专利名称：检测鸟苷酸环化酶活性的方法和鉴定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)。更具体地，本发明提供了允许高效和高灵敏度地检测可溶性鸟苷酸环化酶酶活性的基于细胞的鉴定法系统。在一个优选的实施方案中，本发明提供了筛选通过刺激或抑制sGC酶活性而与sGC相互作用的分子以及可用于诊断或治疗sGC介导的功能异常或疾病的分子的方法。本发明还提供了用于所述方法中的基因构建体、载体和细胞。
背景技术：
腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶对多种调节信号反应分别合成胞内第二信使cAMP和cGMP。哺乳动物腺苷酸环化酶是含有由六螺旋跨膜区组成的重复构件的固有质膜蛋白质，其后接大约40-kDa的胞质结构域(Sunahara等，(1996)Annu.Rev.Pharm.Toxicol.36，461-480)。两个胞质结构域内高度保守且同源的序列是酶的活性部位(Tang等，(1995)Science268，1769-1772)。人们还已经分析了所述酶与激活剂和抑制剂复合的这种可溶性结构域的X射线晶体结构(Tesmer等，(1997)Science 278，1907-1916)。
鸟苷酸环化酶既有可溶型，又有膜结合型。两种类型酶含有的胞质结构域均类似于腺苷酸环化酶的胞质结构域(Garbers，D.L.等，(1994)Mol.Biol.Cell5，1-5)。膜结合的鸟苷酸环化酶是受利尿钠肽刺激的单体，而可溶性鸟苷酸环化酶(GC)则作为异二聚体存在，其中该异二聚体由含有辅基血红素的α亚基和β亚基(两种亚基均为催化所需)组成。
鸟苷酸环化酶(GC)属于催化鸟苷5′-三磷酸(GTP)转化为环状鸟苷3′，5′-单磷酸(cGMP)的酶家族。
通过形成第二信使cGMP，sGC在多种胞外信号过程和不同生理过程中发挥重要作用，即血管舒张、血小板凝结和粘附以及神经传递。最重要的sGC生理激活剂是在结合血红素部分后即活化sGC的NO和NO相关化合物。
氧化氮(NO)结合辅基血红素引起可溶性鸟苷酸环化酶的显著活化。多种心血管疾病的病理发生与sGC的不恰当活化有关。NO依赖性sGC活化的概念作为一种作用机制已经通过临床应用NO供体得到广泛证实。
包括人在内的所有哺乳动物的器官例如心脏、肺脏、肝脏、肾脏和大脑中可检测到可溶性鸟苷酸环化酶。在病理过程或与病理事件有关的过程中，可溶性鸟苷酸环化酶中血红素基团铁(heme group iron)的氧化状态可能起实质性作用。具有氧化血红素基团铁的可溶性鸟苷酸环化酶比例较高可能导致内源性NO降低对可溶性鸟苷酸环化酶的活化。而这尤其可导致血压升高、血小板活化、细胞增殖增加或细胞粘着增强、永久性高血压、稳定或不稳定性心绞痛、血栓形成、心肌梗塞、中风、肺水肿、勃起障碍、组织生长失控伴随肿瘤形成、糖尿病、肾功能异常、肝功能异常或血管功能异常。
已显示突变的GC酶具有完全改变的核苷酸特异性，在该酶中鸟苷酸环化酶活性部位的三个残基由腺苷酸环化酶中的相应残基替换(Sunahara，R.K.等1998)。这种突变的鸟苷酸环化酶特别以ATP作为底物但不影响对分别的GC刺激剂的反应性。可溶性鸟苷酸环化酶的这种突变形式对检测氧化氮诱导的cAMP产生有用。
检测可溶性鸟苷酸环化酶调节剂的常规方法是-使用核苷酸前体的放射性方法-基于对环核苷酸敏感的钙通道的细胞系统-在组织模型或动物模型上测试GC刺激剂效应的体内(in vivo)方法。
