通过双向电泳同时分离生物分子的方法和仪器的制作方法

专利名称：通过双向电泳同时分离生物分子的方法和仪器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个双向电泳分离生物分子的方法，特别是包含在生物样 品中的蛋白质和/或多肽和/或肽组分，这是通过应用具有非平行力线的电场 以及合适的仪器来实现的。
背景技术：
如今已经有很多技术用于分离生物分子，特别是蛋白质。事实上，许 多电泳技术(如聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳和等电聚焦
(isoelectrofocalization))和色谱技术(如离子交换色谱、亲和色谱、凝胶过滤 色谱)都在应用。已知，现在可以同时分离上千蛋白质的最有效的方法就是 双向电泳(2-DPAGE)。该工艺包括
-等电聚焦(正F，第一向电泳)，就是根据蛋白质等电点在聚丙烯酰胺基 质上将它们分离；
-平衡，这样得到恒定的蛋白质的电荷/质量比；
-在十二烷基硫酸钠(SDS)中的聚丙烯酰胺基质电泳(SDS PAGE,第二 向电泳)，在其中蛋白质基于其分子量而分离； -凝胶染色以使点上所含的蛋白质可视化； -加工所得数据； -点取样。
后续的样品蛋白质的鉴定通过质谱或其他己知的技术进行分析。 关于这项技术的详细说明参见美国专利4088561。其它有关该技术的 更优化的改进方式参见近期的专利:JP58193446; US4874490; WO 0226773。
蛋白质组学的目的是检测细胞中表达的全套蛋白质，而双向电泳技术 是蛋白质组学研究的基础。目标是比较健康细胞与疾病细胞之间蛋白质 组，以确定后者的病理状态，从而促进新的特异性治疗试剂的发展。
已知，该项技术在分离生物样品中的不同组分时存在缺陷，这些组分
的数量很大；而该技术的首要限制就是分离混合物中数量较小的组分的可 见性问题。这一缺陷产生的原因是存在蛋白质和/或多肽和/或肽具有相似的 分子量(MW)和等电点(pI)，但相对丰度却不同，也就是说，能检测到的含 量不同。这意味着可也识别测试样品的大部分的小可能性以及未充分分离 的单个样品点手工测定量的难度。
该技术还有一个缺陷是，当一种蛋白质不能与其他组分充分分离时， 表征和鉴定该蛋白就变得十分困难，也就是说，似乎是包含一个单独蛋白 质分子的斑点通常由具有相似特征的不同蛋白形成。表征并鉴定这些斑点 (其由本领域普通技术人员通过质谱等常规手段进行鉴定)还不可行，或者说 在某些情况下只能鉴定出含量高的蛋白质组分。
本发明主要的但不是唯一的目的是克服所述的缺陷，从而使显著提高 生物分子的分离效率成为可能，特别是分离蛋白质和/或多肽和/或肽组分。
本发明的另一个目的是提供一种如上所述的电泳技术，此电泳技术能 够确保提供更好的分离效果，在工艺末端从初始样品中提取单个组分的更 好的操作性，继而使得更快地表征这些组分。
本发明的又一个目的是提供一种能够更准确地从初始样品中鉴定单个 组分的电泳技术。
本发明的再一个目的是提供了一种经济的、便于使用的并且可循环使 用的电泳技术。而且本发明还有一个目的是，提供了一种使预先的纯化/富 集样品的步骤减到最少从而降低样品损失的电泳技术。
本发明的电泳技术还有其他目的，可用于分离生物样品中的生物分 子，特别是基于特定的化学和/或物理特性预先整理的蛋白质和/或多肽和/ 或肽组分。

发明内容
根据发明者的经验，从仪器的角度已经被认知的是，在分离生物样 品，特别是其中具有相似的特征(如分子量和/或等电点)的不同的蛋白质组 分，的分离效率的限制的主要原因是使用了特征是具有平行力线的电场，
典型为双向电泳(2-D PAGE)。
