用于评价乳腺癌预后的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于评价乳腺癌预后的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于评价患有乳腺癌，特别是早期阶段乳腺癌的患者预后的方法和组合物。
背景技术：
乳腺癌在美国女性中是第二最常见的癌症，通常仅低于皮肤癌。美国女性在其一生中发生乳腺癌的机会有八分之一，并且美国癌症协会估计今年在美国会报道250,000个以上的新乳腺癌病例。乳腺癌是女性中第二位的癌症死亡的主要原因，在2004年预计有40,000个以上的美国人死于该病。
最近十年内改进的检测方法、群体筛选检查和治疗上的进展已经显著改善了诊断为乳腺癌的女性的前景。目前，约80％的乳腺癌病例在该病的早期阶段得到诊断，此时其存活率最高。作为结果，约85％百分比的乳腺癌患者在诊断后至少存活5年。
尽管有了这些进展，但是约20％诊断为早期阶段乳腺癌的女性10年的效果差并且经历疾病的复发、转移或在该时间期限内死亡。然而，剩余80％的在早期诊断的乳腺癌患者具有良好的10年预后并且不太可能需要或得益于额外的攻击性辅助疗法(例如化疗)。当前的临床共识在于至少某些早期的瘤阴性乳腺癌患者应接受辅助化疗，但目前没有对患者分级以进行更具攻击性的治疗的广泛使用的检测法。由于大部分这些早期癌症患者在手术和/或放疗后，无需进一步治疗就可以享有长期存活，所以可能不适合于对所有这些患者推荐具有攻击性的辅助疗法，特别是考虑到与癌症化疗剂相关的显著副作用。能够在最初诊断时将这些早期阶段乳腺癌患者群体区分成良好和不良预后组的组合物和方法可以有助于临床医师选择合适的疗程。因此，需要用于评价乳腺癌患者，特别是早期阶段乳腺癌患者预后的方法。
重要的研究集中于鉴定用于评价乳腺癌预后和预测治疗反应的方法和因素(一般参见Ross和Hortobagyi，eds.(印刷中)MolecularOncology of Breast Cancer(Jones和Bartlett Publishers，Boston，MA)及其中引述的参考文献，将所有这些文献完整地引入本文作为参考)。预后指示物包括更多常规因素，诸如肿瘤大小、瘤的状态和组织学等级以及提供某些有关预后的信息和对具体治疗可能的反应的分子标记。例如，测定雌激素(ER)和孕酮(PR)类固醇激素受体状态已经成为评价乳腺癌患者中常规的程序。例如，参见Fitzgibbons等(2000)Arch.Pathol.Lab.Med.124966-978。激素受体阳性的肿瘤更有可能对激素疗法起反应并且一般还以攻击性较低的方式生长，由此导致具有ER+/PR+肿瘤的患者良好的预后。
人表皮生长因子受体2(HER-2/neu)，即跨膜酪氨酸激酶受体蛋白的超表达与乳腺癌预后差相关。Ross等(2003)TheOncologist307-325。乳腺肿瘤中的Her2/neu表达水平目前用于预测对抗-Her-2/neu抗体治疗剂曲妥单抗(Herceptin；Genentech)的反应。例如，参见文献同前，和Ross等，文献同上。此外，约三分之一的乳腺癌在肿瘤抑制基因p53中存在突变并且这些突变与疾病的侵害性增加和预后效果差相关。Fitzgibbons等，文献同上。Ki-67为在细胞周期的G1-M期过程中表达的非组蛋白核蛋白。研究已经证实细胞增殖标记Ki-67的超表达也与乳腺癌预后差相关，文献同前。
尽管目前的预后标准和分子标记在预测患者结果和选择合适的疗程方面提供了一定的指导，但是仍然存在对用于评价乳腺癌预后，特别是早期淋巴结阴性患者的特异性和灵敏性方法的显著需求。这类方法应将预后差的乳腺癌患者与那些预后良好的乳腺癌患者特异性区分开并且能够鉴定可能需要攻击性辅助疗法的高危早期阶段乳腺癌患者。
发明概述提供了用于评价癌症患者，特别是乳腺癌患者预后的方法和组合物。这些方法包括检测身体样品中至少一种，更特别的是至少两种生物标记的表达，其中生物标记或生物标记的组合的超表达预示癌症预后。本发明生物标记或生物标记的组合的超表达预示预后良好(即无疾病生存)或预后差(即，癌症复发、转移或死于潜在的癌症)。因此，本发明的方法能够将预后良好的乳腺癌患者与预后差的那些患者区分开来。本文披露的方法可以与常规临床因素(例如肿瘤大小、肿瘤等级、淋巴结状态和家族史)和/或分析分子标记，诸如Her2/neu、Ki67、p53和雌激素和孕酮激素受体的表达水平的评价联用。按照这种方式，本发明的方法能够更准确地评价乳腺癌预后。
本发明的生物标记为蛋白质和/或基因，其超表达预示癌症预后，包括那些参与细胞周期调节、DNA复制、转录、信号传导、细胞增殖、侵入或转移的生物标记。对本发明生物标记基因或蛋白质超表达的检测能够评价癌症预后并且有利于将乳腺癌患者分成良好和不良预后的风险组，例如目的在于治疗选择。
可以在蛋白质或核酸水平上评价生物标记表达。在某些实施方案中，提供了免疫组织化学技术，其使用抗体检测乳腺肿瘤样品中的生物标记表达。在本发明的该方面中，使用针对所关注的特异性生物标记的至少一种抗体。还可以通过基于核酸的技术，包括，例如杂交和RT-PCR检测表达。
组合物包括能够结合本发明生物标记的单克隆抗体。本文还包括这些单克隆抗体的抗原结合片段和变体、产生这些抗体的杂交瘤细胞系和编码这些单克隆抗体的氨基酸序列的分离的核酸分子。进一步提供了包含用于实施本发明方法的试剂的试剂盒。
附图简述

图1表示作为实际乳腺癌结果的函数的具有强度2的染色的细胞百分比分布。实施例4中提供了实验的详细描述。
图2提供了使用基于序列的用于SLPI/p21ras/E2F1/PSMB9/src/磷酸-p27组合的解读手段获得的ROC曲线。实施例5中提供了实验的详细描述。
图3提供了SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1生物标记组的预后表现的卡普兰-迈耶曲线图。实施例8中提供了实验的详细描述。
图4提供了一般乳腺癌患者群体的长期存活数据的图示，其不依赖于对生物标记超表达的分析。实施例8中提供了实验的详细描述。
图5提供了SLPI、src、PSMB9、p21ras、E2F1和MUC-1生物标记组的预后表现的卡普兰-迈耶曲线图。实施例9中提供了实验的详细描述。
发明详述本发明提供了用于评价癌症患者，特别是乳腺癌患者，更具体地说为早期阶段乳腺癌患者预后的方法和组合物。这些方法包括检测患者组织或体液样品中生物标记的表达并且测定所述生物标记是否超表达。用于实施本发明的生物标记或生物标记的组合的超表达预示乳腺癌预后(即差或良好预后)。因此，所关注的特定生物标记或生物标记的组合的超表达能够将可能经历疾病复发(即预后差)的乳腺癌患者与那些更可能保持无癌症(即预后良好)的患者区分开来。在本发明的某些方面中。这些方法包括检测乳腺肿瘤样品中至少一种生物标记的超表达，其预示乳腺癌预后差且由此鉴定更可能经历潜在癌症复发的患者。本发明的方法还可以用于辅助选择合适的疗程并且鉴定可以得益于更具攻击性疗法的患者。在具体的实施方案中，抗体和免疫组织化学技术用于检测所关注的生物标记的表达并且评价乳腺癌患者的预后。进一步提供了对于所关注的生物标记具有特异性的单克隆抗体和用于实施本发明方法的试剂盒。
所谓″乳腺癌″意指例如那些通过活组织检查分类为恶性病理情况的疾病。乳腺癌诊断的临床描述为医学领域众所周知的。本领域技术人员可以理解乳腺癌意指乳腺组织的任何恶性肿瘤，包括，例如癌和肉瘤。在具体的实施方案中，乳腺癌为原位导管癌(DCIS)、原位小叶癌(LCIS)或粘液癌。乳腺癌还指浸润性导管癌(IDC)或浸润性小叶癌(ILC)。在本发明最优选的实施方案中，所关注的受试者为怀疑或实际上诊断为乳腺癌的人类患者。
美国癌症联合委员会(AJCC)已经研发了使用″TNM″分类方案对乳腺癌疾病分期的标准化系统。评价患者的原发性肿瘤大小(T)、局部淋巴结状态(N)和存在/不存在远端转移(M)且然后基于该因素的组合分成0-IV期。在该系统中，以0-4的等级分类原发性肿瘤大小(T0＝无原发性肿瘤迹象；T1＝≤2cm；T2＝＞2cm-≤5cm；T3＝＞5cm；T4＝具有直接扩散至胸壁或皮肤的任何大小的肿瘤)。将淋巴结状态分类为N0-N3(N0＝局部淋巴结无转移；N1＝转移至可移动的、同侧的腋窝淋巴结；N2＝转移至同侧的彼此或与其它结构固定的淋巴结；N3＝转移至同侧的胸骨下淋巴结)。将转移分类为不存在(M0)或存在远端转移(M1)。尽管本发明包括处于任何临床阶段的乳腺癌患者，但是特别关注早期阶段乳腺癌中的乳腺癌患者。所谓″早期阶段乳腺癌″意指阶段0(原位乳腺癌)、I(T1、N0、M0)、IIA(T0-1、N1、M0或T2、N0、M0)和IIB(T2、N1、M0或T3、N0、M0)。早期阶段乳腺癌患者几乎不表现出或不呈现淋巴结牵连。本文所用的″淋巴结牵连″或″淋巴结状态″意指癌症是否已转移至淋巴结。基于此将乳腺癌患者分类为″淋巴结-阳性″或″淋巴结-阴性″。鉴定乳腺癌患者和给该疾病分期的方法为众所周知的并且可以包括手工诊查、活组织检查、患者病史和/或家族史的回顾和显像技术，诸如乳房造影法、磁共振影像学(MRI)和正电子发射断层摄影(PET)。
术语″预后″为本领域中公认的并且包括有关可能的疾病过程或疾病发展，特别是有关疾病缓解、疾病复发、肿瘤复发、转移和死亡的可能性的预测。″预后良好″意指患有癌症，特别是乳腺癌的患者保持无病(即无癌)的可能性。″预后差″意指潜在癌症或肿瘤的复发或再发、转移或死亡的可能性。分类为具有″良好结果″的癌症患者保持无潜在的癌症或肿瘤。相反，″结果差″的癌症患者经历疾病复发，肿瘤复发，转移或死亡。在具体的实施方案中，用于评价预后和结果的时限例如少于1年，1年，2年，3年，4年，5年，6年，7年，8年，9年，10年，15年，20年或20年以上。本文所用的用于评价预后或无病存活期的相关时间从手术摘除肿瘤或肿瘤生长的抑制、缓解或延缓开始。因此，例如，在具体的实施方案中，″预后良好″意指乳腺癌患者保持无潜在癌症或肿瘤至少5年，更特别的是至少10年期限的可能性。在本发明的其它方面中，″预后差″意指乳腺癌患者在少于5年，更特别的是少于10年内经历疾病复发，肿瘤复发，转移或死亡的可能性。上述提供的用于评价预后和结果的时限为例证性的且不用来起限定作用。
在本文所述的某些实施方案中，使用考克斯多因素疾病或死亡风险模型分析评价了生物标记和/或其它临床参数的预后表现，这是一种提供危害比及其置信区间的评估值存活数据的回归方法。考克斯模型为一种用于探查患者存活率与特定变量之间的相关性的公认的统计技术。这种统计方法能够评估指定其预后变量(例如如本文所述的特定生物标记的超表达)的个体的危害(即风险)。考克斯模型数据通常作为卡普兰-迈耶曲线提供。″危害比″为展示出特定预后变量的患者在任何指定的时间点处的死亡危险率。一般参见Spruance等(2004)Antimicrob.Agents & Chemo.482787-2792。在具体的实施方案中，所关注的生物标记对于评价因潜在乳腺癌导致乳腺癌复发或死亡的可能性具有统计学显著性。用于评价统计学显著性的方法为本领域众所周知的并且包括例如使用时序检验(log-rank test)考克斯分析和卡普兰-迈耶曲线。在本发明的某些方面中，p-值小于0.05构成统计学显著性。
如上文所述，大量临床和预后乳腺癌因素为本领域中已知的并且用于预测治疗效果和疾病复发的可能性。这类因素包括淋巴结牵连、肿瘤大小、组织学等级、家族史、雌激素和孕酮激素受体状态、Her2/neu水平和肿瘤倍性。本文所用的雌激素和孕酮激素受体状态意指这些受体是否在特定乳腺癌患者的乳腺肿瘤中表达。因此，″雌激素受体-阳性患者″展示出雌激素受体在乳腺肿瘤中表达，而″雌激素受体-阴性患者″无此情况。使用本发明的方法，可以独立地或与评价这些或其它临床和预后因素结合测定乳腺癌患者的预后。在某些实施方案中，将本文披露的方法与对其它预后因素的评价结合能够更准确地测定乳腺癌预后。可以将本发明的方法与分析例如Her2/neu、Ki67和/或p53表达水平结合。在通过本发明的方法评价乳腺癌预后时，还可以考虑其它因素，诸如患者临床史、家族史和月经状态。在某些实施方案中，可以将通过本文披露的方法获得的患者数据与临床信息分析和对乳腺癌预后的现存检验结合，以便研发参比实验预后规则系统。这类规则系统可应用于将乳腺癌患者，特别是早期阶段的乳腺癌患者分级成良好和差的预后群体。评价为具有差的预后的患者可以升级为接受更具攻击性的乳腺癌治疗的阶段。
本发明的方法在与分析其它已知预后指示物(例如淋巴结累及、肿瘤大小、组织学等级、雌激素和孕酮激素受体状态、Her2/neu水平、肿瘤倍性和家族史)相比能够更好地评价乳腺癌预后。在本发明的具体方面中，灵敏性和特异性等于或大于已知癌症预后评价方法的灵敏性和特异性。用于评价特异性和灵敏性的终点在于使用本发明的方法预测的预后或结果(即在诊断或接近诊断时)与实际临床效果(即患者在指定时间期限内是否保持无癌或经历复发)的比较。本文所用的″特异性″意指本发明方法可以准确鉴定真阴性的水平。在临床研究中，通过真阴性的数量除以真阴性与假阳性之和计算特异性。所谓″灵敏性″是指本发明方法可以准确鉴定为真阳性的样品的水平。在临床研究中通过真阳性的数量除以真阳性与假阴性之和计算灵敏性。在某些实施方案中，披露的用于评价乳腺癌的方法的灵敏性至少约为40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99％以上。此外，本发明方法的特异性优选至少约为40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99％以上。在另外的实施方案中，评价用于本发明预后方法的合并的灵敏性和特异性值。所谓″合并的灵敏性和特异性值″是指如上文所定义的单独特异性和灵敏性值的总和。本发明方法的合并的灵敏性和特异性值优选至少约为105％，110％，115％，120％，130％，140％，150％，160％或160％以上。
本文所用的″真″和″假″阳性和阴性的定义取决于在研究中的生物标记或生物标记的组合是良好结果的生物标记还是差结果的生物标记。即，就良好结果的生物标记而言(即，那些预示良好预后的生物标记)，″真阳性″意指那些如通过本发明方法测定的表现出所关注的生物标记超表达(例如，通过免疫组织化学染色为阳性)的样品，它们具有经证实的良好实际临床效果。相反，″假阳性″展示出良好结果的生物标记的超表达，而具有经证实的差的实际临床效果。″真阴性″和″假阴性″对于良好结果生物标记不展示出生物标记超表达(例如在免疫组织化学方法中不染色为阳性)并且分别具有经证实的差的和良好的实际临床效果。
类似地，就差结果的生物标记而言，″真阳性″意指那些表现出所关注的生物标记或生物标记组合超表达的样品，它们具有经证实的差的实际临床效果。即，″真阳性″对于良好和差结果的生物标记意指实际临床效果(即良好或差)得到准确预测的样品。″假阳性″展示出差结果的生物标记的超表达，但具有经证实的良好的实际临床效果。″真阴性″和″假阴性″对于差结果的生物标记不展示出生物标记超表达并且分别具有经证实的良好和差的实际临床效果。
通过几种可选择的策略控制乳腺癌，可以包括例如手术、放疗、激素疗法、化疗或其某些的组合。正如本领域中已知的，可以基于涉及的淋巴结数量、雌激素和孕酮受体状态、原发性肿瘤大小和诊断时疾病的阶段对个体乳腺癌患者做出治疗决定。对各种临床因素和临床试验的分析已经导致了International Consensus Panel of the St.Gallen Conference(2001)对于早期阶段乳腺癌确立的推荐和治疗指导方针。参见Goldhirsch等(2001)J.Clin.Oncol.193817-3827，将该文献完整地引入本文作为参考。这些指导方针表明对具有瘤阴性的乳腺癌的患者的治疗基本上随着基线预后而改变。当与具有相对低风险度复发的患者比较时推荐对具有相对高风险度复发的患者进行更具攻击性的治疗。已经证实对高风险度群体的化疗导致了复发的风险度降低。通常用放疗和激素疗法治疗具有低风险度类别的女性。使用本文披露的方法在诊断时将患者分级成预后差或预后良好风险度的组可以提供另外或可选的治疗决策因素。本发明的方法能够将预后良好的乳腺癌患者与更可能经历复发的那些患者(即在诊断时可能需要或得益于额外攻击性治疗的患者)区分开来。本发明的方法可特别应用于选择对早期阶段的乳腺癌患者合适的治疗。如上所述，在疾病早期阶段诊断的大部分乳腺癌患者在手术和/或放疗，而无另外的辅助疗法后可以享受长期存活。然而，这些患者中较大的百分比(约20％)会经历疾病复发或死亡，从而要求在临床上推荐某些或全部早期阶段的乳腺癌患者应接受辅助疗法(例如，化疗)。本发明的方法可应用于鉴定这种高风险度的预后差的早期阶段乳腺癌患者群体，并且由此确定哪些患者将会得益于持续和/或更具攻击性的疗法并且在治疗后停止监测。例如，可以对通过本文披露的方法评价为预后差的早期阶段乳腺癌患者在手术和/或放疗后选择更具攻击性的辅助疗法，诸如化疗。在具体的实施方案中，本发明的方法可以与St.Gallens Conference建立的治疗指导方针联用以做出更明智的乳腺癌治疗决定。还可以将用于评价乳腺癌预后的本发明方法与本领域中公知的其它预后方法和分子标记分析(例如，Her2/neu、Ki67和p53表达水平)联用，目的在于选择合适的乳腺癌治疗。此外，可以将本发明的方法与随后研发的本领域目前未知的预后方法和分子标记分析联用。
本文披露的方法还可应用于预测乳腺癌患者对所选择的治疗的反应。所谓″预测乳腺癌患者对所选择的治疗的反应″是指评价患者采用特定的治疗会体验阳性或阴性结果的可能性。本文所用的″预示阳性治疗结果″意指患者会体验因所选择的治疗而产生的有益效果(例如，完全或部分好转、肿瘤大小减小等)的可能性增加。所谓″预示阴性治疗结果″意指患者就潜在乳腺癌发展而言不会得益于选择的治疗的可能性增加。在本发明的某些方面中，所选择的治疗为化疗。
在某些实施方案中，提供了用于预测乳腺癌患者存活可能性的方法。特别地，这些方法可以用于预测长期无病存活的可能性。所谓″预测乳腺癌患者存活可能性″意指评价患者因潜在乳腺癌而死亡的风险度。″长期无病存活″意指患者在初始诊断或治疗后，在至少5年，更特别的是至少10年或10年以上期限内不会死于潜在乳腺癌或经历潜在乳腺癌的复发。这类用于预测乳腺癌患者存活可能性的方法包括检测患者样品中多种生物标记的表达，其中存活，特别是长期无病存活的可能性因测定的在患者样品中超表达的生物标记数量增加而下降。例如，在本发明的一个方面中，测定了至少5种生物标记的表达，其中无一种生物标记的超表达预示存活的可能性增加，并且其中两种或多种生物标记的超表达预示存活的可能性下降。例如，与本领域中可获得的乳腺癌存活统计表相比可以评价存活的可能性。在其它实施方案中，用于预测乳腺癌患者存活可能性的方法包括测定至少6种生物标记的表达并且评价这些超表达的生物标记的数量。用于这些方法的生物标记选自例如，E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9。一般参见实施例8和9。