发明公开本发明的目的是提供可用于测定可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)酶活性的基于细胞的鉴定法。本发明的又一目的是提供利用所述基于细胞的鉴定法筛选与sGC相互作用的分子的方法。根据本发明，通过在合适的真核细胞或原核细胞中使底物特异性受到修饰的sGC酶偶联于cAMP敏感性报告构建体测定sGC酶活性，由此报告基因的活性指示sGC酶活性。底物特异性受到修饰的sGC酶能够催化ATP转化为环状AMP但不影响天然sGC的变构调节。可以将参与核苷酸结合的氨基酸残基替换为在腺苷酸环化酶活性部位中出现的相应氨基酸残基而修饰sGC的底物特异性。例如，当使用大鼠sGC时，分别将α亚基Arg592、β亚基Glu473和Cys541氨基酸改为Gln、Lys和Asp以便赋予ATP底物特异性。可在此处引用作为参考的Sunahara等(1998)中找到关于修饰sGC底物特异性的更多细节。
cAMP敏感性报告构建体含有功能性连接至对胞内cAMP水平敏感的cAMP反应性启动子的报告基因。在一个优选的实施方案中，cAMP反应性启动子是含有1-4个MRE元件和1-5个CRE元件的MRE/CRE(多重反应元件-Ray A等，1989；cAMP反应元件Fink，J.S.等1988)诱导型启动子。优选地，对增加的胞内cAMP水平敏感的MRE-CRE诱导型启动子含有3个MRE元件重复和5个CRE元件重复。
MRE对应于能使细胞系响应Gα、Gq和Gs信号作用的人白介素-6启动子区域(MRERay A，Sassone-Corsi P，Sehgal PB.，1989；Fitzgerald，LR，Manan，IJ，Dytko，GM，Wu，HL，Nambi.P，1999)。每个MRE元件长32bp并且对应于序列ATGCTAAAGGACGTCACATTGCACAATCTTAA。
CRE序列(“TGACGTCA”)含有一个拷贝或多个拷贝的保守序列基序CGTCA(Fink，J.S.等1988)。该元件类似于已知受cAMP调节的其它基因中的序列和数种病毒增强子中的序列。
报告构建体还可以含有转录调节元件、选择标记和病毒启动子。
根据本发明可使用的合适报告基因包括但不限于萤光素酶基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因和光蛋白(photoprotein)基因。不过，该系统不仅对报告基因转录极为有用，而且还用于表达和诱导任何目的基因，如G蛋白偶联的受体家族(GPCRs)、离子通道和核激素受体。
本发明还提供含有编码sGC的基因和/或报告基因构建体的载体及宿主细胞。优选地，宿主细胞是CHO细胞系(以下将含有所述驱动萤光素酶报告基因表达的MRE-CRE元件的CHO细胞系称为CHO cAMPL)。将根据本发明的宿主细胞系方便地用作检测胞内NO释放的工具。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于在培养的真核细胞或原核细胞中测定sGC酶活性的方法，该方法包括A)向细胞中导入i)编码功能性连接至CRE诱导型启动子或MRE-CRE诱导型启动子的报告基因的载体，并且同时或分别地导入ii)编码具有ATP底物特异性即能催化ATP转化为环AMP的sGC的载体；B)将细胞与刺激或抑制sGC酶活性的化合物温育；C)测定报告基因活性。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及鉴定调节sGC活性的分子的方法，该方法包括A)向细胞中导入i)编码功能性连接至CRE诱导型启动子或MRE-CRE诱导型启动子的报告基因的载体，并且同时或分别地导入ii)编码具有ATP底物特异性的sGC的载体；B)将细胞与候选分子温育；C)测定报告基因活性。
刺激或抑制sGC活性的分子可通过测量报告基因的表达或活性进行选择。可在NO结合sGC血红素部分后即活化该酶的已知释放NO的物质存在或缺乏时实施本测定法。可用本发明的方法方便地鉴定释放NO的分子和不依赖NO的sGC激活剂(和非催化部位特异性抑制剂如ODQ)。所选择的化合物代表对治疗涉及sGC功能异常的疾病有价值的候选物。特别地，刺激sGC的化合物可用于治疗涉及不恰当活化sGC的疾病，尤其是心血管系统疾病。
与迄今已知测定sGC活性所用的方法相比，本发明方法的更有利之处在于a)不需要放射性试剂，b)具有高灵敏度，c)可方便地适应于高流通量模式和d)在天然环境中实施。