此项发明是一种具有非平行力线的电场，在基质B(matrix B)上转移并 分离生物样品中的蛋白质和/或多肽和/或肽组分的双向电泳技术类型。而这 些组分已预先根据其化学和/或物理特性在基质A(matrix A)上被整理。
因此，这项发明的目的是提供了一种可以将包含在至少一个生物样品 中的生物分子同时分离的双向电泳方法，至少包括以下的步骤
从至少一个第一基质(其中所述生物分子被包含在所述生物样品中并基 于化学和/或物理特性而整理)转移到至少一个第二基质(其中所述生物分子 被彼此分离)，并且转移和分离所述生物分子是通过具有非平行力线的电场 来实现的。
本发明的进一步的目的是一个可以同时分离包含在至少一个生物样品 中的生物分子的双向电泳仪器，其中所述仪器在至少一个第一基质中(在 其中所述生物分子包含在所述生物样品中并基于化学和/或物理特性而被整 理)产生至少一个有非平行力线的电场，并在至少一个第二基质(在其中 所述生物分子被分离)中通过电场产生的方法所述的生物分子从所述的第 一基质转移到所述的第二基质，并通过该方法所述的生物分子被分离。
这样的方法和仪器更适合于于分离具有相似的化学和/或物理特性的蛋 白质和/或多肽和/或肽组分，以及表征含有蛋白质组分的生物样品。


图1:两个电极产生的具有径向扩散的电场例的示意图。
图2:两个电极产生的具有径向扩散的圆扇型电场例的示意图。
图3:多于两个电极产生的具有非平行力线的电场示意图。
图4:通过具有径向扩散的非平行力线的电场的方法，适于分离生物
分子(特别是基于特定化学和/或物理特性整理的蛋白质和/或多肽和/或肽
组分)的仪器的一个可能的实施例示意图，
图5:利用传统的双向电泳分离成纤维原细胞蛋白并以溴酚蓝指示的
电泳前沿的凝胶图。
图6:利用本发明分离成纤维原细胞蛋白并以溴酚蓝指示的电泳前沿 的凝胶图。
图7:利用传统双向电泳的基于分子量分离蛋白质的分离成纤维原细 胞蛋白的凝胶图。
图8:利用本发明中双向电泳基于分子量分离蛋白质的分离成纤维原 细胞蛋白质的凝胶图。
具体实施例方式
下面的详细描述将有助于更好地了解本发明中的电泳方法和仪器的目 的和优势，并且其本质的特征和可能的实施例也将有所描述。
用于同时分离包含在一个生物样品中的生物分子的电泳方法，包括至 少一个在一个适当的支持物上的一个适当的基质中分离所述的生物分子的
步骤，所述生物分子特别是指蛋白质和/或多肽和/或肽，所述分离是通过应 用具有非平行力线的电场的方法来实现的，所述的电泳方法实际上是双向
电泳方法，所述双向电泳方法是在一个仪器中实现，其中电场的力线由至 少两个电极确定，其中至少一个为阳极，至少一个为阴极。所述力线是在 第一基质A和第二基质B中确定的，其中第一基质A包括生物样品或准备 检测的样品；在第二基质B中生物分子组分特别是具有蛋白质性质的组分 通过所述电极的适当的几何构造和/或所述基质的形状和/或它们相对于电极 的位置和/或电极和基质之间包含的传导物质(电解缓冲液)而被转移继而被 分离。
为了提供一个电泳槽中放置电极的首选位置，以获得具有非平行力线 的电场，可以将电极J放置于围绕圆心的环形平面上，所述圆心处则放置 有底顶杆型(puntiform)电极K(与J的极性相反)。
已知， 一个电极槽中的不同的组成部分(容器、基质、电解缓冲液等) 能够影响电极产生的电场力线的方向和/或形状。因此，按照一定的方式放 置所述组成部分从而得到可重复的并适用于生物样品分离的电场力线是很 重要的。
然而，这些电极以某种方式被放置从而在一个包括电极自身的平面区 域中产生充分连续或非连续的电场，其中电场具有非平行力线，并根据电 场本身的极性以及持续时间和密度的变化(基于电泳分离的样品类型)而表现 出发散或会聚形式。
所产生的电场的性质会影响分离效果。电压的选择将基于由操作者确
定的使用时间，通常在大约30-600V的电压范围内，并且还决定于需要分 离的样品的类型、基质的尺寸、电极间的距离、系统的传导率和对分离质 量的要求。