本发明的生物标记包括基因和蛋白质。这类生物标记包括包含编码生物标记的核酸序列的完整或部分序列或这种序列的互补物的DNA。生物标记核酸还包括包含所关注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。生物标记蛋白质为由本发明的DNA生物标记编码或相当于本发明的DNA生物标记的蛋白质。生物标记蛋白质包含任何生物标记蛋白质或多肽类的完整或部分氨基酸序列。生物标记基因和蛋白质的片段和变体也包括在本发明中。所谓″片段″意指多核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分和由此编码的蛋白质。为生物标记核苷酸序列的片段的多核苷酸一般包含至少10，15，20，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，800，900，1,000，1,100，1,200，1,300或1,400个连续的核苷酸或达到存在于本文披露的全长生物标记多核苷酸中的核苷酸数量。生物标记多核苷酸的片段一般编码至少15，25，30，50，100，150，200或250个连续的氨基酸或达到存在于本发明的全长生物标记蛋白质中的氨基酸总数。″变体″意指基本上相似的序列。一般而言，正如通过序列比对程序所测定的，本发明的特定生物标记的变体与该生物标记具有至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99％以上的序列同一性。
″生物标记″为任何基因或蛋白质，其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织中的表达水平相比得到改变。本发明的生物标记为基因和蛋白质，其超表达与癌症，特别是乳腺癌预后相关。在具体的实施方案中，所关注的生物标记或生物标记的组合在患者样品中的选择性超表达预示癌症预后差。所谓″预示预后差″意指如本文定义的特定生物标记或生物标记的组合的超表达与潜在癌症或肿瘤的复发或再发、转移或死亡的可能性增加相关。例如，″预示预后差″可以指在5年，更特别的是10年内潜在癌症或肿瘤的复发或再发、转移或死亡的可能性增加。预示预后差的生物标记在本文中称作″不良结果生物标记″。在本发明的其它方面中，不存在所关注的生物标记或生物标记的组合的超表达预示预后良好。本文所用的″预示预后良好″意指如本文所定义的患者保持无癌的可能性增加。在某些实施方案中，″预示预后良好″意指在5年，更特别的是10年内患者保持无癌的可能性增加。这类生物标记可以称作″良好结果生物标记″。
本发明的生物标记包括任何基因或蛋白质，其超表达如本文所述与乳腺癌预后相关。生物标记包括预示乳腺癌预后差(即不良结果生物标记)以及预示预后良好(即良好结果生物标记)的基因和蛋白质。特别关注的生物标记包括参与细胞生长和增殖调节、细胞周期控制、DNA复制和转录、编程性细胞死亡、信号转导、血管发生/淋巴生成或转移的蛋白质和基因。在某些实施方案中，所述的生物标记调节涉及组织重建、胞外基质降解和相邻组织侵入的蛋白酶系统。尽管其超表达预示乳腺癌预后的任何生物标记都可以用于实施本发明，但是在具体的实施方案中，生物标记选自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9、MCM6和p53组成的组。参见表43。在一个实施方案中，所关注的生物标记包含SLPI、PSMB9、磷酸-p27、src、E2F1、p21ras或p53。在本发明的一个方面中，用于评价乳腺癌预后的方法包括检测E2F1和SLPI的表达，其中这些生物标记中至少一种的超表达预示预后差。在另一个实施方案中，这些方法包括检测E2F1、src和SLPI的表达，其中生物标记中至少两种的超表达预示乳腺癌预后差。在另一个实施方案中，本发明的方法包括检测E2F1、src、PSMB9和SLPI的表达，其中这些生物标记中的至少两种的超表达预示乳腺癌预后差。在本发明的其它方面中，检测E2F1、SLPI、PSMB9、p21ras和src的表达并且这些生物标记中的至少两种的超表达预示预后差。在另一个实施方案中，所述的方法包括检测患者样品中SLPI、p21ras、E2F1、PSMB9、磷酸-p27和src的表达，其中这些生物标记中的至少四种的超表达预示预后差。
在另一个实施方案中，所关注的生物标记包含E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9。在本发明的一个方面中，用于评价乳腺癌预后的方法包括检测E2F1和SLPI的表达，其中这些生物标记中的至少一种的超表达预示预后差。在另一个实施方案中，所述的方法包括检测E2F1、SLPI和PSMB9的表达，其中这些生物标记中的至少两种的超表达预示乳腺癌预后差。在另一个实施方案中，本发明的方法包括检测E2F1、SLPI、MUC-1和src的表达，其中这些生物标记中的至少两种的超表达预示乳腺癌预后差。在本发明的其它方面中，检测E2F1、SLPI、MUC-1、src和p21ras的表达并且这些生物标记中的至少两种的超表达预示预后差。在另一个实施方案中，所述的方法包括检测患者样品中E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9的表达，其中这些生物标记中的至少四种的超表达预示预后差。
分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)为一种非特异性抑制剂，它可以使大量蛋白酶失活，包括白细胞弹性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶G)。已知SLPI涉及与组织修复相关的炎症和炎症反应。一般认为蛋白酶抑制剂可抵抗进行性肿瘤和转移。然而，肿瘤中丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI′s)的表达通常与癌症患者预后差相关。组织蛋白酶G在乳腺癌中超表达并且为预后差的指示物。其抑制作用通过防止上皮表面受到内源性蛋白酶攻击而促成免疫应答。SLPI的基因位置为20q12，其为涉及乳腺癌染色体改变和非整倍性的染色体区。
PSMB9为蛋白酶体B-型家族，也称作T1B家族中的成员，为20S核心β-亚单位。该基因位于MHC(主要组织相容性复合物)的II类区。该基因的表达由γ-干扰素诱导并且该基因产物置换了免疫蛋白酶体中的催化亚单位1(蛋白酶体β6亚单位)。需要蛋白酶解加工产生成熟亚单位。
NDRG-1(调节的N-Myc下游)在细胞分化过程中得到增量调节，被胚细胞中的N-myc和c-myc阻遏并且在几种肿瘤细胞中得到抑制。超表达可能与缺氧和随后诱导血管发生的信号传导有关。缺氧导致转录因子缺氧诱导型因子1(HIF-1)蓄积，从而在缺氧诱导型基因，诸如那些用于血管内皮生长因子(VEGF)和NDRG-1的基因的表达中达到顶点。发现NDRG-1在某些乳腺癌中为超表达的mRNA。NDRG-1位于与c-myc基因相邻的染色体8q24上。
MUC1为在大部分分泌上皮，包括乳腺和某些造血细胞上表达的大量O-糖基化跨膜蛋白。其在泌乳的乳腺中大量表达并且在90％以上的乳腺癌和转移灶中超表达。在正常乳腺中，其在腺上皮的上表面上表达。
p27为细胞周期的关键调节物并且参与G1至S期进展。它在G1期中与细胞周期蛋白E/cdk2复合物并且还与D-型细胞周期蛋白-cdks发生特异性相互作用。p27可以在苏氨酸187上被Cdks磷酸化。p27在苏氨酸187上的磷酸化还是细胞周期依赖性的，存在于增殖细胞中，但在G1细胞中无法检测到。在增殖细胞和许多类型的侵害性人癌中观察到p27降解的活化。p27的超表达可以导致编程性细胞死亡抑制和对某些化疗的抗性。
蛋白酪氨酸激酶的Src家族(包括Src、Lyn、Fyn、Yes、Lck、Blk、Hck等)在调节真核细胞生长和分化中是重要的。Src活性受具有相反作用的两个位点上的酪氨酸磷酸化调节。激酶结构域的活化环中Tyr416的磷酸化增量调节该酶。Csk对C-末端尾中的Tyr527的磷酸化使该酶的活性降低。
E2F1为涉及调节G1和S期细胞周期蛋白，特别是细胞周期蛋白D1的转录因子家族中的成员。这些蛋白质参与细胞周期调节和控制DNA合成的Rb途径。在细胞周期的G1期中，E2F转录因子在无活性复合物中结合Rb肿瘤抑制蛋白。在细胞周期的G1/S间界中，Rb蛋白高度磷酸化并且从其抑制复合物中释放E2F转录因子。然后E2F转录因子使那些负责细胞周期的S-期的基因的转录活化，从而主要导致启动DNA合成和准备有丝分裂以及随后的细胞分裂。已经证实E2F1的超表达导致可能通过细胞周期蛋白D1-依赖性激酶活性抑制与诱导p16相关转录物结合诱导编程性细胞死亡。此外，在转录水平上调节E2F1，即E2F1蛋白水平也受泛素-蛋白体依赖性降解途径控制。泛素化受到直接控制细胞周期进展的方面的Rb和E2F1复合物阻断。
p21ras为一大组涉及信号转导的胞质蛋白中的成员。鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)包含一大组涉及信号转导的存在于真核细胞中的胞质蛋白。存在两种形式，即大的异源三聚体G蛋白和较小的单体。3种ras癌基因H-ras、K-ras和N-ras为较小的单体G蛋白中的成员并且分别位于染色体11、12和1上。它们编码称作p21s的21-kD蛋白并且包含188个氨基酸。p21ras蛋白涉及正常的细胞生长、蛋白酶活性和细胞粘着。
p21ras的三种形式通过使配体介导的胞外受体活化与胞内酪氨酸激酶活化和随后启动大量与乳腺癌进展相关的细胞过程联合共同起作用，所述的细胞过程包括DNA复制、增殖和非附着依赖性生长。K-和H-ras基因通常与乳腺癌最为相关。在这两种ras基因中，密码子12和13上的突变是常见的。这些功能获得突变导致组成型活化，其使ras信号传导途径内正常的配体诱导的信号转导分开。乳腺癌中不太常见的是N-ras的牵连。对乳腺癌中N-ras相关改变报导了两种机制导致癌基因组成型活化的密码子61上的突变，它与上述对K-和H-ras提及的突变类似，和染色体扩增。此外，除胞内信号传导途径的活化外，还报导了ras癌基因诱导对组织重建和侵害而言重要的蛋白酶的超表达。H-ras涉及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)超表达，并且N-ras与MMP-9超表达相关。一般参见Correll和Zoll(1988)HumanGenetics 79225-259；Tong等(1989)Nature 33790-93；Watson等(1991)乳腺癌Res.Treat.17161-169；Dati等(1991)Int.J.Cancer 47833-838；Archer等(1995)Br.J.Cancer 721259-1266；Bland等(1995)Ann.Surg.221706-718；Shackney等(1998)Clin.Cancer Res.4913-928；和Gohring等(1999)Tumor Biol.20173-183，将所有这些文献完整地引入本文作为参考。对p21ras蛋白的任何形式(即H-、K-、N-ras)的检测包括在本发明内。
微染色体维持(MCM)蛋白在真核DNA复制中起主要作用。MCM蛋白在其高度保守的中心结构域中各自具有DNA-依赖性ATP酶基序。当正常细胞从细胞周期的G0进入G1/S期时，MCM蛋白的水平一般以可变方式增加。在G0期中，MCM2和MCM5蛋白远不如MCM7和MCM3蛋白丰富。MCM6与MCM2、MCM4和MCM7形成结合组蛋白H3的复合物。此外，MCM4、MCM6和MCM7的亚复合物具有解旋酶活性，这种活性由MCM6的ATP-结合活性和MCM4的DNA-结合活性介导。例如，参见Freeman等(1999)Clin.Cancer Res.52121-2132；Lei等(2001)J.Cell Sci.1141447-1454；Ishimi等(2003)Eur.J.Biochem.2701089-1101，将所有这些文献完整地引入本文作为参考。
DARPP32为蛋白质磷酸酶1的抑制剂，其生物功能和抑制活性通过DARPP32蛋白内的特异性氨基酸残基磷酸化得到调节。苏氨酸34(T34)磷酸化使DARPP32蛋白成为特异性蛋白质磷酸酶1抑制剂。然而，苏氨酸75(T75)磷酸化使DARPP32成为蛋白激酶A(PKA)的抑制剂。DARPP32的基因位置为17q21.2，已知它与17q12上的her2/neu(c-erb-B2受体酪氨酸激酶)基因相邻。该区涉及乳腺癌染色体扩增和导致25-35％的乳腺癌中的结果差。几篇出版物已经证实乳腺癌中这种17q12-21扩增子的特异性转录活化，其中大量基因位于超表达的这种扩增子内。
p53在细胞中起多种作用。高水平的野生型，而非突变型p53的表达存在两种结果细胞周期停滞或编程性细胞死亡。DNA损伤剂诱导细胞中p53水平的观察结果导致将p53定义为关卡因子，其可能与酵母中的fad9基因产物具有亲缘关系。尽管对存活力而言并非必要，但是响应于基因毒性应激，p53作为″紧急制动器″起作用，以便诱导停滞或编程性细胞死亡，从而防止基因组蓄积过量突变。与这一概念一致的是，已经证实缺乏p53的细胞在遗传上不稳定，且由此更易发生肿瘤。p53蛋白位于细胞核中并且极不稳定。p53在所有人体肿瘤的大约50％中，主要是在DNA-结合结构域密码子中发生突变。
尽管已经详细讨论了上述生物标记，但是可以将其超表达预示乳腺癌预后的任何生物标记用于实施本发明，包括本领域中尚未鉴定的生物标记。这类生物标记包括例如参与细胞增殖、细胞周期控制或癌症活动性和侵害的一般性机制的基因和蛋白质。可能关注的生物标记包括环加氧酶-2(cox-2)、rhoC、c-myc、尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)、维尔姆斯肿瘤抑制基因、akt激酶和骨桥蛋白。例如，参见Perou等(2000)Nature 406747-752；Sorlie等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.9810869-10874；Van′t Veer等(2002)Nature415530-536；Huang等(2003)Lancet 3611590-1596，将所有这些文献完整地引入本文作为参考。
在具体的实施方案中，所述的生物标记为参与信号转导途径的激酶，诸如PI3K调节a、LTk、Ser/thr激酶15、MAPK8IPI、MAPKAPK2和PK428、PRKR。生长因子、胞外信号转导蛋白和胞外基质蛋白也为关注的生物标记。这类蛋白质包括EGFR、TNF受体相关因子4、GFR结合蛋白7、ErbB2(her 2)、VEGF、GDF1、IGFBP5、EGF8 ras同源物、MMP 9、MMP 7、SLPI、角蛋白5、角蛋白17、层粘连蛋白γ2(层粘连蛋白V)、向宁蛋白和微管蛋白。
在本发明的某些方面中，所述的生物标记包含参与染色体浓缩和维持的基因和蛋白质，诸如，例如Cc相关的，HMG非组蛋白染色体11，MMD5，MCM5，MCM6和Swi/snf相关肌动蛋白。与着丝粒和中心体功能相关的生物标记，包括CENPA、CENPF、CENPE、Bub 1、polo样激酶和HsEg 5、MCAK和HSET也可以用于本文所述的方法。本发明的生物标记还可以包含转录因子，特别是那些与细胞周期调节相关的转录因子。所关注的转录因子包括，但不限于E2F1、E2F4、NDRG-1、ORC6L、PCNA、核因子1、EZH2和TFAP2A。细胞周期蛋白，诸如CDC20、CDC 25B、细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白F也可以用于实施披露的方法。
尽管本发明的方法需要检测患者样品中的至少一种，更特别的是至少两种生物标记以便评价乳腺癌预后，但是3，4，5，6，7，8，9，10或10种以上生物标记也可以用于实施本发明。认为检测身体样品中一种以上的生物标记可以用于评价癌症，特别是乳腺癌预后。因此，在某些实施方案中，使用两种或多种生物标记，更优选两种或多种互补生物标记，所谓″互补″意指检测身体样品中生物标记的组合导致在大于如果仅使用一种生物标记鉴定的百分比的病例中准确测定癌症预后。因此，在某些情况中，可以通过使用至少两种生物标记对癌症预后进行更准确的测定。因此，如果使用至少两种生物标记，那么针对于不同生物标记蛋白的至少两种抗体将用于实施本文披露的免疫组织化学方法。可以使抗体同时或依次接触身体样品。
当使用两种或多种生物标记的组合时，生物标记一般在统计学上基本上彼此独立。所谓″统计学上独立的″生物标记意指由此产生的预后是独立的，使得一种生物标记不会提供基本上重复的有关互补生物标记方面的信息。例如，这可以确保生物标记不与第一种生物标记联用，此时两种生物标记基本上是在统计学上独立的。两种生物标记的依赖性可以表明它们为成对的并且添加第二种生物标记不会对指定生物标记对的预后能力附加额外的值。为了优化指定组生物标记的预后能力，还需要通过在与该组中另一种生物标记比较时使提供复制的预后信息的生物标记的应用减少到最低限度来降低信号″噪声″的量。用于测定统计学独立性的方法为本领域中公知的。可以使用任何方法评价所关注的生物标记的统计学独立性，包括，例如美国申请号＿＿标题为″分析和优化癌症预后的标记候选物的方法和计算机程序(Methods and Computer Programs for Analysis and Optimizationof Marker Candidates for Cancer Prognosis)″中披露的方法，该申请与本申请同时提交并且将其完整地引入本文作为参考。如果彼此独立，那么将预后生物标记用于实施本发明的方法，通过检测2，3，4，5，6，7或7种以上生物标记的表达增加预后值。在这类情况中，可以使用独立的生物标记的任何组合。
本领域技术人员还认为可以将一组生物标记用于按照本发明的方法评价乳腺癌患者的预后。在某些实施方案中，提供了包含至少两种生物标记的一组，所述的生物标记选自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9、MCM6和p53组成的组。例如，具体的一组生物标记可以包含E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9中的所有或亚组。一组生物标记可以包含所关注的任何数量的生物标记或其组合。在本发明的某些方面中，一组包含至少两种统计学上独立的预后生物标记。