在另一个实施方案中，本发明提供了调节目的基因在培养的真核细胞或原核细胞中表达的方法，该方法包括A)向细胞中导入i)编码功能性连接至CRE诱导型启动子或MRE-CRE诱导型启动子的靶基因的载体，并且同时或分别地导入ii)编码具有ATP底物特异性的sGC的载体；B)将该细胞与能够以依赖NO或不依赖NO的方式刺激sGC的分子温育。
如下更详细地公开根据本发明的代表性鉴定法、其中所用的条件和试剂。
实验部分大鼠野生型sGCα3亚基和β1亚基通过RT-PCR从脑cDNA中扩增并用作定点诱变的模板。分别将α亚基Arg 592氨基酸、β亚基Glu 473和Cys 541氨基酸变成Gln、Lys和Asp，赋予针对腺苷的特异性。
制备用于大鼠诱变的sGC cDNA的表达载体(来自Clontech的pIRES)。通过在pMAMneoluc载体(Clontech)中萤光素酶基因的5′端克隆MRE-CRE(多重反应元件Ray A等，1989；cAMP反应元件Fink，J.S.等1988)诱导型启动子构建报告载体。
对胞内增加的cAMP水平敏感的MRE-CRE可诱导元件的结构如下MRE元件3(ATGCTAAAGGACGTCACATTGCACAATCTTAA)CRE元件5(TGACGTCA)将两种载体以稳定方式转染至CHO-K1细胞中，阳性克隆基于与NO供体化合物SNAP温育4小时后获得的最佳萤光素酶诱导进行选择(
图1)。
将来自3次有限稀释后响应最佳的克隆用于在已知的sGC抑制剂ODQ存在或不存在时测试不同化合物如NO供体和不依赖NO的激活剂的活性(图2-4)。
在附图中显示结果，其中图1第三轮LD克隆的再测试使来自第三轮LD的12个最佳克隆与50μl无血清培养基中的SNAP温育4小时；在注入50μl Bright-GloTM(Promega)后在CCD照相机(60”测量，高敏感度)下测量萤光素酶活性。
实验条件96孔平板模式每孔5000个细胞，接种后48小时。
选择克隆7作为进一步表征的最终克隆。
图2(a)计算NO供体SNAP的EC5096孔平板每孔接种5000个细胞。接种后48小时，使细胞与50μl无血清培养基(SFM)中的SNAP温育4小时。(b)在未转染细胞上开展平行实验。
在注入50μl Bright-GloTM(Promega)后在CCD照相机(60”测量，高敏感度)下检测萤光素酶活性。公开的EC50 1.7×10-6M。
图3(a)计算NO供体SIN-1的EC50384孔平板每孔接种1500个细胞。接种后48小时，使细胞与蒂罗德缓冲液(25μl)中的SIN-1温育4小时。在注入50μl Bright-GloTM(Promega)后在CCD照相机(60”测量，高敏感度)下检测萤光素酶活性。公开的EC50 10-7-10-6M。
(b)通过ODQ抑制SIN-1的活性384孔平板每孔接种1500个细胞；接种后48小时，在ODQ(300nM、3μM、30μM)不存在或存在时进行SIN-1的剂量反应。在蒂罗德缓冲液中的温育总体积是25μl。
图4计算NO供体NOC-18的EC50。
96孔平板每孔接种5000个细胞。接种后48小时，使细胞与50μl无血清培养基中的NOC-18温育4小时。在注入50μl Bright-GloTM(Promega)后在CCD照相机(60”测量，高敏感度)下检测萤光素酶活性。
图5(a)计算sGC刺激剂BAY41-2272的EC50。
384孔平板每孔接种1500个细胞。接种后48小时，使细胞与25μl蒂罗德缓冲液中的BAY41-2272温育4小时。在注入25μl Bright-GloTM(Promega)后在CCD照相机(60”测量，高敏感度)下检测萤光素酶活性。公开的EC506×10-7M。
(b)通过ODQ抑制BAY41-2272的活性384孔平板每孔接种1500个细胞；接种后48小时，在ODQ(300nM、3μM、30μM)不存在或存在时开展BAY41-2272的剂量反应。在蒂罗德缓冲液中的温育总体积是25μl。BAY41-2272对sGC的刺激效应受ODQ的竞争。