为了获得双向电泳分离，初始的生物样品可以在已知的电泳用蛋白材 料处理步骤之后再进行处理。在这种情况下，待检测的生物样品在利用非 平行力线的电场进行电泳分离之前可以进行如下预处理操作
-在第一基质中基于其化学或物理特性从而获得生物分子(特别是蛋白
质和/或多肽和/或肽)的第一分离的处理；
一使这些生物分子(蛋白质和/或多肽和/或肽)具有恒定的电荷/质量比的
进一步处理。
第一向分离，也就是在基质A上的分离，可以通过带状电泳、圆盘电 泳、全同立构电泳(isotacophoresis)来实现，也可以通过等电聚焦来实现， 其中等电聚焦或者在两性可溶缓冲液或固定于适当连续的或颗粒状的反对 流(anticonvective)基质的pH梯度中进行。这些基质可能是但不仅限于聚丙 烯酰胺、琼脂糖、醋酸酯凝胶、交联葡聚糖等。此外，这些用于第一向分 离的反对流基质可以利用传统的塑料支持物(比如聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖 凝胶)或这电流可通过的多孔支持物(比如醋酸纤维素滤膜，尼龙网，玻璃纤 维膜)来锚定。
用于双向电泳的第二基质(这是本发明的目的)可以用一种聚合物来 替代，该聚合物具有恒定的浓度或者多孔性梯度，从而在连续的或非连续 的缓冲液中优化基于分子量不同的蛋白质/肽(在非变性条件下或在变性剂存 在的情况下)的分离。举例来说，这些聚合物可以是丙烯酰胺、双丙烯酰 胺、琼脂糖和/或醋酸纤维素的混合物。
在产生非平行力线的电场区域还允许在第一基质A和第二基质B之间 存在空隙，并且该空隙中可以加入第三基质(比如琼脂糖)，从而可以保持基 质A和基质B之间的连续性，并使样品从基质A迁移到基质B成为可能。
另一方面，被适当地插入用于第二向的电泳槽的第一基质A通过与被 置于非常接近第一基质A的第二基质B在原位直接聚合(从而消除空隙)进 而与基质B融合以通过非平行力线进行第二向电泳。
可以选择预先通过加热样品使之热变性或使用变性剂(如尿素、硫尿、 表面活性剂和/或有机溶剂，或所述试剂的混合物)使之化学变性，或者使用 还原剂(如beta-巯基乙醇、二硫苏糖醇或磷酸三丁酯)使之还原的方法处理 样品。另外在变性和/或还原处理后还可以将样品烷基化，烷基化试剂包括 碘代乙酰胺、丙烯酰胺、N取代丙烯酰胺和乙烯基吡啶等。
本发明中的双向电泳因此用于
l.生物样品的准备；
2. 在第一基质A中根据化学和/或物理特性的第一分离以便整理生物分 子，特别是蛋白质和/或多肽和/或肽组分；
3. 基于电荷处理基质A从而使其中所含的组分均衡(uniform);
4. 基质A插入在仪器中，所述插入方法使得基质A位于至少一个电极 和至少一个第二基质B之间，所述基质B被置于至少一个第二电极附近；
5. 将电解溶液加入仪器中电极之间的区域，在其中放置有基质，并且 生成电场；
6. 应用具有非平行力线的电场，其适于将根据化学和/或物理特性预整 理的蛋白质和/或多肽和/或肽组分从基质A转移到基质B，继而在基质B中 发生进一步分离。
所述的双向电泳提供应用在一个在包括至少两个彼此相随的基质的区 域中具有非平行力线的电场，其中至少一个第一基质A位于至少一个第一 电极附近，至少一个第二基质B被置于第一基质A与至少一个与第一电极 电荷相反的第二电极之间。
双向电泳结束后，在基质B中被分离后蛋白质是可视的并从基质B中 取样，通过测序和/或质谱和/或该领域的其它已知方法进行鉴定。
该方法也可以用于表征生物样品，在其中被分离的蛋白质在鉴定之前 可以通过光密度测定、放射自显影、化学荧光或荧光可视化，或者利用生 物活性(如抗原-抗体反应或酶谱)测定。
在本发明的第一方面， 一个电泳仪器可以使得一个或多个生物样品被 分离成其组分，特别是基于化学和/或物理特性预整理的蛋白质和/或多肽和