在具体的实施方案中，用于评价乳腺癌预后的方法包括收集患者身体样品，优选乳腺组织样品，更优选原发乳腺肿瘤组织样品；使该样品接触至少一种对所关注的生物标记具有特异性的抗体；检测抗体结合并且测定所述的生物标记是否得到超表达。即，将样品与生物标记抗体一起孵育足以形成抗体-抗原复合物的时间，并且例如用标记的二次抗体检测抗体结合。正如根据抗体结合所确定的，将表现出至少一种不良结果的生物标记的超表达的样品分类为具有差的预后。类似地，将展示出至少一种良好结果的生物标记的患者样品分类为具有良好的预后。此外，某些所关注的生物标记组合的超表达特别用于区分具有差预后的乳腺癌患者与那些具有良好预后的乳腺癌患者。在本发明的某些方面中，所述的方法包括检测患者样品中的两种或多种生物标记并且测定所述生物标记是否得到超表达，其中这些生物标记中的所有或某些亚组的超表达预示乳腺癌预后。例如，在一个实施方案中，所述的方法包括检测SLPI、p21ras、E2F1、PSMB9、磷酸-p27和src的表达，其中这些生物标记中至少四种的超表达预示预后差。在本发明的另一个方面中，所述的方法包括检测SLPI、E2F1和src的表达，其中这些生物标记中至少两种的超表达预示预后差。在其它实施方案中，所述的方法包括检测E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9的表达，其中这些生物标记中至少四种的超表达预示预后差。在本发明的另一个方面中，所述的方法包括检测SLPI、E2F1和MUC-1的表达，其中这些生物标记中至少两种的超表达预示预后差。
所谓″身体样品″意指细胞、组织或体液的任何取样，其中可以检测生物标记的表达。这类身体样品的实例包括，但不限于血液、淋巴、尿、妇科液体、活检组织和涂片。用于本发明的体液包括血液、尿、唾液、乳头吸出物或任何其它身体分泌物或其衍生物。血液可以包括全血、血浆、血清或血液的任何衍生物。在优选的实施方案中，身体样品包含乳腺细胞，特别是来自活检组织的乳腺组织，更特别的是乳腺肿瘤组织样品。身体样品可以通过各种技术获自患者，例如通过刮取或拭抹区域，通过使用针头抽吸体液或通过取出组织样品(即，活组织检查)。用于收集各种身体样品的方法为本领域众所周知的。在某些实施方案中，例如，通过细针抽吸活组织检查、磁芯针活组织检查或切除活组织检查获得乳腺组织样品。可以将固定和染色溶液施用于细胞或组织上以便保存样本和有利于检查。可以将身体样品，特别是乳腺组织样品转至载玻片上以便在放大倍数下观察。在优选的实施方案中，身体样品为福尔马林固定的石蜡包埋的乳腺组织样品，特别是原发性乳腺肿瘤样品。
本文包括用于检测生物标记表达的本领域中可利用的任何方法。可以在核酸水平或蛋白质水平上检测本发明生物标记的表达。所谓″检测表达″意指测定生物标记基因或蛋白质的量或存在。因此，″检测表达″包括经测定生物标记未得到表达，未得到可检测性表达，以低水平表达，以正常水平表达或超表达的情形。为了测定超表达，可以将待检查的身体样品与来源于健康人的相应身体样品进行比较。即，表达的″正常″水平为在例如来自未患有乳腺癌的人受试者或患者的乳腺组织样品中生物标记的表达水平。这种样品可以以标准化形式存在。在某些实施方案中，测定生物标记超表达无需在身体样品与来源于健康人的相应身体样品之间进行比较。例如，检测乳腺肿瘤样品中的预示预后差的生物标记的超表达可以排除对与来源于健康人的相应乳腺组织样品进行比较的需要。此外，在本发明的某些方面中，所关注的生物标记或生物标记的组合没有表达，过低表达或正常表达(即不存在超表达)提供了有关乳腺癌患者预后的有用的信息。
用于评价本发明生物标记表达的方法包括以核酸或蛋白质水平测定生物标记的量或存在的任何方法。这类方法为本领域众所周知的并且包括，但不限于蛋白质印迹、RNA印迹、DNA印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞计量术、免疫组织化学、核酸杂交技术、核酸逆转录方法和核酸扩增方法。在具体的实施方案中，例如，使用针对于特异性生物标记蛋白的抗体在蛋白质水平上检测生物标记的表达。这些抗体可以用于各种方法，诸如蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀或免疫组织化学技术。同样，可以将乳腺组织，特别是乳腺肿瘤组织的免疫染色与临床信息评价、常规预后方法和本领域公知的分子标记(例如Her2/neu、Ki67、p53和激素受体状态)的表达联用。以这种方式，披露的方法可以允许更准确的确定乳腺癌预后。
在一个实施方案中，将对生物标记蛋白具有特异性的抗体用于检测身体样品中生物标记蛋白的表达。所述的方法包括从患者获得身体样品，使该身体样品接触至少一种针对于SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9或MCM6的抗体并且检测抗体结合以便确定生物标记是否在患者样品中超表达。生物标记蛋白的超表达预示预后，更特别的是不良的乳腺癌预后。在其它实施方案中，本发明的方法包括检测至少两种生物标记的表达，其中生物标记中的至少一种的超表达预示预后。这类方法可以包含检测患者样品中的多种生物标记，其中这些生物标记中的所有或亚组的超表达预示乳腺癌预后。
本发明的一个方面提供了用于评价乳腺癌患者预后的免疫组织化学技术。具体地说，所述的方法包括对乳腺组织样品，更特别的是乳腺肿瘤样品中预示预后的生物标记进行抗体染色。本领域技术人员认为下文披露的免疫组织化学方法可以手动或例如，使用自动染色机通用染色系统(Autostainer Universal Staining System)(Dako)以自动化方式进行。实施例1中提供了用于乳腺组织样品的抗体染色(即，免疫组织化学)的一种方案。
在一种免疫组织化学方法中，例如，通过本领域已知的活组织检查技术采集患者乳腺组织样品。冷冻样品以便随后制备或即刻放入固定溶液中。可以通过用试剂，诸如福尔马林、戊二醛(gluteraldehyde)、甲醇等处理固定组织样品并且包埋在石蜡中。用于由福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品制备免疫组织化学分析用载玻片的方法为本领域众所周知的。
在某些实施方案中，特别是本发明的免疫组织化学方法中，样品可能需要修饰以使生物标记抗原易于进行抗体结合。例如，组织样品的福尔马林固定导致蛋白质广泛交联，这可能导致对抗原位点的掩蔽或破坏和随后抗体染色弱。本文所用的″抗原回收″或″抗原暴露″意指用于增加抗原易接近性或回收例如福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品中的抗原性。用于使抗原更易于进行抗体结合的任何方法都可以用于实施本发明，包括那些本领域中已知的抗原回收方法。例如，参见Hanausek和Walaszek，eds.(1998)Tumor Marker Protocols(HumanaPress，Inc.，Totowa，New Jersey)；和Shi等，eds.(2000)AntigenRetrieval TechniquesImmunohistochemistry and MolecularMorphology(Eaton Publishing，Natick，MA)，将这两篇文献完整地引入本文作为参考。
抗原回收方法包括，但不限于用蛋白酶(例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等)或抗原回收溶液处理。例如，所关注的抗原回收溶液包括柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0(Dako)；tris缓冲液，pH 9.5(Biocare)；EDTA，pH 8.0(Biocare)；L.A.B.(″LiberateAntibodyBinding Solution；″Polysciences)；抗原回收Glyca溶液(Biogenex)；柠檬酸盐缓冲溶液，pH 4.0(Zymed)；Dawn洗涤剂(Proctor & Gamble)；去离子水；和2％冰醋酸。在某些实施方案中，抗原回收包括将抗原回收溶液施用在福尔马林固定的组织样品上且然后在烘箱(例如，60℃)、蒸气发生器(例如，95℃)或加压蒸煮器(例如，120℃)内和在规定的温度下将该样品加热确定的时间期限。在本发明的其它方面中，抗原回收可以在室温下进行。孵育时间随选择的具体抗原回收溶液和孵育温度的不同而改变。例如，可以将抗原回收溶液施用在样品上短至5，10，20或30分钟或长达过夜。确定合适的抗原回收溶液和最佳孵育时间和温度的试验设计为标准的并且完全属于本领域技术人员常规的能力范围。
在抗原回收后，使用合适的封闭剂，例如过氧化氢封闭样品。然后将针对于所关注的生物标记的抗体与样品一起孵育足以使抗原-抗体结合的时间。如上所述，本领域技术人员可以理解在某些情况中，可以通过检测患者样品中一种以上生物标记的超表达而获得更为准确的乳腺癌预后。因此，在具体的实施方案中，将针对于两种不同生物标记的至少两种抗体用于评价乳腺癌患者的预后。如果使用一种以上的抗体，那么可以将这些抗体作为单独抗体试剂依次或作为抗体混合物同时加入到单一样品中。或者，可以将各单独抗体加入到来自单一患者样品的单独的组织切片中并且汇集所得数据。
用于检测抗体结合的技术为本领域众所周知。可以通过使用化学试剂检测与所关注的生物标记结合的抗体，所述的化学试剂产生相当于抗体结合水平和由此相当于生物标记蛋白表达水平的可检测信号。例如，可以通过使用与标记的聚合物缀合的二次抗体检测抗体结合。标记的聚合物的实例包括，但不限于聚合物-酶缀合物。这些复合物中的酶一般用于催化抗原-抗体结合位点上色原的沉积，由此产生相当于所关注生物标记的表达水平的细胞染色。特别关注的酶包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。商品抗体检测系统，诸如，例如DakoEnvision+系统和Biocare Medical′s Mach 3系统可以用于实施本发明。
在本发明的一种免疫组织化学方法中，通过使用与二次抗体缀合的HRP标记的聚合物检测与生物标记结合的抗体。使用色原3，3-二氨基联苯胺(DAB)对载玻片中的抗体结合进行染色且然后用苏木精，并且可选地用上蓝剂，诸如氢氧化铵复染。在本发明的某些方面中，由病理学家通过显微镜观察载玻片以便评价细胞染色(即，生物标记超表达)并且评价乳腺癌预后。或者，通过自动化显微镜检查法或由工作人员借助于有利于鉴定阳性染色细胞的计算机软件观察样品。
术语″抗体″广泛包括抗体和重组抗体的天然存在形式，诸如单链抗体、嵌合和人源化抗体以及多特异性抗体和所有上述抗体的片段和衍生物，这些片段和衍生物至少具有抗原结合位点。抗体衍生物可以包含与抗体缀合的蛋白质或化学部分。
″抗体″和″免疫球蛋白″(Igs)为具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体表现出对抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括这两种抗体和其它缺乏抗原特异性的抗体样分子。后一种类型的多肽类例如以低水平由淋巴系统产生并且以增加水平由骨髓瘤产生。
术语″抗体″以其最广泛的含义使用并且涵盖完全装配的抗体，可以结合抗原的抗体片段(例如Fab′、F′(ab)2、Fv、单链抗体、双抗体)和包含上述的重组肽类。
本文所用的术语″单克隆抗体″意指获自一群基本上同种抗体的抗体，即，包含该群体的各个抗体相同，但是可能有可以以最少量存在的天然存在的突变。
″抗体片段″包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等(1995)Protein Eng.8(10)1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种相同的各自带有单个抗原结合位点的抗原结合片段，称作″Fab″片段；和残留″Fc″片段，其名称反映出它易于结晶35的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab′)2片段。
″Fv″为含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，该区由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链和一个轻链可变区可以通过柔性肽接头共价连接，使得该轻链和重链可以以与双链Fv种类类似的″二聚化″结构形式结合。在该构型中，每种可变区中的三个CDRs相互作用以确定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。6个CDRs共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变区(或仅包含3个对抗原具有特异性的CDRs的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力，不过，亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还含有轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)。Fab片段不同于Fab′片段之处在于在重链CH1结构域的羧基末端上增加了几个残基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸。Fab′-SH为本文对其中恒定区的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab′的命名。F(ab′)2抗体片段最初作为Fab′片段对产生，在它们之间存在铰链半胱氨酸。
可以使用Kohler等(1975)Nature 256495-496的方法或其改进的方法制备单克隆抗体。一般而言，使用含有抗原的溶液对小鼠进行免疫接种。通过在盐水，优选在佐剂，诸如弗氏完全佐剂中混合或乳化含抗原的溶液并且通过非肠道注射该混合物或乳液进行免疫接种。本领域中已知的任何免疫接种方法都可以用于获得本发明的单克隆抗体。在对动物进行免疫接种后，摘除脾(和任选几个大的淋巴结)并且分离成单细胞。可以通过将细胞混悬液在用所关注的抗原包被的平板或孔上涂布来筛选脾细胞。表达对抗原具有特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞结合平板并且不被冲洗掉。然后诱导所得的B细胞或所有分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤并且在选择培养基中培养。通过连续稀释将所得细胞铺板并且检测特异性结合所关注的抗原(且不结合无关抗原)的抗体的产生。然后在体外(例如，在组织培养瓶或空心纤维反应器中)或在体内(如小鼠的腹水)培养选择的分泌单克隆抗体(mAb)的杂交瘤。
作为使用杂交瘤的备选，正如美国专利US5,545,403；US5,545,405；和US5,998,144中披露的，可以在细胞系，诸如CHO细胞系中产生抗体，将上述专利引入本文作为参考。简言之，用能够分别表达轻链和重链的载体转染细胞系。通过在单独的载体上转染两种蛋白质，可以产生嵌合抗体。另一个优点在于抗体的正确糖基化。还可以通过用生物标记蛋白筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)而由此分离结合该生物标记蛋白的免疫球蛋白文库成员来鉴定和分离单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒为商购的(例如Pharmacia重组噬菌体抗体系统(RecombinantPhage Antibody System)，目录号27-9400-01；和StratageneSurfZAP 9噬菌体展示试剂盒(Phage Display Kit)，目录号240612)。另外，适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可以在下列文献中找到美国专利US 5,223,409；PCT公开号WO92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；93/01288；WO 92/01047；92/09690；和90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology91370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 381-85；Huse等(1989)Science 2461275-1281；Griffiths等(1993)EMSO J.12725-734。
可以通过用生物标记蛋白免疫原免疫接种合适的受试者(例如家兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物)制备多克隆抗体。可以通过标准技术，诸如使用应用固定化生物标记蛋白的酶联免疫吸附测定法(ELISA)随时间的推移监测免疫接种的受试者中的抗体滴度。在免疫接种后的合适的时间，例如在抗体滴度为最高时，产生抗体的细胞可以获自该受试者并且用于通过标准技术制备单克隆抗体，所述的标准技术诸如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497描述的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等(1983)Immunol.Today472)，EBV-杂交瘤技术(Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，ed.Reisfeld和Sell(Alan R.Liss，Inc.，New York，NY)，pp.77-96)或三源杂交瘤技术。用于产生杂交瘤的技术为众所周知的(一般参见Coligan等，eds.(1994)Current Protocols inImmunology(John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)；Galfre等(1977)Nature 26655052；Kenneth(1980)Monoclonal AntibodiesA New Dimension In Biological Analyses(Plenum Publishing Corp.，NY；和Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54387-402)。