图6用SNAP进行的动力学实验和剂量反应实验。
96孔平板每孔接种5000个细胞。接种后48小时，使细胞与升高浓度的SNAP温育；在温育所示的时间后，用无血清培养基替换化合物。温育总时间是4小时。
材料和方法PCR分析大鼠可溶性鸟苷酸环化酶(α3亚基和β1亚基)α3亚基NM_017090；编码区长690个氨基酸β1亚基NM_012769；编码区长619个氨基酸从Clontech购买大鼠脑cDNA(货号637312)。将2μl cDNA作为PCR分析中的模板用于非定量性表达分析。此外，在无模板时实施阴性对照。
标准PCR方法如Perkin Elmer所示。PCR方案如下引物引物sGCα UP(A)5′CGGCTAATAAGGAGGAAACCAC3′引物sGCα LOW(B)5′AGAAACATGCGGCTCACTAATCTA3′引物sGCβ UP(C)5′CGGACACCATGTACGGTTTTGTGA3′
引物sGCβLOW(D)5′GGCTGCCATTCAGTTTTCATCCTG3′PCR反应混合物2μl 模板5μl 10×Pfx缓冲液(GIBCO-LifeTechnologies)1.5μl 10mM dNTP1μl 50mM MgSO4(GIBCO-LifeTechnologies)2.5μl 引物A(10μM)2.5μl 引物B(10μM)2.5U Platinum Pfx(GIBCO-LifeTechnologies)35μlH2O在热循环仪Perkin Elmer 9700上实施扩增方案执行以下步骤1次预备PCR 94℃ 2分钟执行以下步骤40次变性94℃ 30秒复性56℃ 1分钟延伸68℃ 2分钟10秒执行以下步骤1次延伸68℃ 7分钟特异性PCR产物的预期长度1309bp(对于A/B扩增是690bp，对于C/D扩增是619bp)按照如Maniatis等所述的标准方法在1×TAE工作缓冲液中1％琼脂糖凝胶上通过电泳分析扩增产物。
定点诱变使用野生型基因作为模板通过PCR向sGC的β亚基内插入突变，尤其将引物sGCβUP和sGCβE473KLOW用于扩增基因5′部分，引物sGCβE473KUP和sGCβC541DLOW用于扩增中央片段，引物sGCβC541DUP和sGCβLOW用于扩增基因3′部分。为重建全长的突变基因，用这三个独立的片段作为最终PCR反应中的模板，其中用引物sGCβUP和sGCβLOW开展最终PCR反应。
在热循环仪Perkin Elmer 9700上实施如下扩增方案执行以下步骤1次预备PCR 94℃ 2分钟执行以下步骤20次变性94℃ 30秒复性52℃ 1分钟延伸68℃ 30秒执行以下步骤1次延伸68℃ 7分钟使用引物sGCαR592QUP和sGCαR592QLOW通过定点诱变(来自Stratagene的定点诱变QuikChange XL试剂盒)向sGC的α亚基内插入突变R592Q。
在热循环仪Perkin Elmer 9700上实施如下扩增方案执行以下步骤1次预备PCR 95℃ 1分钟执行以下步骤18次变性95℃ 30秒复性55℃ 1分钟延伸68℃ 13分钟执行以下步骤1次延伸68℃ 7分钟PCR反应混合物1μl模板5μl10×Turbo Pfu缓冲液(Stratagene)1μl20mM dNTP2.5μl 引物A(I0μM)
2.5μl引物B(10μM)1μl 2.5U/μl Turbo Pfu(Stratagene)37μl H2O
克隆过程pIRESsGCβαmut在双顺反子哺乳动物表达载体(从Clontech购买的pIRES)内克隆两个突变sGC亚基中的每一个，其中所述表达载体允许从同一个信使RNA上经过内部核糖体进入位点(IRES)元件同时翻译两个连续ORF(开放读码框)，因而产生称作pIRESsGCβα的载体。
将如上所述的sGC突变β亚基克隆至pIRES中的唯一EcoRI限制性位点内。
随后用SmaI消化载体pIRESsGCβ以便在IRES元件下游插入sGC突变α亚基。