/或肽组分，该仪器包括
-至少两个适用于产生具有非平行力线的电场的电极；
-至少有一个平面，其中包括至少一个电极之间的区域，在该区域产生 具有非平行力线特征的电场，所述平面包含至少一个支持物，其适于在电
极间的区域中容置至少一个或多个彼此接近放置的基质，其中(i)一个第 一基质A，其中来自一个或多个生物样品的生物分子，特别是蛋白和/或多 肽和/或肽组分，己经基于特定的化学和/或物理特性被预整理；(ii)一个第 二基质B，其中来自前述生物样品的生物分子从第一基质A中转移，在基 质B中获得相对于第一基质A的进一步分离。可选择地是第一基质A和第 二基质B被置于它们各自的支持物上，即使基质的支持物不同，它们也在 同一个平面上，并且保持与电极相同的几何构造。该平面可以水平或垂直 放置，并且没有显著的差异；
-至少一个用于电场的电源，其可以是该仪器部分，也可以外附的； -可选择的，至少有一个使得系统保持在预先设定的温度的装置，例如 自动调温器。另外除了使用自动调温器所述仪器也可以放置在一个温度控 制设备中。
为了获得理想的双向电泳分离效果，放置电泳基质的区域所在的平面 可以采用各种形状，如圆形或其它形状，所采用的形状用来产生具有非平 行力线的电场，这对于获得理想的蛋白材料同时分离的效果是必要的。
仪器的一个可能的实施例的结构是一个用于电泳的圆柱槽且其内部有 电极。当所述的槽闭合时，更进一步界限了电极部分和它们之间的部分。
更进一步，这一槽可以是任何已知的绝缘材料以保证当由适当的电源产生 并通过电极间空间时不会短路或分散电流，同样也是为安全使用。这样的 材料可以是例如，聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚丙烯或聚乙烯等聚合 物或玻璃、人造橡胶。
更进一步，这一槽可以包含将电流连接到电极的电连接器。
槽的优选实施例可以包括更彼此不同的区域，在其中具有非平行力线 的电场被生成。优选生成电场的区域是被置于适当的通常用于分离生物样 品中蛋白质物质的支持物上的基质，所述基质可以被制定，例如聚丙烯酰 胺混合物，并且能够基于分离的类型而改变密度。在这样情况下从生物样 品中同时分离生物分子是可以获得的。
电极是由本领域行家已知的材料制成，比如铂包衣的钛，但没有排除 其它也适于制备电极的材料。阳极优选被置于同阴极共面的位置。基质是 在两个电极之间放置，在其中产生电场，并由同样的电极限定区域，最好 是同心的，但不是必需。这一槽作为一个整体可以是圆柱型或平行四边形 或其它适用的形状。
此外，基质形成的不同区域，也就是形成具有非平行离线的电场的区 域，可以优先是垂直叠放而不是并排放置。仪器的放置电极的部分，是浸 没在被电解液中的，以保证在电极和被置于生成具有非平行力线的电场的 区域中的基质之间有持续的电流转移。这样蛋白质样品可以在电压差作用 下分离迁移。
电解液的温度是由温控设备控制的，这样可以维持系统处于一个恒定 的预设温度。
另外，这一仪器可以有它自己的供电系统或者连接到一个外接电源。 本发明的实施情况可以在下述的详细描述中表明，其参照的相关附图
显示了 一些优选且非限制性实施例
图1显示了一个区域示意图，在其中两个电性不同的电极产生一个圆
冠形具有径向扩散的非平行且分散的力线的电场，其中1是电场的外部区
域且在其中置有至少有一个电极，2是电场的内部区域且在其中置有至少有
一个与第一个电极电性相反的第二电极，3代表是电场形成的力线，4是电 场自身。
图2显示一个区域示意图，其中由至少两个电极形成的电场是扇型且 具有径向扩散的非平行力线，其中l， 2， 3， 4与图1中含义一致。