本发明的组合物进一步包含特异性结合所关注的生物标记蛋白的单克隆抗体及其变体和片段。例如，提供了对SLPI(命名为克隆5G6.24)、DARPP-32(8G11.20)、MGC 14832(1F3.9和2D1.14)、NDRG-1(10A9.34)、PSMB9(3A2.4)和MUC-1(16E 3.3)具有特异性的单克隆抗体。可以如下文所述用可检测物质标记该单克隆抗体以便有利于样品中生物标记蛋白的检测。这类抗体可应用于实施本发明的方法。具有本文披露的抗体结合特性的单克隆抗体也包括在本发明中。组合物进一步包含单克隆抗体的抗原结合变体和片段、产生这些抗体的杂交瘤细胞系和编码这些单克隆抗体的氨基酸序列的分离的核酸分子。
还提供了具有本发明单克隆抗体结合特性的抗体。″结合特性″或″结合特异性″在用于提及抗体时意指该抗体识别与对比抗体相同或相似的抗原表位。这类抗体的实例包括例如，在竞争性结合试验中与本发明单克隆抗体竞争的抗体。本领域技术人员可以使用标准方法测定一种抗体是否干扰另一种抗体。
所谓″表位″意指产生抗体并且与抗体结合的抗原分子的一部分。表位可以包含线性氨基酸残基(即，表位内的残基以线性方式接连地依次排列)，非线性氨基酸残基(本文称作″非线性表位″；这些表位不依次排列)，或线性和非线性的氨基酸残基两者。一般而言，表位为短的氨基酸序列，例如约5个氨基酸长度。用于鉴定表位的系统技术为本领域中已知的并且例如描述在美国专利US 4,708,871中。简言之，可以合成一组来源于抗原的重叠寡肽类并且使之与固相针阵列结合，其中在各针上有独特的寡肽。针阵列可以包含96-孔微量滴定板，从而允许同时检测所有的96种例如用于结合生物标记特异性单克隆抗体的寡肽类。或者，可利用目前可商购的噬菌体展示文库试剂盒(NewEngland BioLabs)进行表位作图。使用这些方法，可以测定对每一可能亚组的连续氨基酸的结合亲和力以便鉴定指定抗体所结合的表位。还可以在将表位长度肽序列用于免疫接种从中获得抗体的动物时，通过推定鉴定表位。
进一步提供了本文披露的单克隆抗体的抗原结合片段和变体。这类变体将保持亲代抗体的所需结合特性。用于制备抗体片段和变体的方法为本领域中一般可获得的。例如，可以通过在编码所关注的抗体的克隆的DNA序列中进行突变制备本文所述的单克隆抗体的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法为本领域众所周知的。例如，参见Walker和Gaastra，eds.(1983)Techniques in MolecularBiology(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等(1987)MethodsEnzymol.154367-382；Sambrook等(1989)Molecular CloningALaboratory Manual(Cold Spring Harbor，New York)；美国专利US4,873,192；及其中引述的参考文献；将这些文献引入本文作为参考。可以在Dayhoff等(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C)的模型中找到关于不影响所关注多肽的生物活性的合适的氨基酸置换的指导，将该文献引入本文作为参考。可以优选保守置换，诸如一种氨基酸与另一种具有相似特性的氨基酸交换。保守置换的实例包括，但不限于Gly<＝>Ala；Val<＝>Ile<＝>Leu；Asp<＝>Glu；Lys<＝>Arg，Asn<＝>Gln；和Phe<＝>Trp<＝>Tyr。
在构建所关注的抗体多肽变体的过程中，进行修饰，以便变体持续具有所需的活性，即，对生物标记的相似的结合亲和力。显然，在编码变体多肽的DNA中进行的任何突变都不一定将该序列置于读框范围外并且优选不会建立可能产生二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利申请公开号EP75,444。
优选，参比生物标记抗体的变体具有的氨基酸序列与参比抗体分子或与参比抗体分子的较短部分的氨基酸序列具有至少70％或75％的序列同一性，优选至少80％或85％的序列同一性，更优选至少90％，91％，92％，93％，94％或95％的序列同一性。更优选，所述的分子共有至少96％，97％，98％或99％的序列同一性。就本发明的目的而言，使用Smith-Waterman同源性检索规则系统测定序列同一性百分比，其中使用紧密相邻的缺口检索，且缺口打开罚分为12和缺口延长罚分为2，BLOSUM矩阵为62。Smith-Waterman同源性检索规则系统教导于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482-489中。例如，变体与参比抗体不同的方面为可以少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个氨基酸残基，诸如6-10个，少至5个，少至4，3，2个乃至1个氨基酸残基。
在两种氨基酸序列的最佳序列比对方面，变体氨基酸序列的连续片段与参比氨基酸序列相比可以具有增加的氨基酸残基或缺失的氨基酸残基。用于与参比氨基酸序列比较的连续片段包括至少20个连续的氨基酸残基，并且可以为30，40，50或50个以上氨基酸残基。可以对与保守残基置换或缺口相关的序列同一性进行校准(参见Smith-Waterman同源性检索规则系统)。
选择对所关注的生物标记蛋白具有特异性的用于实施本发明的抗体。用于制备抗体和筛选合适的抗体的方法为本领域中已知的。例如，参见Celis，ed.(印刷中)Cell Biology & Laboratory Handbook，3rdedition(Academic Press，New York)，将该文献完整地引入本文作为参考。在某些实施方案中，针对于特异性生物标记蛋白的商品抗体可以用于实施本发明。可以基于所需的组织学样品染色选择本发明的抗体。即，在优选的实施方案中，使用关注的最终样品类型(例如福尔马林固定石蜡包埋的乳腺肿瘤组织样品)并且针对结合特异性选择抗体。
在本发明的某些方面中，通过多步骤筛选过程选择和纯化针对于所关注的特定的生物标记的抗体。在具体的实施方案中，筛选polydoma以便鉴定具有所需特异性和灵敏性特性的生物标记-特异性抗体。本文所用的″polydoma″意指多杂交瘤。一般将本发明的polydoma提供于多孔组织培养平板中。在初始抗体筛选步骤中，使用一组包含正常(即，非癌性)乳腺组织和I、II、III和IV期乳腺肿瘤样品的各个载玻片或肿瘤组织微阵列。用于在单个载玻片上产生多组织阵列的方法和设备，诸如ChemiconAdvanced Tissue Arrayer为本领域中已知的。例如，参见美国专利US4,820,504。使用标准免疫组织化学技术对来自含有polydoma的各孔的未稀释上清液检测阳性染色。在这一初始筛选步骤，基本上忽略了背景的非特异性结合。选择产生阳性染色的Polydoma并且用于二期抗体筛选。
在第二个筛选步骤中，对阳性polydoma进行有限稀释过程。通过标准免疫组织化学技术检测所得的未筛选的抗体以便对具有已知5-年结果的乳腺肿瘤组织样品进行阳性染色。为了达到该目的，产生组织微阵列，其包含正常乳腺组织，具有已知良好5年结果的早期阶段乳腺肿瘤样品，具有已知不良5年结果的早期阶段乳腺肿瘤样品，正常非乳腺组织和癌性非乳腺组织。在该步骤，背景染色是有关联的并且仅选择对异常细胞(即，癌细胞)染色为阳性的候选polydoma用于进一步分析以便鉴定可区分良好和不良结果患者样品的抗体。
将阳性染色培养物制备成各个克隆以便选择各个单克隆抗体候选物。用于分离各个克隆和通过亲和吸附色谱法纯化抗体的方法为本领域众所周知的。进一步分析各个克隆以便确定最优化抗原回收条件和操作稀释度。
本领域技术人员认为需要优化染色试剂和条件，例如抗体滴度和检测化学参数，以便使特定抗体的信噪比最大化。测定使与本发明的生物标记特异性结合最大化并且将非特异性结合(或″背景″)减少至最低限度的抗体浓度。在具体的实施方案中，通过最初对福尔马林固定的石蜡包埋的正常和癌性乳腺组织样品测试不同抗体稀释液来确定合适的抗体滴度。优化抗体滴度和检测条件的试验设计为标准的并且完全属于本领域技术人员的能力范围。某些抗体需要额外的优化以便减少背景染色和/或增加染色的特异性和灵敏性。
此外，本领域技术人员认为用于实施本发明方法的特定抗体浓度根据诸如结合时间、抗体对生物标记蛋白的特异性水平和身体样品制备方法这类因素的不同而改变。此外，当将多种抗体用于单一样品时，所需浓度可能受到抗体施用于样品的次序影响，即，作为混合物同时施用还是作为单独的抗体试剂依次施用。此外，还必须优化用于使结合所关注生物标记的抗体显现的检测化学以便产生所需的信噪比。用于免疫组织化学染色试剂和条件的优化的一个实例描述在实施例6中。
通过使抗体与可检测物质偶联可以有利于对抗体结合的检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；且合适的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
就在本发明的免疫组织化学方法中检测抗体染色而言，本领域中还存在用于定量测定生物样品中多分子种类(例如生物标记蛋白)的量的视频显微镜检查和软件方法，其中存在的各分子种类由具有特定颜色的有代表性的染料标记指示。这类方法在本领域中还称作比色分析法。在这些方法中，视频显微镜检查用于提供染色后生物样品影像以便视觉显示存在所关注的特定生物标记。这些方法中的某些披露了成像系统和相关软件在基于存在的有代表性的颜色染料标记测定存在的各分子种类的相对量中的应用，如分别由通过成像系统和相关软件测定的那些颜色染料标记的光密度或透射率值所指示的，所述的某些方法诸如Marcelpoil等的美国专利申请US09/957,446和Marcelpoil等的美国专利申请US10/057,729中披露的那些方法。这些技术提供了使用单一视频影像定量测定染色的生物样品中各分子种类的相对量的方法，所述的单一视频影像被″解构″成其组分颜色部分。
本发明的方法可以与用于检测生物标记表达的成像系统和相关软件联用。可以基于用于与本申请同时提交的标题为″分析和优化癌症预后的标记候选物的方法和计算机程序″的美国专利申请号——中披露的方法和计算机程序选择用于本发明方法的生物标记，并且将该文献完整地引入作为参考。本文披露的方法可以用于研发用于评价乳腺癌预后的规则系统。
在其它实施方案中，在核酸水平上检测所关注的生物标记的表达。用于评价表达的基于核酸的技术为本领域众所周知的并且包括例如测定身体样品中生物标记mRNA的水平。许多表达检测方法使用分离的RNA。可以将不针对mRNA的分离选择的任何RNA分离技术用于纯化RNA(例如，参见Ausubel等，ed.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York 1987-1999)。另外，易于使用本领域技术人员众所周知的技术加工大量组织样品，诸如，例如Chomczynski的单步RNA分离法(1989，美国专利US4,843,155)。
术语″探针″意指能够选择性结合具体指定的靶生物分子，例如，核苷酸转录物或由生物标记编码或相当于生物标记的蛋白质的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成或来源于合适的生物制品。可以具体设计用于标记的探针。可以用作探针的分子的实例包括，但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
在杂交或扩增试验中可以使用分离的mRNA，所述的杂交或扩增试验包括，但不限于DNA或RNA印迹分析、聚合酶链反应分析和探针阵列。用于检测mRNA水平的一种方法包括使分离的mRNA接触可以与由待检测的基因编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)。例如，核酸探针可以为全长cDNA或其部分，诸如至少7，15，30，50，100，250或500个核苷酸长度和足以在严格条件下与编码本发明生物标记的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。mRNA与探针杂交表明所述的生物标记得到表达。
在一个实施方案中，mRNA被固定在固相表面上并且例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并且将来自凝胶的mRNA转至膜，诸如硝化纤维素上接触探针。在备选的实施方案中，探针被固定在固相表面上并且使mRNA在例如Affymetrix基因芯片阵列中接触探针。本领域技术人员易于采取已知的mRNA检测方法用于检测由本发明的生物标记编码的mRNA水平。
用于测定样品中生物标记mRNA水平的备选方法包括核酸扩增过程，例如通过RT-PCR(Mullis，1987，美国专利US 4,683,202中所述的实验实施方案)、连接酶链反应(Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88189-193)、自我持续序列复制(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等.，1988，Bio/Technology 61197)、滚环复制(Lizardi等.，美国专利US5,854,033)或任何其它核酸扩增方法进行，随后使用本领域技术人员众所周知的技术检测扩增的分子。这些检测方案尤其可用于检测核酸分子，条件是这类分子以极低数量存在。在本发明的具体方面中，通过定量荧光RT-PCR(即，TaqManSystem)评价生物标记表达。
可以使用膜印迹(诸如用于杂交分析，诸如RNA印迹、DNA印迹、斑点印迹等)或微孔、样品试管、凝胶、珠或纤维(或包含结合的核酸的任何固相支持体)监测RNA的生物标记表达水平。参见美国专利US5,770,722、US5,874,219、US5,744,305、US5,677,195和US5,445,934，将这些文献引入本文作为参考。生物标记表达的检测还可以包括使用在溶液中的核酸探针。
在本发明的一个实施方案中，微阵列用于检测生物标记表达。微阵列因不同实验之间的可再现性而特别充分适合于这一目的。DNA微阵列提供了一种用于同时测定较大数量基因的表达水平的方法。每一阵列由附着于固相支持体上的可再现模式的俘获探针组成。标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交且然后通过激光扫描检测。测定阵列上每一探针的杂交强度并且将其转化成代表相对基因表达水平的定量值。参见美国专利US6,040,138、US5,800,992和US6,020,135、US6,033,860和US6,344,316，将这些文献引入本文作为参考。高密度寡核苷酸阵列特别可用于测定样品中大量RNA的基因表达特征。
使用机械合成方法合成这些阵列的技术描述在例如美国专利US5,384,261中，为所有目的而将该文献完整地引入本文作为参考。尽管优选平面阵列表面，但是可以使该阵列在实际上任何形状的表面乃至多种多样的表面上构成。阵列可以为在珠、凝胶、聚合物表面、纤维，诸如光学纤维、玻璃或任何其它合适的底物上的肽类或核酸，参见美国专利US5,770,358、US5,789,162、US5,708,153、US6,040,193和US5,800,992，为所有目的而将这些文献各自完整地引入本文。按照能够用于诊断或综合装置的其它操作这样的方式包装阵列。例如，参见美国专利US5,856,174和US5,922,591,将这些文献引入本文作为参考。
在一种手段中，将从样品中分离的总mRNA转化成标记的cRNA且然后与寡核苷酸阵列杂交。每种样品与单独的阵列杂交。可以通过参比存在于阵列上和样品中的合适的对照品计算相对转录物水平。
进一步提供了用于实施本发明的试剂盒。所谓″试剂盒″意指任何制品(例如，包装或容器)，其包含至少一种用于特异性检测本发明的生物标记表达的试剂，例如，抗体、核酸探针等。可以将试剂盒作为用于实施本发明方法的单元、供销或销售。另外，试剂盒可以包含描述该试剂盒及其使用方法的药品说明书。
在具体的实施方案中，提供了用于实施本发明的免疫组织化学方法的试剂盒。这类试剂盒与下文实施例1中所述的手动和自动化免疫组织化学技术(例如细胞染色)相适应。这些试剂盒包含至少一种针对于所关注的生物标记蛋白的抗体。任选提供了用于检测结合生物标记、复染剂和上蓝剂的抗体的化学品以便有利于鉴定阳性染色细胞。或者，本发明的免疫化学试剂盒与商品抗体结合检测系统，诸如，例如DakoEnvision+系统和Biocare Medical′s Mach 3系统联用。检测抗原-抗体结合的任何化学品都可以用于实施本发明。在某些实施方案中，检测化学品包含与二次抗体缀合的标记聚合物。例如，可以提供与催化色原在抗原-抗体结合位点上沉积的酶缀合的二次抗体。这类酶和使用它们检测抗体结合的技术为本领域众所周知的。在一个实施方案中，试剂盒包含与HRP-标记的聚合物缀合的二次抗体。可以进一步提供与该缀合酶相容的色原(例如，就HRP-标记的二次抗体而言为DAB)和用于阻断非特异性染色的溶液，诸如过氧化氢。本发明的试剂盒还可以包含复染剂，诸如，例如苏木精。可以在试剂盒中进一步提供上蓝剂(例如，氢氧化铵)以便有利于检测阳性染色细胞。
在另一个实施方案中，本发明的免疫组织化学试剂盒包含至少两种试剂，例如，抗体，用于特异性检测至少两种不同生物标记的表达。可以在试剂盒中将每种抗体作为单独的试剂或作为包含所有针对于不同所关注的生物标记的抗体的抗体混合物提供。此外，可以在容器内提供任何或所有的试剂盒试剂，这些容器可防止它们受到外部环境影响，诸如在密封容器中。在试剂盒中可以包括阳性和/或阴性对照品以便验证按照本发明使用的试剂的活性和正确用法。对照品可以包括样品，诸如组织切片、固定在载玻片上的细胞等，已知它们对于所关注的生物标记的存在呈阳性或阴性。对照品的设计和使用为标准的并且完全属于本领域技术人员的常规能力范围。
在其它实施方案中，进一步提供了用于评价乳腺癌患者预后的试剂盒，所述的评价包括在核酸水平上检测生物标记的超表达。这类试剂盒包含，例如，至少一种特异性结合生物标记核酸或其片段的核酸探针。在具体的实施方案中，该试剂盒包含至少两种与不同生物标记核酸杂交的核酸探针。