通过全长双脱氧测序法验证所有得到的构建体。
细胞培养
培养基、接种和温育DMEM/F12，其含有Glutamax (GIBCO编号31331-028)、10％FBS、1％青霉素/链霉素(Invitrogen编号15140-122)、25mM Hepes缓冲溶液(GIBCO编号15630-056)、1.0mM丙酮酸钠(GIBCO编号11360-039)、1.5g/L碳酸氢钠(GIBCO编号25080-060)、0.5mg/ml G418(Calbiochem编号345812)。
预培养条件当70-80％汇合时接种细胞用于实验。
细胞培养条件每周分瓶2次3.0×105个细胞/T75培养瓶(回收8×106个细胞)。
克隆选择过程以pIRESsGCβαmut转染事先由Axxam产生的CHO cAMPL。
在G418选择8天后，在96孔平板模式对稳定转染的细胞按每孔1个细胞实施第一次有限稀释(第一次LD)。
两周后，使平板与100μM SNAP温育4小时并在注入Bright-GloTM(Promega)后在CCD照相机下测量。将九个响应最佳的克隆在剂量反应实验中再次测试作为计数的细胞。
对3个响应最佳的克隆进行第二次LD(0.3个细胞每孔，96孔平板)。
两周后，将平板平分为两份并且在48小时后与100μM SNAP温育4小时，并在注入Bright-GloTM(Promega)后在CCD照相机下读数。将12个响应最佳对应克隆在剂量反应实验中再次测试作为计数的细胞。
对4个响应最佳的克隆进行第三次LD(0.3个细胞每孔，96孔平板)。
在第三轮LD用10μM SNAP选择后选定最终克隆。
本鉴定法的完全优化在响应最佳的克隆7上开展。
参考化合物SNAP(Tocris编号0598)在DMSO里溶解为浓度100mM并在-20℃分装保存。在无血清培养基中新鲜制备工作溶液。
SIN(Tocris编号0756)在水里溶解为浓度100mM并在-20℃分装保存。
NOC18(Calbiochem编号487957)在水里溶解为浓度100mM并在-20℃分装保存。在无血清培养基中新鲜制备工作溶液。
ODQ(Calbiochem编号495320)在DMSO里溶解为浓度100mM并在-20℃分装保存。
BAY41-2272从Alexis购买，在DMSO里溶解为浓度10mM并在-20℃分装保存。
在标准蒂罗德缓冲液中新鲜制备SIN-1、BAY41-2272和BAY58-2667的工作溶液。
蒂罗德缓冲液组成NaCl 130mM、KCl 5mM、CaCl22mM、MgCl21mM、NaHCO35mM、HEPES 20mM和pH 7.4。
Bright-GloTMPromega编号E2620。
参考文献Garbers，D.L.，Koesling，D.和Schultz，G.(1994)Mol.Biol.Cell 5，1-5。Dessauer，C.W.，Scully，T.T.和Gilman，A.G.(1997)J.Biol.Chem.272，22272-22277。
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Tesmer，J.J.G.，Sunahara，R.K.，Gilman，A.G.和Sprang，S.R.(1997)Science 278，1907-1916。
序列表<110>阿克萨姆有限公司<120>检测鸟苷酸环化酶活性的方法和鉴定法<130>SCB939PCT<160>11<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>32<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atgctaaagg acgtcacatt gcacaatctt aa 32<210>2<211>22<212>DNA<213>鼠(Rattus sp.)<400>2cggctaataa ggaggaaacc ac 22<210>3<211>24<212>DNA<213>鼠<400>3agaaacatgc ggctcactaa tcta 24<210>4<211>24<212>DNA<213>鼠<400>4cggacaccat gtacggtttt gtga 24<210>5<211>24