图3显示基于另一实施例的一个区域示意图，其中具有非平行力线的 电场是由多于两个的电极产生的，在这里1是置有多个具有相同电荷的电 极的电场部分，2是置有多个具有相同但与1中相反电荷的电极的电场部 分，3是电极间形成的力线，4是电场自身。
参照所引用附图，用于实施本发明目标的电泳方法的仪器，包含有至 少一个电场4，特征是具有非平行力线3，其是由电源连接到至少一个电极 (例如阴极2)和至少一个第二个电极(比如阳极l)所形成的。
图4显示一个用于分离生物分子(特别是基于特定化学和/或物理性质预 整理的蛋白质和/或多肽和/或肽组分)的有自动调温器的仪器的示意图，所 述的分离是通过由如前所述的连接到电源12的两个电极1和2生成的带有 径向扩散的非平行力线的电场来实现的，特别是在图4中显示了一个由盖8 和支持物底座7限定其末端的圆柱结构，该结构容置了
-冷却液；
-用于扩散制冷效果的风扇11; -洞9，用于自动调温器交换冷却液； -用于支持电扇11实现其功能的电源10。
这一仪器内部包括，例如，6个用于分离生物样品的区域。每一个区 域都围绕着电极2放置有基质A13，基于特定化学和/或物理性质预整理的 生物样品可以被放置在其上，然后是基质B14，其被放置在它自身的支持 物15上，在电极l和基质A13限定的区域内，基于具有非平行力线的电场 的作用决定了生物样品的迁移，离开所述基质A13，并随后分离成组分。
没有超出本发明的范围，用于与自动调温设备交换冷却液的风扇11和 洞9以及为风扇11的电源10，也可被置于电泳槽部分而不是其底座。
提供一个示例，基于本发明方法的生物样品电泳与传统的双向电泳法 的电泳分析比较被描述了。
纤维原蛋白的电泳分离实验例
源自培养的人纤维细胞并被溶于含有8M尿素,4% 3-[3-(胆酰氨丙基)二 甲铵基]丙磺酸内盐(CHAPS)， 2% IPG缓冲液(pH 4-7)， 60mM 二硫苏糖醇 (DTT)的溶液中的蛋白样品被使用。
两项技术中蛋白样品均是被注入到具有固定pH梯度(这个例子中有着 pH4-7的分离范围)聚丙烯酰胺基质中，随后基于其等电点通过等电点电泳 分离成组分。然后样品接受平衡缓冲液的处理以优化前述组分的恒定电荷/ 质量比。
平衡缓冲液成分
50 mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl )pH 8.8, 6M尿素，30% 甘油，2%十二垸基磺酸钠，0.002%溴酚蓝(w/v).
在传统的双向电泳中，第一个基质中的样品通过具有平行力线的电场 被转移到第二个矩形聚丙烯酰胺基质中，该基质被用于实施SDS-PAGE电 泳，在其中测试样品组分基于它们的分子量被进一步分离。
基于本发明的方法，含有基于等电点而被分离并被平衡的样品的第一 基质是圆形且被置于一个圆冠形电场中，在其中测试样品的组分会被进一 步的分离，第二个圆冠形聚丙烯酰胺基质中基于组分分子量进行SDS-PAGE 凝胶电泳。
这两个实验中第二基质的特征是
成分10%丙烯酰胺，0.4% N,N，-亚甲基双丙烯酰胺，1%十二垸基磺 酸钠，40 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.5%过硫酸铵。
在这两个实验中，在SDS-PAGE末期基质及其所含样品做如下处理
(i) 在室温下用库马斯蓝(Coomassie Blue)染色四个小时。
(ii) 在室温下用包含有甲醇和醋酸的脱色液脱色24小时。 最后，用扫描仪获得数字化的数据图片。
用传统方法和本发明的方法进行电泳的区别可以在图5和图6中溴酚 蓝标记分别看出。在图5中箭头所指为电泳的方向。图6中电泳结尾的标 记可以看见。在图7(使用传统方法)和图8(使用本发明方法)中蛋白点的泳 动区别可以看见本发明中在径向分离时点之间的相对距离增加使得实现 提高了的分离结果。如果没有这样的径向分离就不能如图8所示那样彼此 区别这些点。
