg Ile Ser Thr Arg Met Leu Met Asn Gln His165 170 175Ile Leu Ile Phe Ser Asp Ser Lys Thr Gly Asn Pro Ser His Ile Gly180 185 190Ser Ile Asp Pro Asn Cys Asp Val Val Ala Val Val Gln Asp Ala Phe195 200 205Glu Cys Ala Lys Met Leu Cys Asp Gln Tyr Tyr Leu Thr Ser Pro Glu210 215 220Leu Asn Leu Thr Gln Val Asn Gly Lys Phe Pro Gly Gln Pro Ile His225 230 235 240Ile Val Tyr Val Pro Ser His Leu His His Met Leu Phe Glu Leu Phe
245 250 255Lys Asn Ala Met Arg Ala Thr Val Glu His Gln Glu Asn Arg Pro Ser260 265 270Leu Thr Pro Val Glu Ala Thr Val Val Leu Gly Lys Glu Asp Leu Thr275 280 285Ile Lys Ile Ser Asp Arg Gly Gly Gly Val Pro Leu Arg Ile Thr Asp290 295 300Arg Leu Phe Ser Tyr Thr Tyr Ser Thr Ala Pro Thr Pro Val Met Asp305 310 315 320Asn Ser Arg Asn Ala Pro Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Gly Leu Pro Ile325 330 335Ser Arg Leu Tyr Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Asp Leu Asn Leu Tyr Ser340 345 350Met Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Ala Ile Ile Tyr Leu Lys Ala Leu Ser355 360 365Ser Glu Ser Val Glu Lys Leu Pro Val Phe Asn Lys Ser Ala Phe Lys370 375 380His Tyr Gln Met Ser Ser Glu Ala Asp Asp Trp Cys Ile Pro Ser Arg385 390 395 400Glu Pro Lys Asn Leu Ala Lys Glu Lys Leu Ala Val405 410<210>4<211>19<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>PDK4的正向引物<222>(1)..(19)<400>4ttcagtgttt ccccgccat19<210>5
<211>21<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>PDK4的反向引物<222>(1)..(21)<400>5tcccaacatg cacaatcctt g 21<210>6<211>21<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>S12的正向引物<222>(1)..(21)<400>6tgaaccagat gcaccgctta g 21<210>7<211>20<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>S12的反向引物<222>(1)..(20)<400>7ttcttctttt gcacgtggcc 20
权利要求
1.PDK4，其作为确定PPARδ活性的生物标志。
2.PDK4，其作为确定肌肉中PPARδ活性的生物标志。
3.PDK4，其作为诊断涉及PPARδ活性调节异常的疾病的标志。
4.检测或监测宿主中PPARδ活性的方法，其包括定量PDK4 mRNA表达水平。
5.根据权利要求4所述的方法，其包括确定PDK4相对于对照的mRNA表达水平的步骤。
6.确定测试化合物是否调节宿主中PPARδ活性的方法，其包括a)将宿主暴露于测试化合物，和b)定量PDK4的mRNA表达水平。
7.根据权利要求6所述的方法，其包括确定PDK4相对于对照的mRNA表达水平。
8.用于监测对患有与PPARδ活性调节异常相关疾病的患者的治疗情况的方法，其包括步骤a)从分离自使用PPARδ活性调节物所治疗患者的肌细胞纯化RNA，和b)测定PDK4的mRNA表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其包括确定PDK4相对于对照的mRNA表达水平。
10.根据权利要求4-9中任意一项所述方法鉴定的化合物。
11.根据权利要求4-9中任意一项所述方法鉴定的化合物在制备药物中的用途，该药物用于治疗涉及PPARδ活性调节异常的疾病。
12.检测或监测宿主中PPARδ活性的方法，其包括定量PDK4的蛋白质表达水平。
13.根据权利要求12所述的方法，其包括确定PDK4相对于对照的蛋白质表达水平的步骤。
14.确定测试化合物是否调节宿主中的PPARδ活性的方法，其包括a)将宿主暴露于测试化合物，和b)定量PDK4的蛋白质表达水平。
15.根据权利要求14所述的方法，其包括确定PDK4相对于对照的蛋白质表达水平。
16.用于监测对患有与PPARδ活性调节异常相关疾病的患者的治疗情况的方法，其包括步骤a)从分离自使用PPARδ活性调节物所治疗患者的肌细胞纯化蛋白质，和b)测定PDK4的蛋白质表达。
17.根据权利要求16所述的方法，其包括确定PDK4相对于对照的蛋白质表达水平。
18.根据权利要求12-17中任意一项所述方法鉴定的化合物。
19.根据权利要求12-17中任意一项所述方法鉴定的化合物在制备药物中的用途，该药物用于治疗涉及PPARδ活性调节异常的疾病。
20.PDK4的用途，其作为确定PPARδ活性的生物标志。
21.PDK4的用途，其作为确定肌肉中PPARδ活性的生物标志。
22.PDK4的用途，其作为诊断涉及PPARδ活性调节异常的疾病的标志。
全文摘要
本发明涉及PDK4作为PPARδ活性的生物标志的用途，以及用于诊断与PPARδ活性调节异常相关疾病如血脂异常、肥胖或胰岛素抵抗的方法、用于监测对患有PPARδ活性调节异常相关疾病患者的治疗情况的方法和用于鉴定调节PPARδ活性的化合物的方法。
文档编号G01N33/50GK1938432SQ200580010738
公开日2007年3月28日 申请日期2005年3月29日 优先权日2004年3月30日
发明者R·G·克莱尔, C·加尔德, M·迈耶, M·B·赖特 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司