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<210>11<211>39<212>DNA<213>鼠<400>11gacagtattt ccgaagagat cataccgtgg catccgctg39
权利要求
1.用于在培养的真核细胞或原核细胞中测定可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)酶活性的方法，其包括A)向细胞中导入i)编码功能性连接至CRE诱导型启动子或MRE-CRE诱导型启动子的报告基因的载体，并且同时或分别地导入ii)编码能够催化ATP转化为环AMP的可溶性鸟苷酸环化酶的载体；B)使该细胞接触刺激或抑制sGC酶活性的化合物；C)测定报告基因活性。
2.在培养的真核细胞或原核细胞中鉴定调节sGC活性的分子的方法，其包括A)向细胞中导入i)编码功能性连接至CRE诱导型启动子或MRE-CRE诱导型启动子的报告基因的载体，并且同时或分别地导入ii)编码能够催化ATP转化为环AMP的可溶性鸟苷酸环化酶的载体；B)使该细胞接触候选分子；C)测定报告基因活性。
3.在培养的真核细胞或原核细胞中调节靶基因表达的方法，其包括A)向细胞中导入i)编码功能性连接至CRE诱导型启动子或MRE-CRE诱导型启动子的靶基因的载体，并且同时或分别地导入ii)编码能够催化ATP转化为环AMP的可溶性鸟苷酸环化酶的载体；B)将该细胞与能够以依赖NO或不依赖NO的方式刺激sGC酶活性的分子接触。
4.根据权利要求1-3的方法，其中MRE-CRE诱导型启动子含有3个MRE元件和5个CRE元件。
5.根据权利要求1-3的方法，其中使用编码大鼠可溶性鸟苷酸环化酶的载体。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的大鼠sGC在α亚基上携带Arg592→Gln突变以及在β亚基上携带Glu473→Lys和Cys541→Asp突变。
7.根据权利要求1-2的方法，其中报告基因编码选自萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)和光蛋白的蛋白质。
8.根据权利要求2的方法，其中候选分子能够以依赖NO或不依赖NO的方式刺激或抑制sGC活性。
9.根据权利要求3的方法，其中靶基因选自离子通道、GPCRs及核激素受体。
10.原核或真核宿主细胞，其含有i)编码功能性连接至CRE诱导型启动子或MRE-CRE诱导型启动子的报告基因的载体和ii)编码能催化ATP转化为环AMP的可溶性鸟苷酸环化酶的载体。
11.根据权利要求8的真核宿主细胞，其为CHO细胞。
12. 能够催化ATP转化为环AMP的可溶性鸟苷酸环化酶的用途，用于筛选调节sGC酶活性的化合物。
13.根据权利要求10-11的宿主细胞的用途，作为工具用于检测胞内NO释放。
全文摘要
本发明涉及可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)。更具体地，本发明提供了可高效和高灵敏度地检测可溶性鸟苷酸环化酶酶活性的基于细胞的鉴定法系统。在一个优选的实施方案中，本发明提供了筛选通过刺激或抑制其酶活性与sGC酶相互作用的分子以及可用于诊断或治疗sGC介导的功能异常或疾病的分子的方法。本发明还提供了用于所述方法中的基因构建体、载体和细胞。
文档编号G01N33/573GK1985003SQ200580023476
公开日2007年6月20日 申请日期2005年6月27日 优先权日2004年7月16日
发明者S·洛默尔, S·科拉扎, C·利贝拉蒂 申请人:阿克萨姆有限公司