本领域技术人员可以理解本发明方法中任何或所有的步骤均可以由个人实施，或按照自动化方式进行。因此，身体样品制备、样品染色和生物标记表达检测的步骤均可以自动进行。此外，在某些实施方案中，本发明的免疫组织化学方法与计算机成像设备和软件联用以便有利于由病理学工作者鉴定阳性染色的细胞。还可以将本文披露的方法与其它预后方法或分析(例如肿瘤大小、淋巴结状态、Her2/neu、Ki67和p53表达水平)结合。按照这种方式，对本发明生物标记超表达的检测能够更准确地确定乳腺癌患者的预后。
文章中的″一种″在本文中使用时意指文章中合乎语法对象的一种或一种以上(即，至少一种)。作为实例，″一种成分″意指一种或多种成分。
在本说明书的上下文中，措词″包含(comprising)″或变化形式，诸如″包含(comprises)″或″包含(comprising)″应理解为指包含所述的成分、整体或步骤或成分、整体或步骤组，但不排除任何其它成分、整体或步骤或成分、整体或步骤组。
提供下列实施例作为解释，但不起限定作用实验实施例1使用免疫组织化学检测生物标记超表达载玻片制备使用切片机切下福尔马林固定的石蜡包埋的乳腺肿瘤组织样品的4μM切片并且置于SuperFrost+载玻片(VWR)上。将该载玻片在强制空气干燥箱内烘焙20分钟且然后接触Histo-Orienter，直到石蜡熔化为止。用二甲苯将载玻片洗涤3次，每次5分钟，以便除去石蜡且然后用无水乙醇冲洗3次每次冲洗2分钟。
预处理和抗原回收为了防止非特异性背景染色，将载玻片在过氧化氢/甲醇封闭物中和室温下孵育5分钟。然后用更换几次的dH2O彻底冲洗载玻片。
为了使抗原易于进行抗体结合，在加压蒸煮器内将载玻片在抗原回收溶液中孵育5分钟。使载玻片在实验台上冷却至室温下20分钟，并且逐步用dH2O、tris缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)经连续稀释替换柠檬酸盐缓冲液。然后用TBS以2分钟/冲洗将载玻片冲洗3次。为了破坏表面张力，向每一载玻片中加入750μl/50ml的1％BSA/TBS。
手动免疫组织化学为了防止非特异性背景染色，不允许在染色操作步骤中载玻片变干。将已经进行抗原回收的载玻片加载入装入了水湿润的纸巾的湿度室内。在室温下将SLPI抗体(克隆5G6.24；1∶100稀释)以足以完全覆盖组织切片的体积施用在载玻片上1小时。在与初次抗体一起孵育后，以每次洗涤2分钟用TBS将载玻片冲洗3次。向最终洗涤物中加入750μl/50ml的1％BSA/TBS。
在室温下将Dako Envision+HRP-标记的聚合物二次抗体施用于载玻片上30分钟，随后用TBS冲洗。将HRP底物色原DAB施用10分钟且然后用水将载玻片冲洗5分钟。用苏木精将每一载玻片复染5秒钟且然后用水冲洗至澄清。在复染后，通过浸入氨水10秒钟使载玻片″变蓝″且然后用水冲洗1分钟。
通过使载玻片浸入95％乙醇1分钟且然后再浸入无水乙醇1分钟使样品脱水。通过在二甲苯中冲洗3次，每次冲洗1分钟使载玻片澄清。然后用持久封固剂对载玻片进行盖玻片覆盖并且在35℃下孵育至干燥。使用明视野显微镜使生物标记染色显现。由部门持有证书的病理学工作者以盲式方式进行评分。
自动化免疫组织化学按照制造商的说明对Dako自动染色机通用染色系统编程并且使上述对手动免疫组织化学所述的必要的染色和复染试剂上机。使制备的载玻片上自动染色机并且运行程序。在运行结束时，取出载玻片并且用水冲洗5分钟。使载玻片脱水，澄清，加盖玻片并且如上所述进行分析。
实施例2临床样品至各生物标记超表达的检测采集来自不同疾病阶段的约130个乳腺肿瘤组织样品。患者平均年龄为77岁。已知每位患者的实际临床结果数据并且将每位患者分类为具有良好或不良结果。在本研究中，将良好结果定义为保持无癌至少5年；将不良结果定义为在5年内经历疾病复发、再发或死亡。下表表示每一分析的诊断组内样品的数量以及实际临床结果数据。
表1分析的临床样品
通过实施例1中所述的自动化免疫组织化学分析样品以便鉴定生物标记，其超表达预示差的癌症预后。即本临床研究的目的在于鉴定可以区分良好和差结果的患者样品的生物标记。抗体用于检测所关注的8种生物标记的超表达SLPI、PSMB9、NDRG-1、E2F1、p21ras、MUC-1、磷酸-p27和src。就质量控制目的而言，还分析了样品的ER、PR、p53、Ki67和Her2/neu表达。
如表2中所示稀释通过如本文所述polydoma筛选鉴定的针对于所关注的生物标记的商品抗体或单克隆抗体并且用于检测生物标记的超表达。下文中还列出了用于每一生物标记的抗原回收条件。
表2抗体稀释和抗原回收条件
载玻片的判读观察每一载玻片并且由不了解患者实际临床结果的部门持有证书的病理学工作者评分。以0-3的等级对样品的生物标记染色强度进行评分。例如，参见Hanausek和Walaszek，eds.(1998)Tumor MarkerProtocols(Humana Press，Inc.，Totowa，New Jersey)；和Shi等，eds.(2000)Antigen Retrieval TechniquesImmunohistochemistryand Molecular Morphology(Eaton Publishing，Natick，MA)，将这两篇文献完整地引入本文作为参考。对每一生物标记建立阈值染色强度。认为表现出低于该阈值的特定生物标记的染色强度的样品对该生物标记而言是阴性的。所关注的生物标记的染色强度阈值如下Src≥1MUC-1≥3磷酸-p27≥0.5PSMB9≥0.5
NDRG-1≥1E2F1≥3p21ras≥0.5SLPI≥2将染色强度结果与已知的对每一患者获得的实际临床结果数据进行比较且然后按照下述参数给出每一载玻片的真阳性(TP)、真阴性(TN)、假阳性(FP)、假阴性(FN)的最终结果。计算每一生物标记的灵敏性和特异性值。
表3不良结果生物标记的载玻片分类
*良好临床结果＝无癌存活至少5年不良临床结果＝5年内复发或因潜在癌症死亡使用的计算灵敏性＝TP/(TP+FN)特异性＝TN/(FP+TN)阳性预测力(PPP)＝TP/(TP+FP)阴性预测力(NPP)＝TN/(FN+TN)结果将每一生物标记的结果总结如下。
表4使用各生物标记的结果总结
实施例3临床样品中生物标记超表达的检测-合并生物标记为了测定如果合并多种生物标记是否可以改善本发明方法的灵敏性和特异性，对来自实施例2的数据进行了进一步分析。因此，考虑了各种生物标记的组合并且认为对所关注的该组合中的任何生物标记染色为阳性的样品是阳性的。将这些结果与与已知的对每一患者获得的实际临床结果数据进行比较且然后如上所述给出每一载玻片的真阳性(TP)、真阴性(TN)、假阳性(FP)、假阴性(FN)的最终结果。对每一生物标记的组合计算灵敏性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。
结果将每一生物标记的组合的结果总结如下。
表5SLPI、PSMB9、MUC-1和磷酸-p27
表6SLPI、PSMB9、MUC-1、磷酸-p27和src
表7SLPI、PSMB9、MUC-1、磷酸-p27、src、p21ras、E2F1和NDRG-1
实施例4使用标记分析研究系统(MARS)检测临床样品中各生物标记的超表达在本研究中分析了超过200位患者。正如表8中概括的，该患者群体相当不同并且表现出T1N0-T3N0的不同阶段的肿瘤。
表8分析的患者群体
患者的靶向特征为他们的良好结果或不良结果状态。在本研究中，良好结果的患者为那些在5年后仍然保持无病状态的患者；将不良结果的患者定义为在5年内复发、再发或死亡。
生物标记选择用于生物标记选择的范例在于生物标记超表达可以俘获某些不良结果的患者并且表现出极高的特异性。因此合并不同的标记可以确保高度特异性并且增加灵敏性，例如达到80％的灵敏性和80％的特异性。在多步骤选择过程后，选择9种生物标记用于目前的研究。这些标记与其相应的亚细胞定位如表9中所示。
表9分析的生物标记
自动化免疫组织化学基本上如实施例1中所述，通过自动化免疫组织化学分析患者样品，以便鉴定生物标记，其超表达预示差的癌症预后。即，本临床研究的目的在于鉴定可以区分良好和不良结果的患者样品的生物标记。抗体用于检测9种所关注的生物标记SLPI、PSMB9、NDRG-1、E2F1、p21ras、p53、MUC-1、磷酸-p27和src的超表达。还分析了样品的ER、PR、Ki67和Her2/neu(CerbB2)的表达。
如实施例1中所述制备载玻片并且进行抗原回收。具体地，将制备的载玻片浸入抗原回收溶液且然后放入加压蒸煮器(120-125℃，在17-23psi下)5分钟。将用于每一生物标记的抗原回收溶液列在下表10中。
表10抗原回收溶液
使载玻片逐步返回到室温的去离子水中。用TBS/tween-20将载玻片冲洗3次，每次洗涤2分钟。将200μl生物标记-特异性抗体加入到每一载玻片中并且在室温下孵育1小时。将通过如本文所述polydoma筛选鉴定的针对于所关注的生物标记的商品抗体或单克隆抗体用于检测生物标记的超表达。
在与初次抗体一起孵育后，用TBS/tween-20将载玻片冲洗2次。然后在室温下加入200μl标记的聚合物(Dako Envision+HRP-标记的聚合物二次抗体)30分钟。用TBS/tween-20再次将载玻片冲洗3次，此后在室温下添加200μl DAB溶液5分钟。然后用TBS/tween-20将载玻片冲洗3次并且用去离子水冲洗1次。加入200μl苏木精5分钟。用去离子水将载玻片冲洗3次，用TBS/tween-20冲洗1次并且再用去离子水冲洗2次。如实施例1中所述使载玻片脱水，澄清并且覆盖盖玻片。
病理学工作者评价部门持有证书的病理学工作者手动对载玻片评分。使用0、0.5、1、2或3的等级、标记细胞的百分比和临床诊断得分对p53表达的染色强度进行评分。使用0、0.5、1、2或3的等级和标记细胞的百分比对SLPI和PSMB9的染色强度进行评分。病理学工作者还在载玻片上标出了用于进行测定的肿瘤区(ROI)。使用MARS获得来自对每一肿瘤选择的区内的以单一焦点构成的多达10个单独的20x视野。获自每一样品的影像的实际数量依赖于个别肿瘤的大小。生成含有所有上述评分信息与患者结果、淋巴结状态和肿瘤大小的Excel表单。如下所述对数据进行进一步分析。
数据提取使用MARS，对每一文件系统性地进行下列步骤·使用显示出最佳质量染色的可利用的载玻片优化色原分离用于每一生物标记。
·分段设定按照其亚细胞定位(核、细胞质或膜)专用于每一生物标记。
·提取定义的ROI内的细胞、视野(FOV)和焦点水平的特征并且输送至输出文件(XML格式)。
数据分析研发了称作多标记分析仪(Multi Marker Analyzer)的具体程序以便整合新的分析算法并且满足对这一分析的大量计算要求。这一软件提供了加载使用MARS生成的全部或部分TMAs或组织切片XML文件的方式，从而可以使用描述TMA关键词的XML文件(就TMA分析而言)或给出患者临床状态和患者评价的Excel文件(就组织切片分析而言)合并在这些文件中包含的数据以及所有进一步分析的数据。这种数据合并过程包括将MARS对每一核心(或患者)测定的参数与TMA关键词(或Excel文件)中保持的有关患者的信息结合鉴定数量和医学状态(良好或不良结果)和病理学工作者评价，条件是在XML格式化的MARS文件中不包括。
因为某些样品不经历完整的实验过程，所以分析的患者的数量小于上述表8中记录的患者数量并且根据生物标记彼此的不同而改变。将对每一生物标记分析的组织切片数量列在下表11中。对常用乳腺癌标记(即ER、PR、Ki67和Her2/neu(CerbB2))分析的组织样品数量列在表12中。
表11分析生物标记超表达的组织切片数量
表12分析常用乳腺癌标记的组织切片数量
分段化和分配器设定为了使MARS分析接近表征载玻片的病理学工作者的方式，仅选择至少认为是1+的细胞。表13中概括了为这一分析用于MARS的分段化设定。这一分段化设定导致能够检测大部分染色的细胞。分段化和分配器透射率阈值基于细胞学工作者的输入信息。分段化设定为使用用计算机TPO-RDLAB5上Dage照相机捕捉的20x图像的基于像素的。
表13主要分段化设定参数
为了将选择的细胞分入基于靶向的细胞区室中生物标记染色强度的类别，将由分段化产生的合格的细胞分成3类1(在MARS中NegRef)；2(在MARS中Test)；和3(在MARS中PosRef)。表14中提供了MARS特征及其用于进行这一分配的值，作为标记的细胞定位的函数。
表14导致将选择的细胞分成1、2或3类的分配器设定
进行0类(相当于″未染色细胞的预测数量″)的评价。用获自具有1、2和3细胞染色强度的细胞区域的肿瘤细胞区域平均值(如根据称作CELL_AREA的MARS特征所估计的1100像素)计算这些细胞的近似数量N1＝NNegRefN2＝NTestN3＝NPosRef
N0＝最大(0，N总-N1-N2-N3)使用N0、N1、N2和N3，计算染色为0、1、2和3的细胞的细胞百分比。表15中给出了这些新特征的名称。
表15概括的百分比特征
将这些特征计算为简单的百分比，例如CELL_PERCENT_0
本研究使用MARS特征、这些新的概括的特征和病理学工作者的评分进行。USER_TYPE仅为病理学工作者评分用的MARS特征的名称。
多种生物标记分析为了获得改善的灵敏性/特异性关联，合并并且分析来自多种生物标记的数据。用于每一生物标记的特异性靶标依赖于合并的生物标记的数量。作为实例，3种生物标记的组合可以达到80％的特异性，条件是每种标记各自的特异性至少为0.81/3＝93％。表16提供了基于从1-9组合中的生物标记的数量的所需特异性值的清单。
表16在对多达9种生物标记的指定组合靶向0.8的总体特异性时每种生物标记所需的最低特异性
数据的判读本文所用的术语″标记性能″包括涉及标记的确切生物识别能力以及生物样品的来源和储存、染色方案、扫描过程、成像和数据采集程序的完整实验性能。
结果1.每种生物标记A.病理学工作者评分在仅考虑病理学工作者评分(MARS中的USER_TYPE)时计算产生最佳灵敏性/特异性关联的阈值。在靶向0.75的特异性时，将最有意义的结果概括在表17中。
表17生物标记的最佳灵敏性和特异性关联(病理学工作者评分)
还在仅考虑病理学工作者对乳腺组常用标记(即ER、PR、Ki67和Her2/neu(CerbB2))的评价时计算产生最佳灵敏性/特异性关联的阈值。在靶向0.75的特异性时，将最有意义的结果概括在表18中。
18.用于常用标记(病理学工作者评分)的最佳灵敏性/特异性关联
对每一生物标记和常用的乳腺癌标记(即ER、PR、Ki67和Her2/neu(CerbB2))而言，计算产生最佳灵敏性/特异性关联的特征和阈值仅用于病理学工作者的评价(USER_TYPE)。制备相应的接收器工作特性(ROC)曲线(数据未显示)。
B.单一特征分析就每一生物标记而言，在考虑定义为在分析的生物标记方面有意义的每一MARS特征时，计算产生最佳灵敏性/特异性关联的特征和阈值。制备相应的ROCs(数据未显示)。在靶向0.75的特异性时，将产生每一生物标记最佳结果的特征和阈值概括在表19中.。
表19获自MARS特征(单一特征规则系统)的每一生物标记的最佳灵敏性和特异性关联
*决策规则为1意指将高于阈值的患者视为阳性(即如果是不良实际临床结果，那么为真阳性)，而决策规则为8意指将高于阈值的患者视为阴性(即如果是不良实际临床结果，那么为假阴性)。
C.多重特征分析将每一百分比概括特征两两合并并且计算产生最佳灵敏性/特异性关联的阈值。对0.75的靶特异性而言，表20中提供了每一生物标记的最有意义的结果。
表20获自MARS特征(多重特征规则系统)的每一生物标记的最佳灵敏性和特异性关联
*决策规则相当于2个特征区间中的四分体属性。
2.生物标记的组合依次使用病理学工作者评分，1个MARS特征和每个标记2个MARS特征研究1-9标记的完全可能组合的组。按照FDA-样和基于序列的判读方法计算灵敏性和特异性。″FDA-样″意指任何为ON(1)的标记产生不良结果判断。即，如果至少一种标记为阳性的，那么认为标记的组合为阳性。基于序列的判读依赖于每种特定的ON/OFF组合的灵敏性/特异性。将使用病理学工作者评分(表21)和特征评价百分比(表22)获得的结果列在下面。
表21使用不同靶向的特异性(75％和95％)和不同判读规则系统(病理学工作者评分)的生物标记组合的最佳灵敏性/特异性关联
*每位患者的特征在于病理学工作者评分。
表22使用不同靶向的特异性(75％和95％)和不同判读规则系统(百分比特征)的生物标记组合的最佳灵敏性/特异性关联
*每位患者的特征在于1、2和3的染色细胞百分比。
实施例5中提供了4和6种生物标记的组合的具体实例。
来自浸润性小叶癌(ILC)患者的无数据分析基于诊断进一步再细分表8中所述的患者群体。具体地，排除来自具有浸润性小叶癌(ILC)的患者的数据并且对所得数据组进行上述分析。表23中提供了本研究中分析的患者群体的详细内容。
表23分析的患者群体(无ILC患者)
结果1.每个生物标记A.病理学工作者评分表24无ILC患者数据的生物标记的最佳灵敏性和特异性关联(病理学工作者评分)
表25无ILC患者数据的常用标记的最佳灵敏性和特异性关联(病理学工作者评分)
B.单一特征的分析表26获自无ILC患者数据的MARS特征(单一特征规则系统)的每一生物标记的最佳灵敏性和特异性关联
*决策规则为1意指将高于阈值的患者视为阳性(即，如果是不良实际临床结果，那么为真阳性)，而决策规则为8意指将高于阈值的患者视为阴性(即，如果是不良实际临床结果，那么为假阴性)。
C.多重特征分析表27获自无ILC患者数据的MARS特征(多重特征规则系统)的每一生物标记的最佳灵敏性和特异性关联
*决策规则相当于2个特征区间中的四分体属性D.分析之间的变差所有患者与无ILC患者之间测定以每一生物标记为基础，使用对完整患者群体(表8)和无ILC患者的群体(表23)获得的灵敏性和特异性值的变差。将结果列在下表28中。总计栏(d2)中给出了ROC曲线上的二次方距离的差异，即灵敏性和特异性的总体增加。
表28使用完整患者群体和无ILC患者获得的灵敏性和特异性的变差(每个生物标记)
2.生物标记的组合A.病理学工作者评分表29使用不同靶向的特异性(75％和95％)和不同的判读规则系统(病理学工作者评分)的无ILC患者的生物标记组合的最佳灵敏性/特异性关联
*每位患者的特征在于病理学工作者评分B.特征分析百分比表30使用不同靶向的特异性(75％和95％)和不同的判读规则系统(百分比特征)的无ILC患者的生物标记组合的最佳灵敏性/特异性关联
*每位患者的特征在于1、2和3的染色细胞的百分比。
表30表示特异性增加(0.88与0.81相比，参见表28)，此时考虑5种生物标记组合，不包括具有单一特征百分比的ILC患者。在使用2个特征进行5种生物标记序列分析时，观察到灵敏性增加(0.71与0.65相比，参见表28)，此时从本研究种排除ILC患者。