尽管本发明已经描述了一些实施例的形式，给出本发明的示例但非限 制，不同的修改和变化会在所述的描述的指示下对本领域人员是显而易见 的。本发明包括所有在下述的权利要求书范围内的修改和变化。
权利要求
1.用于同时分离包含在至少一个生物样品中的生物分子的双向电泳方法，包括至少以下步骤从至少一个第一基质转移，其中所述生物分子被包含在所述生物样品中并基于化学和/或物理特性被整理，在至少一个第二基质上所述生物分子被彼此分离，所述生物分子的转移和分离是应用具有非平行力线的电场引起的。
2. 根据权利要求1所述的双向电泳方法，包括进一步的步骤 处理样品以进行包含在第一基质上的样品中生物分子的第一分离； 处理含有前述步骤获得的样品的第一基质以得到所述生物分子的恒定的电荷/质量比。
3. 根据权利要求2所述的双向电泳方法，其中第一向分离是通过带状 电泳、圆盘电泳、全同立构电泳、在两性可溶缓冲液中的等电聚焦或通过 适当反对流基质的固定pH梯度来实现。
4. 根据权利要求3所述的双向电泳方法，其中所述的反对流基质可 是连续或颗粒状的，且选自聚丙烯酰胺、琼脂糖、醋酸酯凝胶、交联葡聚
5. 根据权利要求3所述的双向电泳方法，其中所述的用于第一向分 离的反对流基质可以用塑料支持物或电流可通过的多孔支持物来锚定。
6. 根据权利要求5所述的双向电泳方法，其中所述所选的支持物， 当其为塑料质地时选自聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，当其为多孔支持物 时选自醋酸纤维素滤膜、尼龙网或玻璃纤维膜。
7. 根据权利要求1所述的双向电泳方法，其中被充分插入用于第二 向的电泳槽中的所述第一基质，与所述第二个基质通过直接原位聚合的方 法融合，以消除两基质间空隙。
8. 根据权利要求1所述的双向电泳方法，其中所述的第二基质是有 恒定浓度的或存在连续的或非连续的缓冲液中的多孔梯度的聚合物。
9. 根据前述权利要求所述的双向电泳方法，其中所述的聚合物选自 丙烯酰胺、双丙烯酰胺、琼脂糖或醋酸纤维素。
10. 根据权利要求1所述的双向电泳方法，包括在电泳分离前的进一步处理和可选的包括变性和/或还原。
11. 根据前述权利要求的双向电泳方法，其中所述的变性是由加热样 品导致的热变性，或者通过加入变性和/或还原剂导致的化学变性。
12. 根据前述权利要求所述的双向电泳方法，其中所述的变性剂选自 尿素、硫尿、表面活性剂和/或有机溶剂或其混合物。
13. 根据权利要求11所述的双向电泳方法，其中所述的还原剂选自 p-巯基乙醇、二硫苏糖醇或磷酸三丁酯。
14. 根据权利要求1所述的双向电泳方法，包括在电泳分离前的进一 步处理和可选的包括变性和/或还原以及随后的垸基化。
15. 根据前述权利要求所述的双向电泳方法，其中所述的烷基化由选 自碘代乙酰胺、丙烯酰胺、N取代丙烯酰胺以及乙烯基吡啶的试剂来实 现。
16. 表征生物复合样本的方法，其特征在于使用前述权利要求所述的 方法。
17. 根据前述权利要求所述的方法，包含有更进一步的包含在所述第 二基质中且被电泳分离的生物样品的可视化步骤。
18. 根据前述权利要求所述的方法，其中所述的可视化是通过光密度 测定、放射自显影、化学荧光或荧光、或生物学活性测定实现的。
19. 用于同时分离包含在至少一份生物样品中的生物分子的双向电泳 方法，包含以下步骤准备生物样品；在至少一个第一基质上实施初步分离以便根据化学和/或物理特性整 理生物分子；处理所述第一基质以实现基于电荷的样品生物分子的均衡； 插入所述第一基质到仪器中，所述仪器包括至少两个电极，将所述第一基质置于所述电极的第一电极和置于所述电极的第二电极附近的至少一个第二基质之间； 将电解溶液加入所述仪器中的由所述电极组成且包含所述基质的区域，在其中产生具有非平行力线的电场；在所述电极间的区域生成至少一个具有非平行力线的电场，其中所 述基质被放置以用于将在所述第一基质上预整理的所述生物分子转移到所 述第二基质上并在其中发生进一步的分离。
20. 用于同时分离包含在至少一份生物样品中的生物分子的双向电泳 仪器，其特征在于所述仪器在至少一个第一基质中产生至少一个具有非平 行力线的电场，其中所述生物样品的所述生物分子基于化学和/或物理特 性被整理，在所述至少一个第二基质中所述生物分子被分离，通过所述产 生的电场所述生物分子被从所述第一基质转移到所述第二基质，并通过该 方法所述生物分子被分离。
21. 根据权利要求20所述的电泳仪器，包括了至少两个电极以产生电 场，并且通过一个所述电极的适当的几何形状和/或基质的形状和/或它们 相对于所述电极的位置和/或位于所述电极和所述基质之间的导体材料来 确定所述电场的力线。
22. 根据前述权利要求所述的电泳仪器，其中至少两个所述电极被置 于一个区域中，所述区域适于容置彼此靠近放置的所述第一基质和第二基 质以及传导物质。
23. 根据权利要求20和21所述的电泳仪器，其中所述电极的第一个 电极被沿一个平面圆周放置，所述电极的第二电极置于所述圆周的中心， 所述第二个电极是一个顶底杆型电极且和第一个电极的电荷相反。
24. 根据权利要求20所述的电泳仪器，其中所述的第一基质通过一个适于支持一个第三基质的空隙与所述第二基质分隔，所述的第三个基质使 得所述第 一和第二基质间连续。
25. 根据权利要求20所述的电泳仪器，其中所述具有非平行力线的 电场是连续或非连续的，基于所要分离的样品而变化持续时间和密度。
26. 根据权利要求20所述的电泳仪器，在整个电泳过程中适于控制温度o
27. 用于同时分离包含在至少一份生物样品中的生物分子的双向电泳 仪器，包含至少两个适用于在至少一个平面上的一个确定区域中产生一个 电场，所述的电场具有非平行力线，所述至少一个平面包含至少一个适用 于在所述电极间的所述限定的区域中容置彼此靠近放置的基质的支持物，其特征在于进一步包括(i)至少一个第一基质，其中来自一个或多个生物样本的所述生物分 子已经基于特定的化学和/或物理性质预整理，并被置于靠近至少一个所 述第一电极；(ii) 至少一个第二基质，在其中来自所述生物样品的生物分子被从第 一基质中转移以便获得相对于第一基质所得的进一步的分离，其被置于所 述第一基质和靠近至少一个所述第二个电极之间；(iii) 作为导电材料的电解液；(iv) 至少一个用于电场的电源，其可以是仪器的一部分也可以是外接的。
28. 根据前述权利要求所述的用于同时分离生物分子的双向电泳仪 器，更进一步的包括至少一个维持衡定温度的装置。
29. 根据权利要求27和28所述的用于同时分离生物分子的双向电泳 仪器，其中所述电场具有非平行力线，这是由和/或所述电极的适当的几 何结构，和/或基质的形状，和/或其相对于所述电极所放置的位置，和/或 在所述电极和所述基质之间的导电材料的形状所决定的。
30. 根据所述权利要求1-19所述的方法或根据权利要求20-29所述的 仪器用于表征生物样品。
全文摘要
本发明描述一个用于同时且可重复的分离生物分子的双向电泳方法和实现这一方法的仪器。特别是，本发明涉及上述定义的方法和仪器可以在一个基质上转移和分离已经在另一个基质中基于化学和/或物理特性预整理的蛋白质和/或多肽和/或肽组分。
文档编号G01N27/447GK101111762SQ200580040550
公开日2008年1月23日 申请日期2005年11月24日 优先权日2004年11月26日
发明者伊莉莎·巴瑞娜, 安东尼奥·瓜达尼诺, 汤玛索·萨拉塔, 皮尔乔吉奥·雷迪, 雷纳多·米利奥尼, 马努拉·缪佐 申请人:鲁杰罗马西莫电气合股公司;兹普(股份)责任有限公司