C.分析之间的变差所有患者与无ILC的患者测定对生物标记组合，使用对完整患者群体和无ILC患者的群体获得的灵敏性和特异性值的变差。将结果列在下表31中。总计栏(d2)中给出了ROC曲线上的二次方距离差异，即灵敏性和特异性的总体增加。在从本研究中排除ILC患者时，观察到了使用一种或两种百分比特征对5种生物标记的序列分析的性能微小的增加。
表31使用完整患者群体和无ILC患者获得的灵敏性和特异性的变差(生物标记组合)
实施例5特定的生物标记组合进一步分析上述实施例4中所述的本研究中获得的数据并且考虑特定的生物标记的组合。将使用4种(SLPI/p21ras/E2F1/src)和6种(SLPI/p21ras/PSMB9/E2F1/src/磷酸-p27)生物标记的组合获得的结果列在下面。
4种生物标记组合SLPI/p21ras/E2F1/src仅使用SLPI、p21ras、E2F1和src的一种百分比特征与表32中定义的阈值和决策规则进行分析。使用如下规则获得了60％的灵敏性和80％的特异性如果E2F1为ON(即为1)并且并非仅该生物标记为ON，那么认为患者的结果不良；否则，认为结果良好。图1表示作为E2F1的不良和良好结果患者的函数的百分比特征的分布。使用2.46％的阈值分别获得了0.54和0.75的灵敏性和特异性值。
表324种生物标记分析的百分比概括特征
将基于序列的判读手段用于分析4种生物标记组合。所用的基于序列的决策规则为如果E2F1为ON(即为1)并且并非仅该生物标记为ON，那么认为患者的结果不良；否则，认为结果良好。表33中提供了4种生物标记的所有可能的组合的灵敏性和特异性值。制备使用用于SLPI/p21ras/E2F1/src组合的序列判读手段获得的ROC曲线(数据未显示)。
表33使用对SLPI、p21ras、E2F1和SRC组合的基于序列的判读手段的灵敏性和特异性关联
*序列S0110如下SLPI＝OFF/p21ras＝ON/E2F1＝ON/src＝0FF。
基于单独的E2F1的判读分别得到了54％和75％的灵敏性和特异性。使用上述定义的基于序列的系统规则分别获得了60％和80％的特异性和灵敏性(即，如果E2F1为ON(即为1)并且并非仅该生物标记为ON，那么认为患者的结果不良；否则，认为结果良好)。
6种生物标记组合SLPI/p21ras/E2F1/src/PSMB9/磷酸-p27仅使用SLPI、p21ras、E2F1、src、PSMB9和磷酸-p27的6种生物标记组合的一种百分比特征与表34中定义的阈值和决策规则进行分析。
表346种生物标记分析的百分比概括特征
将基于序列的判读手段用于分析6种生物标记组合。所用的基于序列的决策规则为如果E2F1为ON(即为1)且SLPI或21ras，或E2F1和任何2种生物标记，或SLPI和任何2种生物标记，或任何4种生物标记或4种以上为ON，那么认为患者的结果不良；否则，认为结果良好。表35中提供了所关注的6种生物标记的所有可能的组合的灵敏性和特异性值。使用用于SLPI/p21ras/E2F1/PSMB9/src/磷酸-p27组合的序列判读手段获得的ROC曲线如图2中所示。
表35使用用于SLPI、p21ras、E2F1、PSMB9、SRC和磷酸-p27组合的基于序列的判读手段的灵敏性和特异性关联
使用上述定义的基于序列的系统规则分别获得了70％和77％的特异性和灵敏性。
实施例6用于免疫组织化学的试剂和染色条件的优化为了使用本文披露的免疫组织化学方法将对特定生物标记表达的检测的信噪比最大化，进行选择最佳抗原回收溶液和条件、抗体浓度和稀释剂配方和检测化学参数的实验。对每组实验而言，通过从正规石蜡块中获得圆柱形组织样本，将其装配成单个块并且制备含有多组织样本的切片来构建生物标记-特异性组织微阵列(TMAs)。使用具有2-3个预先选择的对每种乳腺生物标记而言已知阳性和阴性肿瘤的TMAs。制备载玻片并且基本上如实施例1中所述进行自动化免疫组织化学。在所有优化实验过程中使用下列对照试剂·就阴性对照而言，用备用的通用阴性试剂，即非特异性的小鼠或家兔IgG替换施用初次抗体。
·EF1-α用作阳性对照。
·按照在对测试的每种抗体而言可行的过程中建立的优化标记参数运行阳性标记对照载玻片。
·含有阳性和阴性肿瘤的生物标记特异性TMA用于测试每种乳腺标记抗体。
1.抗原回收优化A.抗原回收溶液使用所关注的生物标记抗体中的每一种测试下列各抗原回收溶液。本文所用的时间和温度为如下定义的标准认可的值。
表36测试的抗原回收溶液
由病理学工作者给载玻片评分并且通过比较阳性与阴性肿瘤之间的标记特异性和强度确定最佳性能的抗原回收溶液。如果结果基本上为阴性，那么筛选备选的抗原回收溶液。如果结果为阳性，即标记强于无抗原回收，那么鉴定上部(1-3)溶液并且用于抗原回收时间和温度测试。通过标记阳性和阴性全组织切片的有代表性的样品验证选择的抗原回收溶液的活性。
B.抗原回收条件-时间和温度使用下列时间和温度标准测试最佳性能的抗原回收溶液表37测试的抗原回收时间和温度条件
由病理学工作者给载玻片评分并且通过比较阳性与阴性肿瘤之间的标记特异性和强度确定最佳性能的抗原回收时间和温度的组合。通过标记阳性和阴性完整组织切片的有代表性的样品，应用上述对照品验证选择的抗原回收溶液和时间和温度的组合的活性。
2.抗体稀释度和稀释剂配方的优化A.抗体稀释在一定范围的抗体稀释度内测试每种乳腺癌生物标记抗体。表38提供了测试SLPI 5G6.24抗体的抗体稀释实例。按照类似的方式测试所有其它乳腺生物标记抗体。
表38测试的抗体稀释度
由病理学工作者给载玻片评分并且评价对照品、已知阳性和已知阴性肿瘤之间的标记强度。分析标记数据以便确定维持所需标记强度和每种抗体应用范围宽度的抗体稀释度的上限和下限。如果最初的测试的稀释度范围未能确定上限和下限，那么再测试抗体稀释度。
B.抗体稀释剂配方使用所关注的每种乳腺生物标记抗体测试不同抗体稀释液。下表中提供了有关测试的稀释剂参数的描述。
表39测试的抗体稀释剂
由病理学工作者给载玻片的标记强度评分。通过比较生物标记对照载玻片与实验载玻片的标记等级来确定稀释剂配方的有效性。测试那些通过比较阳性与阴性肿瘤的标记产生最具特异性和最高信噪比的稀释剂配方。将产生最佳标记强度的稀释剂配方(约1-3种)转入进一步优化和稳定性研究。通过标记阳性和阴性完整乳腺瘤组织切片的有代表性的样品验证选择的稀释剂的活性。
3.检测化学的优化使用DAKO Envision+检测试剂盒在下列时间和浓度范围内测试每种乳腺生物标记抗体。
表40测试的检测化学时间和浓度条件
由病理学工作者给载玻片评分并且评价对照品、已知阳性和已知阴性肿瘤之间的标记强度。通过标记阳性和阴性完整乳腺癌组织切片的有代表性的样品验证选择的检测化学时间和浓度组合的活性。
结果使用最优化染色试剂条件观察到显著改善的信噪比(数据未显示)。
实施例7临床样品中生物标记的实时PCR检测使用ABI Prism 7700序列检测系统(Sequence Detection System)(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行TaqMan实时PCR。在本研究中借助于Primer ExpressTM程序1.5版(Applied Biosystems，Foster City，CA)设计引物和探针，以便对靶向的乳腺疾病分期标记(例如DARPP32和NDRG-1)进行特异性扩增。有关引物和探针的序列信息如下所示DARPP32正向引物名称DARPP32_t1-F序列TACACACCACCTTCGCTGAAAG(SEQ ID NO33)反向引物名称DARPP32_t1-R序列GGCCTGGTTCTCATTCAAATTG(SEQ ID NO34)TaqMan探针名称DARPP32_t1-探针序列CGCATTGCTGAGTCTCACCTGCAGTC(SEQ ID NO35)正向引物名称DARPP32_t2-F序列CAGCCTTACAGAGACTGGAAAAGAA(SEQ ID NO36)反向引物名称DARPP32_t2-R序列GAGGCTCAGGGACCCAAAG(SEQ ID NO37)TaqMan探针名称DARPP32_t2-探针序列CCAAACCAAGGCCCCCAGAGAGGT(SEQ ID NO38)NDRG-1正向引物名称NDRG-1-F序列CCTACCGCCAGCACATTGT(SEQ ID NO39)反向引物名称NDRG-1-R序列GCTGTTGTAGGCATTGATGAACA(SEQ ID NO40)TaqMan探针名称NDRG-1-探针序列AATGACATGAACCCCGGCAACCTG(SEQ ID NO41)用5′碱基上的荧光染料FAM(6-羧基荧光素)和3′碱基上的猝灭染料TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)标记探针。扩增子的大小约为100bp。将18S核糖体RNA用作内源性对照品。用荧光染料VIC标记18SrRNA探针。预研发的18S rRNA引物/探针混合物购自AppliedBiosystems(P/N4310893E)。在本研究中分析了20个冷冻乳腺组织(即，6个具有不良结果的肿瘤，12个具有良好结果的肿瘤和2个正常组织)。在本研究中，将良好结果定义为保持无癌至少5年；将不良结果定义为在5年内经历疾病复发、再发或死亡。通过使用High-Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems，P/N4322171)将从冷冻乳腺组织中提取的5μg总RNA定量转化成具有随机六聚物(没有低聚-dT)的单链cDNA形式。制备下列反应试剂2OX引物/探针主混合物(在200μl中)180μM正向引物20μl180μM反向引物20μl100μM TaqMan探针 10μlH2O 150μl最终反应混合物(25μl/孔)2OX引物/探针主混合物 1.25μl2X TaqMan通用PCR主混合物(P/N4304437) 12.5μlcDNA模板 5.0μlH2O 6.25μl20X TaqMan通用PCR主混合物购自Applied Biosystems(P/N4304437)。在25μl总体积中的最终引物和探针浓度分别为0.9μM和0.25μM。将10ng总RNA施加到反应的各孔中。扩增条件为在50℃下2分钟，在95℃下10分钟和在95℃下15秒和60℃下60秒的两步循环，总计40个循环。在每次反应中包括至少三种无模板的对照反应混合物。所有实验均按照一式三份进行。
在每次反应结束时，将记录的荧光强度用于下列计算Rn+为含有所有成分的反应的Rn值，Rn-为未反应的样品的Rn值(基线值或在NTC中检测到的值)。ΔRn为Rn+与Rn-之差。它是由PCR生成的信号强度的指示物。通过比较CT法计算靶基因的表达水平。所述的方法未使用已知量的标准品，而是比较靶序列的相对量与选择的参比值(选择18SrRNA作为本研究中的参比物)。参见Applied Biosystems的TaqManHuman Endogenous Control Plate Protocol，其包含有关基于MS Excel的数据分析的详细说明。
结果将使用每种生物标记和特异性引物获得的结果列在下表中。将使用正常乳腺组织样品获得的结果命名为N；将那些使用乳腺癌样品获得的结果标记为T。
表41DARPP32 TaqMan结果
DARPP32具有两种转录物t1和t2。TaqMan数据显示了t1和t2在具有不良结果的乳腺肿瘤中超表达(用粗体表示)，与之相比的是那些具有良好结果的乳腺肿瘤。
表42NDRG-1 TaqMan结果
NDRG-1具有一种转录物。TaqMan数据显示了NDRG-1在具有不良结果的乳腺肿瘤中超表达(用粗体表示)，与之相比的是那些具有良好结果的乳腺肿瘤。
实施例8具有10-年临床随访的首次进入化疗患者群体中生物标记超表达的检测(5种生物标记组)在本研究中在或接近最初诊断时从255位早期阶段乳腺癌患者中采集乳腺肿瘤组织样品分析生物标记超表达。在本研究中对所有患者利用10-年临床随访数据。无一患者在其对乳腺癌治疗过程中的任何时间接受细胞毒性化疗。将患者群体的临床人口统计、分布和标准组织病理学参数(例如ER/PR激素受体状态、组织学等级等)概括在下表43中。
表43首次进入化疗患者群体的临床特征
基本上如上所述对包含SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1的5种生物标记组的表达进行检测。即，制备乳腺肿瘤样品并且如上述实施例1中所述使用Dako自动染色机对生物标记表达染色。使用实施例4中所述的成像分析测定生物标记超表达。
使用考克斯多因素疾病或死亡风险模型分析评价5种生物标记组的预后性能。例如，参见Spruance等，文献同上。计算鉴定10年后无病患者中10年内经历疾病复发或死亡的患者的每种生物标记和/或组织学特征的预后值。在无生物标记组的分析中，发现年龄和肿瘤大小为独立的预后因素，其中p值＜0.05。当将生物标记加入到该分析中时，它们表现出最高统计学显著性独立预后效用，其中p值＜0.0001。将考克斯多因素疾病或死亡风险模型分析结果概括在下表44中。
表44使用首次进入化疗患者群体的考克斯多因素疾病或死亡风险分析的结果(SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1生物标记组)
诊断时的年龄为连续的变量并且生物标记为具有0或1、2、3、4的普通变量(0＝无阳性标记，1＝1种阳性标记，或2、3、4种阳性标记)。
SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1生物标记组的预后性能以图示呈现在图3的卡普兰-迈耶曲线图中。x-轴代表距最初诊断时的年数，且y轴为无病存活百分比。一般乳腺癌群体与生物标记分析彼此独立的相应图呈现在图4中。这些图表示这种生物标记组将该早期阶段乳腺癌患者群体因原发性疾病导致的疾病复发和/或死亡进行风险分级的能力。在患者样品中超表达的生物标记的数量增加时，原发性疾病导致的疾病复发和/或死亡的风险度也增加。根据超表达的生物标记的数量鉴定的患者亚组的无病存活率彼此具有统计学意义，其中p值为＜0.001，正如通过用于比较0个阳性，1个阳性，2个阳性，3个或3个以上阳性的生物标记组的时序检验所测定的。认为通过本文所述的成像分析分类为超表达的生物标记是″阳性的″。
因为乳腺癌患者诊断的最重要的临床特征之一涉及雌激素受体(ER)状态，所以在ER-阳性和-阴性患者亚组中使用考克斯多因素疾病或死亡风险分析进一步评价了SLPI、src、PSMB9、p21ras、和E2F1生物标记的预后性能。这两个亚组的临床控制和预后是不同的，因为ER-阳性患者为他莫昔芬疗法的候选者，而ER阴性患者不是。将分析结果概括在下表45中。数据显示所关注的5种生物标记在ER阳性和阴性乳腺癌患者亚组中具有预后效用。因此，尽管生物标记SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1不依赖于患者的ER状态预示预后，但是这些生物标记还与ER状态相关。
表45使用首次进入化疗患者群体的考克斯多因素疾病或死亡风险分析的结果(ER阳性和阴性患者亚组中的SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1生物标记组)
诊断时的年龄为连续的变量并且TPO标记为具有0或1、2、3、4的普通变量(0＝无阳性标记，1＝1种阳性标记，或2、3、4种阳性标记)实施例9具有10-年临床随访的首次进入化疗患者群体中生物标记超表达的检测(6种生物标记组)对来自实施例8中所述首次进入化疗的患者群体的100位患者(50位结果良好；50位结果不良患者)的乳腺肿瘤组织样品分析所关注的6种生物标记(SLPI、src、PSMB9、p21ras、E2F1和MUC-1)的超表达。基本上如上所述通过自动化免疫组织化学对6种生物标记组的表达进行检测，但使用备选的染色平台Ventana BenchMark XT代替Dako自动染色机。用于操作Ventana BenchMark XT的标准手册易于从制造商处获得。将对用于Ventana BenchMark XT染色平台的免疫组织化学参数的额外修订概括在下表46中。如上所述使用实施例4中所述的成像分析测定生物标记超表达。
表46使用Ventana BenchMark XT染色平台对生物标记染色的免疫组织化学参数
*CC1和CC2意指商购自Ventana的细胞条件试剂。关于抗原回收时间短＝30分钟；标准＝60分钟；且延长的＝90分钟*使用上述考克斯多因素疾病或死亡风险模型分析评价6种生物标记组的预后性能。计算鉴定10年后无病患者中10年内经历疾病复发或死亡的患者的每种生物标记和/或组织学特征的预后值。所关注的生物标记(SLPI、src、PSMB9、p21ras、E2F1和MUC-1)表现出具有统计学显著性的预后效用，其中p值为0.0220。将考克斯多因素疾病或死亡风险分析结果概括在下表47中。
表47使用首次进入化疗患者群体的考克斯多因素疾病或死亡风险分析的结果(SLPI、src、PSMB9、p21ras、E2F1和MUC-1生物标记组)
SLPI、src、PSMB9、p21ras、E2F1和MUC-1生物标记组的预后性能以图示呈现在图5的卡普兰-迈耶曲线图中。x-轴代表距最初诊断时的年数，且y轴为无病存活百分比。一般乳腺癌群体与生物标记分析彼此独立的相应图呈现在图4中。这些图表示这种生物标记组将该早期阶段乳腺癌患者群体因原发性疾病导致的疾病复发和/或死亡进行风险分级的能力。在患者样品中超表达的生物标记的数量增加时，原发性疾病导致疾病复发和/或死亡的风险度也增加。根据超表达的生物标记的数量鉴定的患者亚组的无病存活率彼此具有统计学意义，其中p值为＜0.0065，正如通过用于比较0个阳性，1个阳性，2个阳性，3个或3个以上阳性的生物标记组的时序检验所测定的。如上所述，认为通过本文所述的成像分析分类为超表达的生物标记是″阳性的″。
表48生物标记核苷酸和氨基酸序列信息
本说明书中提及的所有出版物和专利申请预示了本发明涉及的本领域的技术水平。将所有出版物和专利申请引入本文作为参考，其引入程度与将各出版物或专利申请特别和各自引入作为参考的程度相同。
尽管为清楚地理解的目的已经通过解释和实施例在一定程度上详细描述了上述本发明，但是显然抗原在所附权利要求的范围内可以进行某些改变和变型。
序列表<110>TriPath Imaging，Inc.
Fischer，Timothy J.
Whitehead，Clark M.
Malinowski，Douglas P.
Marcelpoil，RaphaelMorel，Didier<120>用于评价乳腺癌预后的方法和组合物<130>46143/296716<150>60/612,073<151>2004-09-22<150>60/611,965<151>2004-09-22<160>41<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>598<212>DNA<213>人类<220>
<221>CDS<222>(23)...(421)<400>1cagagtcact cctgccttca cc atg aag tcc agc ggc ctc ttc ccc ttc ctg 52Met Lys Ser Ser Gly Leu Phe Pro Phe Leu1 5 10gtg ctg ctt gcc ctg gga act ctg gca cct tgg gct gtg gaa ggc tct100Val Leu Leu Ala Leu Gly Thr Leu Ala Pro Trp Ala Val Glu Gly Ser15 20 25gga aag tcc ttc aaa gct gga gtc tgt cct cct aag aaa tct gcc cag148
Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala Gln30 35 40tgc ctt aga tac aag aaa cct gag tgc cag agt gac tgg cag tgt cca196Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys Pro45 50 55ggg aag aag aga tgt tgt cct gac act tgt ggc atc aaa tgc ctg gat244Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu Asp60 65 70cct gtt gac acc cca aac cca aca agg agg aag cct ggg aag tgc cca292Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro75 80 85 90gtg act tat ggc caa tgt ttg atg ctt aac ccc ccc aat ttc tgt gag340Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu95 100 105atg gat ggc cag tgc aag cgt gac ttg aag tgt tgc atg ggc atg tgt388Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys110 115 120ggg aaa tcc tgc gtt tcc cct gtg aaa gct tga ttcctgccat atggaggagg 441Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala *125 130ctctggagtc ctgctctgtg tggtccaggt cctttccacc ctgagacttg gctccaccac 501tgatatcctc ctttggggaa aggcttggca cacagcaggc tttcaagaag tgccagttga 561tcaatgaata aataaacgag cctatttctc tttgcac 598<210>2<211>132<212>PRT<213>人类<400>2Met Lys Ser Ser Gly Leu Phe Pro Phe Leu Val Leu Leu Ala Leu Gly1 5 10 15Thr Leu Ala Pro Trp Ala Val Glu Gly Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala20 25 30Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys35 40 45Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys
50 55 60Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn65 70 75 80Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys85 90 95Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys100 105 110Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser115 120 125Pro Val Lys Ala130<210>3<211>1513<212>DNA<213>人类<220>
<221>CDS<222>(236)...(742)<400>3attcacttct cacaaggact gggtgaagag ttctgcagcc ttacagagac tggaaaagaa60gcccaaacca aggcccccag agaggtcccc caggcccctt tgggtccctg agcctcagct120ggaggtgggg ggtgcctgca gtgcgctggc tcagtctcct tctgaaaagc tggatccagc180ttgtttgaag cccttgagct gatcttagat ccggcgcagg agaccaacgc ctgcc atg 238Met1ctg ttc cgg ctc tca gag cac tcc tca cca gag gag gaa gcc tcc ccc 286Leu Phe Arg Leu Ser Glu His Ser Ser Pro Glu Glu Glu Ala Ser Pro5 10 15cac cag aga gcc tca gga gag ggg cac cat ctc aag tcg aag aga ccc 334His Gln Arg Ala Ser Gly Glu Gly His His Leu Lys Ser Lys Arg Pro20 25 30aac ccc tgt gcc tac aca cca cct tcg ctg aaa gct gtg cag cgc att 382Asn Pro Cys Ala Tyr Thr Pro Pro Ser Leu Lys Ala Val Gln Arg Ile35 40 45gct gag tct cac ctg cag tct atc agc aat ttg aat gag aac cag gcc 430Ala Glu Ser His Leu Gln Ser Ile Ser Asn Leu Asn Glu Asn Gln Ala
50 55 60 65tca gag gag gag gat gag ctg ggg gag ctt cgg gag ctg ggt tat cca 478Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Pro70 75 80aga gag gaa gat gag gag gaa gag gag gat gat gaa gaa gag gaa gaa 526Arg Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu85 90 95gaa gag gac agc cag gct gaa gtc ctg aag gtc atc agg cag tct gct 574Glu Glu Asp Ser Gln Ala Glu Val Leu Lys Val Ile Arg Gln Ser Ala100 105 110ggg caa aag aca acc tgt ggc cag ggt ctg gaa ggg ccc tgg gag cgc 622Gly Gln Lys Thr Thr Cys Gly Gln Gly Leu Glu Gly Pro Trp Glu Arg115 120 125cca ccc cct ctg gat gag tcc gag aga gat gga ggc tct gag gac caa 670Pro Pro Pro Leu Asp Glu Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Glu Asp Gln130 135 140 145gtg gaa gac cca gca cta agt gag cct ggg gag gaa cct cag cgc cct 718Val Glu Asp Pro Ala Leu Ser Glu Pro Gly Glu Glu Pro Gln Arg Pro150 155 160tcc ccc tct gag cct ggc aca tag gcacccagcc tgcatctccc aggaggaagt 772Ser Pro Ser Glu Pro Gly Thr *165ggaggggaca tcgctgttcc ccagaaaccc actctatcct caccctgttt tgtgctcttc832ccctcgcctg ctagggctgc ggcttctgac ttctagaaga ctaaggctgg tctgtgtttg892cttgtttgcc cacctttggc tgatacccag agaacctggg cacttgctgc ctgatgccca952cccctgccag tcattcctcc attcacccag cgggaggtgg gatgtgagac agcccacatt1012ggaaaatcca gaaaaccggg aacagggatt tgcccttcac aattctactc cccagatcct1072ctcccctgga cacaggagac ccacagggca ggaccctaag atctggggaa aggaggtcct1132gagaaccttg aggtaccctt agatcctttt ctacccactt tcctatggag gattccaagt1192caccacttct ctcaccggct tctaccaggg tccaggacta aggcgttttt ctccatagcc1252tcaacatttt gggaatcttc ccttaatcac ccttgctcct cctgggtgcc tggaagatgg1312actggcagag acctctttgt tgcgttttgt gctttgatgc caggaatgcc gcctagttta1372tgtccccggt ggggcacaca gcggggggcg ccaggttttc cttgtccccc agctgctctg1432cccctttccc cttcttccct gactccaggc ctgaacccct cccgtgctgt aataaatctt1492tgtaaataac aaaaaaaaaa a 1513
<210>4<211>168<212>PRT<213>人类<400>4Met Leu Phe Arg Leu Ser Glu His Ser Ser Pro Glu Glu Glu Ala Ser1 5 10 15Pro His Gln Arg Ala Ser Gly Glu Gly His His Leu Lys Ser Lys Arg20 25 30Pro Asn Pro Cys Ala Tyr Thr Pro Pro Ser Leu Lys Ala Val Gln Arg35 40 45Ile Ala Glu Ser His Leu Gln Ser Ile Ser Asn Leu Asn Glu Asn Gln50 55 60Ala Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Leu Arg Glu Leu Gly Tyr65 70 75 80Pro Arg Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu85 90 95Glu Glu Glu Asp Ser Gln Ala Glu Val Leu Lys Val Ile Arg Gln Ser100 105 110Ala Gly Gln Lys Thr Thr Cys Gly Gln Gly Leu Glu Gly Pro Trp Glu115 120 125Arg Pro Pro Pro Leu Asp Glu Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Glu Asp130 135 140Gln Val Glu Asp Pro Ala Leu Ser Glu Pro Gly Glu Glu Pro Gln Arg145 150 155 160Pro Ser Pro Ser Glu Pro Gly Thr165<210>5<211>748<212>DNA<213>人类<220>
<22l>CDS<222>(8)...(355)<400>5ggccgcg atg agc ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct ccc 49Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro1 5 10
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Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys Glu Pro20 25 30Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val Lys Glu35 40 45Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr Gly Ala50 55 60Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu Glu Asn65 70 75 80Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg Arg Ala85 90 95Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro Pro Cys100 105 110Val Ile Leu115<210>7<211>3020<212>DNA<213>人类<220>
<221>CDS<222>(111)...(1295)<400>7tgaagctcgt cagttcacca tccgccctcg gcttccgcgg ggcgctgggc cgccagcctc60ggcaccgtcc tttcctttct ccctcgcgtt aggcaggtga cagcagggac atg tct 116Met Ser1cgg gag atg cag gat gta gac ctc gct gag gtg aag cct ttg gtg gag 164Arg Glu Met Gln Asp Val Asp Leu Ala Glu Val Lys Pro Leu Val Glu5 10 15aaa ggg gag acc atc acc ggc ctc ctg caa gag ttt gat gtc cag gag 212Lys Gly Glu Thr Ile Thr Gly Leu Leu Gln Glu Phe Asp Val Gln Glu20 25 30cag gac atc gag act tta cat ggc tct gtt cac gtc acg ctg tgt ggg 260Gln Asp Ile Glu Thr Leu His Gly Ser Val His Val Thr Leu Cys Gly35 40 45 50act ccc aag gga aac cgg cct gtc atc ctc acc tac cat gac atc ggc 308
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Phe Ile Asn Ala Tyr Asn Ser Arg Arg Asp Leu Glu Ile Glu Arg Pro230 235 240atg ccg gga acc cac aca gtc acc ctg cag tgc cct gct ctg ttg gtg 884Met Pro Gly Thr His Thr Val Thr Leu Gln Cys Pro Ala Leu Leu Val245 250 255gtt ggg gac agc tcg cct gca gtg gat gcc gtg gtg gag tgc aac tca 932Val Gly Asp Ser Ser Pro Ala Val Asp Ala Val Val Glu Cys Asn Ser260 265 270aaa ttg gac cca aca aag acc act ctc ctc aag atg gcg gac tgt ggc 980Lys Leu Asp Pro Thr Lys Thr Thr Leu Leu Lys Met Ala Asp Cys Gly275 280 285 290ggc ctc ccg cag atc tcc cag ccg gcc aag ctc gct gag gcc ttc aag 1028Gly Leu Pro Gln Ile Ser Gln Pro Ala Lys Leu Ala Glu Ala Phe Lys295 300 305tac ttc gtg cag ggc atg gga tac atg ccc tcg gct agc atg acc cgc 1076Tyr Phe Val Gln Gly Met Gly Tyr Met Pro Ser Ala Ser Met Thr Arg310 315 320ctg atg cgg tcc cgc aca gcc tct ggt tcc agc gtc act tct ctg gat 1124Leu Met Arg Ser Arg Thr Ala Ser Gly Ser Ser Val Thr Ser Leu Asp325 330 335ggc acc cgc agc cgc tcc cac acc agc gag ggc acc cga agc cgc tcc 1172Gly Thr Arg Ser Arg Ser His Thr Ser Glu Gly Thr Arg Ser Arg Ser340 345 350cac acc agc gag ggc acc cgc agc cgc tcg cac acc agc gag ggg gcc 1220His Thr Ser Glu Gly Thr Arg Ser Arg Ser His Thr Ser Glu Gly Ala355 360 365 370cac ctg gac atc acc ccc aac tcg ggt gct gct ggg aac agc gcc ggg 1268His Leu Asp Ile Thr Pro Asn Ser Gly Ala Ala Gly Asn Ser Ala Gly375 380 385ccc aag tcc atg gag gtc tcc tgc tag gcggcctgcc cagctgccgc 1315Pro Lys Ser Met Glu Val Ser Cys *390ccccggactc tgatctctgt agtggccccc tcctccccgg ccccttttcg ccccctgcct 1375
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65 70 75 80Asp Met Gln Glu Ile Thr Gln His Phe Ala Val Cys His Val Asp Ala85 90 95Pro Gly Gln Gln Asp Gly Ala Ala Ser Phe Pro Ala Gly Tyr Met Tyr100 105 110Pro Ser Met Asp Gln Leu Ala Glu Met Leu Pro Gly Val Leu Gln Gln115 120 125Phe Gly Leu Lys Ser Ile Ile Gly Met Gly Thr Gly Ala Gly Ala Tyr130 135 140Thr Leu Thr Arg Phe Ala Leu Asn Asn Pro Glu Met Val Glu Gly Leu145 150 155 160Val Leu Ile Asn Val Asn Pro Cys Ala Glu Gly Trp Met Asp Trp Ala165 170 175Ala Ser Lys Ile Ser Gly Trp Thr Gln Ala Leu Pro Asp Met Val Val180 185 190Ser His Leu Phe Gly Lys Glu Glu Met Gln Ser Asn Val Glu Val Val195 200 205His Thr Tyr Arg Gln His Ile Val Asn Asp Met Asn Pro Gly Asn Leu210 215 220His Leu Phe Ile Asn Ala Tyr Asn Ser Arg Arg Asp Leu Glu Ile Glu225 230 235 240Arg Pro Met Pro Gly Thr His Thr Val Thr Leu Gln Cys Pro Ala Leu245 250 255Leu Val Val Gly Asp Ser Ser Pro Ala Val Asp Ala Val Val Glu Cys260 265 270Asn Ser Lys Leu Asp Pro Thr Lys Thr Thr Leu Leu Lys Met Ala Asp275 280 285Cys Gly Gly Leu Pro Gln Ile Ser Gln Pro Ala Lys Leu Ala Glu Ala290 295 300Phe Lys Tyr Phe Val Gln Gly Met Gly Tyr Met Pro Ser Ala Ser Met305 310 315 320Thr Arg Leu Met Arg Ser Arg Thr Ala Ser Gly Ser Ser Val Thr Ser325 330 335Leu Asp Gly Thr Arg Ser Arg Ser His Thr Ser Glu Gly Thr Arg Ser340 345 350Arg Ser His Thr Ser Glu Gly Thr Arg Ser Arg Ser His Thr Ser Glu355 360 365Gly Ala His Leu Asp Ile Thr Pro Asn Ser Gly Ala Ala Gly Asn Ser370 375 380Ala Gly Pro Lys Ser Met Glu Val Ser Cys385 390<210>9
<211>778<212>DNA<213>人类<220>
<221>CDS<222>(52)...(711)<400>9caggttggaa accagtgccc caggcggcga ggagagcggt gccttgcagg g atg ctg57Met Leu1cgg gcg gga gca cca acc ggg gac tta ccc cgg gcg gga gaa gtc cac 105Arg Ala Gly Ala Pro Thr Gly Asp Leu Pro Arg Ala Gly Glu Val His5 10 15acc ggg acc acc atc atg gca gtg gag ttt gac ggg ggc gtt gtg atg 153Thr Gly Thr Thr Ile Met Ala Val Glu Phe Asp Gly Gly Val Val Met20 25 30ggt tct gat tcc cga gtg tct gca ggc gag gcg gtg gtg aac cga gtg 201Gly Ser Asp Ser Arg Val Ser Ala Gly Glu Ala Val Val Asn Arg Val35 40 45 50ttt gac aag ctg tcc ccg ctg cac gag cgc atc tac tgt gca ctc tot 249Phe Asp Lys Leu Ser Pro Leu His Glu Arg Ile Tyr Cys Ala Leu Ser55 60 65ggt tca gct gct gat gcc caa gcc gtg gcc gac atg gcc gcc tac cag 297Gly Ser Ala Ala Asp Ala Gln Ala Val Ala Asp Met Ala Ala Tyr Gln70 75 80ctg gag ctc cat ggg ata gaa ctg gag gaa cct cca ctt gtt ttg gct 345Leu Glu Leu His Gly Ile Glu Leu Glu Glu Pro Pro Leu Val Leu Ala85 90 95gct gca aat gtg gtg aga aat atc agc tat aaa tat cga gag gac ttg 393Ala Ala Asn Val Val Arg Asn Ile Ser Tyr Lys Tyr Arg Glu Asp Leu100 105 110tct gca cat ctc atg gta gct ggc tgg gac caa cgt gaa gga ggt cag 441Ser Ala His Leu Met Val Ala Gly Trp Asp Gln Arg Glu Gly Gly Gln115 120 125 130
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85 90 95Leu Ala Ala Ala Asn Val Val Arg Asn Ile Ser Tyr Lys Tyr Arg Glu100 105 110Asp Leu Ser Ala His Leu Met Val Ala Gly Trp Asp Gln Arg Glu Gly115 120 125Gly Gln Val Tyr Gly Thr Leu Gly Gly Met Leu Thr Arg Gln Pro Phe130 135 140Ala Ile Gly Gly Ser Gly Ser Thr Phe Ile Tyr Gly Tyr Val Asp Ala145 150 155 160Ala Tyr Lys Pro Gly Met Ser Pro G1u Glu Cys Arg Arg Phe Thr Thr165 170 175Asp Ala Ile Ala Leu Ala Met Ser Arg Asp Gly Ser Ser Gly Gly Val180 185 190Ile Tyr Leu Val Thr Ile Thr Ala Ala Gly Val Asp His Arg Val Ile195 200 205Leu Gly Asn Glu Leu Pro Lys Phe Tyr Asp Glu210 215<210>11<211>2422<212>DNA<213>人类<220>
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<221>CDS<222>(124)...(1437)<400>13ccgggacttt gcaggcagcg gcggccgggg gcggagcggg atcgagccct cgccgaggcc60tgccgccatg ggcccgcgcc gccgccgccg cctgtcaccc gggccgcgcg ggccgtgagc120gtc atg gcc ttg gcc ggg gcc cct gcg ggc ggc cca tgc gcg ccg gcg 168Met Ala Leu Ala Gly Ala Pro Ala Gly Gly Pro Cys Ala Pro Ala1 5 10 15ctg gag gcc ctg ctc ggg gcc ggc gcg ctg cgg ctg ctc gac tcc tcg 216Leu Glu Ala Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Leu Leu Asp Ser Ser20 25 30cag atc gtc atc atc tcc gcc gcg cag gac gcc agc gcc ccg ccg gct 264Gln Ile Val Ile Ile Ser Ala Ala Gln Asp Ala Ser Ala Pro Pro Ala35 40 45ccc acc ggc ccc gcg gcg ccc gcc gcc ggc ccc tgc gac cct gac ctg 312Pro Thr Gly Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly Pro Cys Asp Pro Asp Leu
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275 280 285agg gac ctt tct tat agg ctg gtc ttt ctt gcc tgc tgt gtt gcg cca970Arg Asp Leu Ser Tyr Arg Leu Val Phe Leu Ala Cys Cys Val Ala Pro290 295 300 305acc aac cca agg ttt ggg ggg aaa gag ctc aga gat gag gaa cag aca1018Thr Asn Pro Arg Phe Gly Gly Lys Glu Leu Arg Asp Glu Glu Gln Thr310 315 320gct gag agc att aag aac caa atg act gtg aaa gaa tgg gag aaa gtg1066Ala Glu Ser Ile Lys Asn Gln Met Thr Val Lys Glu Trp Glu Lys Val325 330 335ttt gag atg agt caa gat aaa aat cta tac cac aat ctt tgt acc agc1114Phe Glu Met Ser Gln Asp Lys Asn Leu Tyr His Asn Leu Cys Thr Ser340 345 350ctg ttc cct act ata cat ggc aat gat gaa gta aaa cgg ggt gtc ctg1162Leu Phe Pro Thr Ile His Gly Asn Asp Glu Val Lys Arg Gly Val Leu355 360 365ctg atg ctc ttt ggt ggc gtt cca aag aca aca gga gaa ggg acc tct1210Leu Met Leu Phe Gly Gly Val Pro Lys Thr Thr Gly Glu Gly Thr Ser370 375 380 385ctt cga ggg gac ata aat gtt tgc att gtt ggt gac cca agt aca gct1258Leu Arg Gly Asp Ile Asn Val Cys Ile Val Gly Asp Pro Ser Thr Ala390 395 400aag agc caa ttt ctc aag cac gtg gag gag ttc agc ccc aga gct gtc1306Lys Ser Gln Phe Leu Lys His Val Glu Glu Phe Ser Pro Arg Ala Val405 410 415tac acc agt ggt aaa gcg tcc agt gct gct ggc tta aca gca gct gtt1354Tyr Thr Ser Gly Lys Ala Ser Ser Ala Ala Gly Leu Thr Ala Ala Val420 425 430gtg aga gat gaa gaa tct cat gag ttt gtc att gag gct gga gct ttg1402Val Arg Asp Glu Glu Ser His Glu Phe Val Ile Glu Ala Gly Ala Leu435 440 445atg ttg gct gat aat ggt gtg tgt tgt att gat gaa ttt gat aag atg1450Met Leu Ala Asp Asn Gly Val Cys Cys Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met
450 455 460 465gac gtg cgg gat caa gtt gct att cat gaa gct atg gaa cag cag acc1498Asp Val Arg Asp Gln Val Ala Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln Thr470 475 480ata tcc atc act aaa gca gga gtg aag gct act ctg aac gcc cgg acg1546Ile Ser Ile Thr Lys Ala Gly Val Lys Ala Thr Leu Asn Ala Arg Thr485 490 495tcc att ttg gca gca gca aac cca atc agt gga cac tat gac aga tca1594Ser Ile Leu Ala Ala Ala Asn Pro Ile Ser Gly His Tyr Asp Arg Ser500 505 510aaa tca ttg aaa cag aat ata aat ttg tca gct ccc atc atg tcc cga1642Lys Ser Leu Lys Gln Asn Ile Asn Leu Ser Ala Pro Ile Met Ser Arg515 520 525ttc gat ctc ttc ttt atc ctt gtg gat gaa tgt aat gag gtt aca gat1690Phe Asp Leu Phe Phe Ile Leu Val Asp Glu Cys Asn Glu Val Thr Asp530 535 540 545tat gcc att gcc agg cgc ata gta gat ttg cat tca aga att gag gaa1738Tyr Ala Ile Ala Arg Arg Ile Val Asp Leu His Ser Arg Ile Glu Glu550 555 560tca att gat cgt gtc tat tcc ctc gat gat atc aga aga tat ctt ctc1786Ser Ile Asp Arg Val Tyr Ser Leu Asp Asp Ile Arg Arg Tyr Leu Leu565 570 575ttt gca aga cag ttt aaa ccc aag att tcc aaa gag tca gag gac ttc1834Phe Ala Arg Gln Phe Lys Pro Lys Ile Ser Lys Glu Ser Glu Asp Phe580 585 590att gtg gag caa tat aaa cat ctc cgc cag aga gat ggt tct gga gtg1882Ile Val Glu Gln Tyr Lys His Leu Arg Gln Arg Asp Gly Ser Gly Val595 600 605acc aag tct tca tgg agg att aca gtg cga cag ctt gag agc atg att1930Thr Lys Ser Ser Trp Arg Ile Thr Val Arg Gln Leu Glu Ser Met Ile610 615 620 625cgt ctc tct gaa gct atg gct cgg atg cac tgc tgt gat gag gtc caa1978Arg Leu Ser Glu Ala Met Ala Arg Met His Cys Cys Asp Glu yal Gln
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gcc cgc tac ctt tca ttc cgg cgt gac aac aat gag ctg ttg ctc ttc 2499Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu Phe810 815 820 825ata ctg aag cag tta gtg gca gag cag gtg aca tat cag cgc aac cgc 2547Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg Asn Arg830 835 840ttt ggg gcc cag cag gac act att gag gtc cct gag aag gac ttg gtg 2595Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp Leu Val845 850 855gat aag gct cgt cag atc aac atc cac aac ctc tct gca ttt tat gac 2643Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn Ile His Asn Leu Ser Ala Phe Tyr Asp860 865 870agt gag ctc ttc agg atg aac aag ttc agc cac gac ctg aaa agg aaa 2691Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn Lys Phe Ser His Asp Leu Lys Arg Lys875 880 885atg atc ctg cag cag ttc tga ggccctatgc catccataag gattccttgg 2742Met Ile Leu Gln Gln Phe *890 895gattctggtt tggggtggtc agtgccctct gtgctttatg gacacaaaac cagagcactt2802gatgaactcg gggtactagg gtcagggctt atagcaggat gtctggctgc acctggcatg2862actgtttgtt tctccaagcc tgctttgtgc ttctcacctt tgggtgggat gccttgccag2922tgtgtcttac ttggttgctg aacatcttgc cacctccgag tgctttgtct ccactcagta2982ccttggatca gagctgctga gttcaggatg cctgcgtgtg gtttaggtgt tagccttctt3042acatggatgt caggagagct gctgccctct tggcgtgagt tgcgtattca ggctgctttt3102gctgcctttg gccagagagc tggttgaaga tgtttgtaat cgttttcagt ctcctgcagg3162tttctgtgcc cctgtggtgg aagaggcacg acagtgccag cgcagcgttc tgggctcctc3222agtcgcaggg gtgggatgtg agtcatgcgg attatccact cgccacagtt atcagctgcc3282attgctccct gtctgtttcc ccactctctt atttgtgcat tcggtttggt ttctgtagtt3342ttaattttta ataaagttga ataaaatat 3371<210>18<211>895<212>PRT<213>人类<400>18Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr
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<221>CDS<222>(559)...(1878)<400>29ctgctcgcgg ccgccaccgc cgggccccgg ccgtccctgg ctcccctcct gcctcgagaa60gggcagggct tctcagaggc ttggcgggaa aaaagaacgg agggagggat cgcgctgagt120ataaaagccg gttttcgggg ctttatctaa ctcgctgtag taattccagc gagaggcaga180gggagcgagc gggcggccgg ctagggtgga agagccgggc gagcagagct gcgctgcggg240cgtcctggga agggagatcc ggagcgaata gggggcttcg cctctggccc agccctcccg300cttgatcccc caggccagcg gtccgcaacc cttgccgcat ccacgaaact ttgcccatag360cagcgggcgg gcactttgca ctggaactta caacacccga gcaaggacgc gactctcccg420acgcggggag gctattctgc ccatttgggg acacttcccc gccgctgcca ggacccgctt480ctctgaaagg ctctccttgc agctgcttag acgctggatt tttttcgggt agtggaaaac540cagcagcctc ccgcgacg atg ccc ctc aac gtt agc ttc acc aac agg aac 591Met Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn1 5 10tat gac ctc gac tac gac tcg gtg cag ccg tat ttc tac tgc gac gag 639Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu15 20 25
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130 135 140Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly145 150 155 160Ser Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu165 170 175Tyr Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser180 185 190Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys195 200 205Ala Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu210 215 220Ser Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu225 230 235 240His Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln245 250 255Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala260 265 270Pro Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser275 280 285Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr290 295 300His Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro305 310 315 320Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile325 330 335Ser Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu340 345 350Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn355 360 365Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu370 375 380Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr385 390 395 400Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu405 410 415Glu Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu420 425 430Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala435<210>31<211>1374<212>DNA
<213>人类<220>
<221>CDS<222>(103)...(1047)<400>31ggacagcttg gagatagggc ccggaattgc gggcgtcact ctgctcctgc gacctagcca60ggcgtgaggg agtgacagca gcgcattcgc gggacgagag cg atg agt gag aac 114Met Ser Glu Asn1gcc gca cca ggt ctg atc tca gag ctg aag ctg gct gtg ccc tgg ggc 162Ala Ala Pro Gly Leu Ile Ser Glu Leu Lys Leu Ala Val Pro Trp Gly5 10 15 20cac atc gca gcc aaa gcc tgg ggc tcc ctg cag ggc cct cca gtt ctc 210His Ile Ala Ala Lys Ala Trp Gly Ser Leu Gln Gly Pro Pro Val Leu25 30 35tgc ctg cac ggc tgg ctg gac aat gcc agc tcc ttc gac aga ctc atc 258Cys Leu His Gly Trp Leu Asp Asn Ala Ser Ser Phe Asp Arg Leu Ile40 45 50cct ctt ctc ccg caa gac ttt tat tac gtt gcc atg gat ttc gga ggt 306Pro Leu Leu Pro Gln Asp Phe Tyr Tyr Val Ala Met Asp Phe Gly Gly55 60 65cat ggg ctc tcg tcc cat tac agc cca ggt gtc cca tat tac ctc cag 354His Gly Leu Ser Ser His Tyr Ser Pro Gly Val Pro Tyr Tyr Leu Gln70 75 80act ttt gtg agt gag atc cga aga gtt gtg gca gcc ttg aaa tgg aat 402Thr Phe Val Ser Glu Ile Arg Arg Val Val Ala Ala Leu Lys Trp Asn85 90 95 100cga ttc tcc att ctg ggc cac age ttc ggt ggc gtc gtg ggc gga atg 450Arg Phe Ser Ile Leu Gly His Ser Phe Gly Gly Val Val Gly Gly Met105 110 115ttt ttc tgt acc ttc ccc gag atg gtg gat aaa ctt atc ttg ctg gac 498Phe Phe Cys Thr Phe Pro Glu Met Val Asp Lys Leu Ile Leu Leu Asp120 125 130
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atg ctc cca gcc cag ctg tag ctctgggcct ggaactatga agacctagtg 1077Met Leu Pro Ala Gln Leu *310ctcccagact caacactggg actctgagtt cctgagcccc acaacaaggc cagggatggt1137ggggacaggc ctcactagtc ttgaggccca gcctaggatg gtagtcaggg gaaggagcga1197gattccaact tcaacatctg tgacctcaag ggggagacag agtctgggtt ccagggctgc1257tttctcctgg ctaataataa atatccagcc agctggagga aggaagggca ggctgggccc1317acctagcctt tccctgctgc ccaactggat ggaaaataaa aggttcttgt attctca 1374<210>32<211>314<212>PRT<213>人类<400>32Met Ser Glu Asn Ala Ala Pro Gly Leu Ile Ser Glu Leu Lys Leu Ala1 5 10 15Val Pro Trp Gly His Ile Ala Ala Lys Ala Trp Gly Ser Leu Gln Gly20 25 30Pro Pro Val Leu Cys Leu His Gly Trp Leu Asp Asn Ala Ser Ser Phe35 40 45Asp Arg Leu Ile Pro Leu Leu Pro Gln Asp Phe Tyr Tyr Val Ala Met50 55 60Asp Phe Gly Gly His Gly Leu Ser Ser His Tyr Ser Pro Gly Val Pro65 70 75 80Tyr Tyr Leu Gln Thr Phe Val Ser Glu Ile Arg Arg Val Val Ala Ala85 90 95Leu Lys Trp Asn Arg Phe Ser Ile Leu Gly His Ser Phe Gly Gly Val100 105 110Val Gly Gly Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Glu Met Val Asp Lys Leu115 120 125Ile Leu Leu Asp Thr Pro Leu Phe Leu Leu Glu Ser Asp Glu Met Glu130 135 140Asn Leu Leu Thr Tyr Lys Arg Arg Ala Ile Glu His Val Leu Gln Val145 150 155 160Glu Ala Ser Gln Glu Pro Ser His Val Phe Ser Leu Lys Gln Leu Leu165 170 175Gln Arg Leu Leu Lys Ser Asn Ser His Leu Ser Glu Glu Cys Gly Glu180 185 190Leu Leu Leu Gln Arg Gly Thr Thr Lys Val Ala Thr Gly Leu Val Leu195 200 205Asn Arg Asp Gln Arg Leu Ala Trp Ala Glu Asn Ser Ile Asp Phe Ile210 215 220
Ser Arg Glu Leu Cys Ala His Ser Ile Arg Lys Leu Gln Ala His Val225 230 235 240Leu Leu Ile Lys Ala Val His Gly Tyr Phe Asp Ser Arg Gln Asn Tyr245 250 255Ser Glu Lys Glu Ser Leu Ser Phe Met Ile Asp Thr Met Lys Ser Thr260 265 270Leu Lys Glu Gln Phe Gln Phe Val Glu Val Pro Gly Asn His Cys Val275 280 285His Met Ser Glu Pro Gln His Val Ala Ser Ile Ile Ser Ser Phe Leu290 295 300Gln Cys Thr His Met Leu Pro Ala Gln Leu305 310<210>33<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>33tacacaccac cttcgctgaa ag22<210>34<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>34ggcctggttc tcattcaaat tg22<210>35<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物
<400>35cgcattgctg agtctcacct gcagtc26<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>36cagccttaca gagactggaa aagaa 25<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>37gaggctcagg gacccaaag19<210>38<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>38ccaaaccaag gcccccagag aggt 24<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物
<400>39cctaccgcca gcacattgt19<210>40<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>40gctgttgtag gcattgatga aca 23<210>41<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>41aatgacatga accccggcaa cctg 2权利要求
1.评价乳腺癌患者预后的方法，所述的方法包括检测来自所述患者的样品中的至少一种生物标记的超表达，其中所述的生物标记选自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6组成的组，其中所述生物标记的超表达预示预后，并且由此评价所述乳腺癌患者的预后。
2.权利要求1所述的方法，其中所述生物标记的超表达预示预后差。
3.用于评价淋巴结-阴性乳腺癌患者预后的方法，所述的方法包括检测来自所述患者的样品中的至少两种生物标记的表达，其中检测所述生物标记的表达包含进行免疫组织化学、核酸杂交或定量RT-PCR，其中所述生物标记中至少两种的超表达预示预后差，并且由此评价所述乳腺癌患者的预后。
4.用于评价乳腺癌患者预后的方法，所述的方法包括检测来自所述患者的样品中的至少两种生物标记的表达，其中检测所述生物标记的表达包含进行免疫组织化学、核酸杂交或定量RT-PCR，其中不存在所述生物标记中至少两种的超表达预示预后良好，并且由此评价所述乳腺癌患者的预后。
5.权利要求3所述的方法，其中至少两种生物标记的超表达特异性将预后差的乳腺癌患者与预后良好的患者区分开来。
6.权利要求3所述的方法，其中所述的生物标记参与细胞周期调节、DNA复制、转录、信号传导、细胞增殖、侵入、编程性细胞死亡、蛋白水解或转移。
7.用于评价乳腺癌患者预后的方法，所述的方法包括检测来自所述患者的样品中的至少两种生物标记的表达，其中所述生物标记中至少一种的超表达预示预后差，其中所述的生物标记选自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6组成的组，并且由此评价所述乳腺癌患者的预后。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的生物标记选自由SLPI、PSMB9、MUC-1、src、E2F1和p21ras组成的组。
9.权利要求7所述的方法，所述的方法包括检测样品中两种生物标记的表达，其中所述的生物标记为SLPI和E2F1，其中所述生物标记中至少一种的超表达预示预后差，并且由此评价所述乳腺癌患者的预后。
10.权利要求7所述的方法，所述的方法包括检测样品中三种生物标记的表达，其中所述的生物标记为SLPI、E2F1和MUC-1，其中所述生物标记中至少一种的超表达预示预后差，并且由此评价所述乳腺癌患者的预后。
11.权利要求7所述的方法，所述的方法包括检测样品中四种生物标记的表达，其中所述的生物标记为SLPI、E2F1、MUC-1和src，其中所述生物标记中至少一种的超表达预示预后差，并且由此评价所述乳腺癌患者的预后。
12.权利要求7所述的方法，所述的方法包括检测样品中五种生物标记的表达，其中所述的生物标记为E2F1、SLPI、MUC-1、src和p21ras，其中所述生物标记中至少一种的超表达预示预后差，并且由此评价所述乳腺癌患者的预后。
13.权利要求7所述的方法，所述的方法包括检测样品中六种生物标记的表达，其中所述的生物标记为E2F1、SLPI，MUC-1、src、p21ras和PSMB9，其中所述生物标记中至少一种的超表达预示预后差，并且由此评价所述乳腺癌患者的预后。
14.用于评价淋巴结-阴性乳腺癌患者预后的方法，所述的方法包括检测来自所述患者的样品中至少两种生物标记的表达，其中所述生物标记中至少两种的超表达预示预后差，其中使用时序检验将所述的生物标记确定为具有统计学显著性，以便评价因潜在的乳腺癌导致的乳腺癌复发或死亡的可能性，并且由此评价所述乳腺癌患者的预后。
15.权利要求3所述的方法，其中用于评价乳腺癌患者预后的所述的方法进一步包含评价临床信息。
16.权利要求15所述的方法，其中所述的临床信息包含肿瘤大小、肿瘤等级、淋巴结状态和家族史。
17.权利要求16所述的方法，其中所述的方法用于研发针对所述乳腺癌患者的治疗策略。
18.权利要求3所述的方法，其中将用于评价乳腺癌患者预后的所述方法与分析Her2/neu表达水平相结合。
19.权利要求3所述的方法，其中将用于评价乳腺癌患者预后的所述方法与分析患者的雌激素受体或孕酮受体状态相结合。
20.权利要求3所述的方法，其中用于评价乳腺癌患者预后的所述方法独立于患者的雌激素受体状态。
21.权利要求3所述的方法，其中所述的方法用于评价雌激素受体-阳性或雌激素受体-阴性乳腺癌患者的预后。
22.权利要求3所述的方法，其中所述的乳腺癌患者具有早期乳腺癌。
23.用于评价乳腺癌患者预后的方法，所述的方法包括a)从所述患者中获得样品；b)使所述样品接触至少一种抗体，其中所述的抗体特异性结合生物标记蛋白，其中所述的生物标记蛋白选自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6组成的组；c)检测所述抗体与所述生物标记蛋白的结合；d)测定所述生物标记蛋白是否在所述样品中超表达，其中所述生物标记蛋白的超表达预示预后差；和e)由此评价所述乳腺癌患者的预后。
24.权利要求23所述的方法，其中所述的生物标记选自由E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9组成的组。
25.用于评价乳腺癌患者预后的方法，所述的方法包括a)从所述患者中获得样品；b)使所述样品接触至少两种抗体，其中所述的抗体各自特异性结合不同的生物标记蛋白；c)检测所述抗体与所述生物标记蛋白的结合；d)测定所述生物标记蛋白是否在所述样品中超表达，其中所述生物标记蛋白中至少两种的超表达预示预后差；和e)由此评价所述乳腺癌患者的预后。
26.权利要求25所述的方法，其中所述的生物标记选自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6组成的组。
27.包含至少两种抗体的试剂盒，其中所述抗体各自特异性结合预示乳腺癌患者预后差的不同的生物标记蛋白。
28.权利要求27所述的试剂盒，其中所述的生物标记蛋白参与细胞周期调节、DNA复制、转录、信号传导、细胞增殖、侵入、编程性细胞死亡、蛋白水解或转移。
29.权利要求27所述的试剂盒，其中所述的生物标记蛋白选自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6组成的组。
30.权利要求29所述的试剂盒，其中所述的生物标记蛋白选自由E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9组成的组。
31.权利要求27所述的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含用于检测结合所述生物标记蛋白的抗体的化学品。
32.权利要求27所述的试剂盒，其中该试剂盒用于商品抗体结合检测系统。
33.权利要求27所述的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含阳性对照样品。
34.权利要求27所述的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含使用说明书。
35.预测乳腺癌患者对所选治疗的反应的方法，所述的方法包括检测来自所述患者的样品中的至少两种生物标记的表达，其中所述生物标记中至少两种的超表达预示阳性治疗反应，且由此预测所述乳腺癌患者对所述治疗的反应。
36.预测乳腺癌患者对所选治疗的反应的方法，所述的方法包括检测来自所述患者的样品中的至少两种生物标记的表达，其中所述生物标记中至少两种的超表达预示阴性治疗反应，且由此预测所述乳腺癌患者对所述治疗的反应。
37.预测乳腺癌患者存活可能性的方法，包括检测来自所述患者的样品中的至少五种生物标记的表达，其中所述生物标记中无一超表达预示存活可能性增加，并且其中所述生物标记中至少两种的超表达预示存活可能性下降。
38.权利要求37所述的方法，其中增加数量的所述生物标记的超表达预示存活可能性下降。
39.权利要求37所述的方法，其中所述的生物标记选自由SLPI、D21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6组成的组。
全文摘要
提供了用于评价乳腺癌患者，特别是早期阶段乳腺癌患者预后的方法和组合物。本发明的方法包括检测身体样品中至少一种，更特别的是至少两种生物标记的表达，其中生物标记或生物标记的组合的超表达预示乳腺癌预后。在某些实施方案中，所述的身体样品为乳腺组织样品，特别是原发性乳腺肿瘤样品。本发明的生物标记为蛋白质和/或基因，其超表达预示良好或差的癌症预后。所关注的生物标记包括参与细胞周期调节、DNA复制、转录、信号传导、细胞增殖、侵入、蛋白水解或转移的蛋白质和基因。在本发明的某些方面中，使用生物标记－特异性抗体在蛋白质水平上或使用核酸杂交技术在核酸水平上检测所关注的生物标记的超表达。
文档编号G01N33/574GK101057144SQ200580038980
公开日2007年10月17日 申请日期2005年9月22日 优先权日2004年9月22日
发明者T·J·费希尔, C·M·怀特黑德, D·P·马利诺斯基, R·马塞尔普瓦尔, D·莫雷尔 申请人:三路影像公司