一种细菌atp合酶的结合结构域的制作方法

文档序号:6110197阅读:1175来源:国知局
专利名称:一种细菌atp合酶的结合结构域的制作方法
技术领域
本发明提供了分离的突变atpE蛋白,并从所述突变atpE蛋白中鉴别了一种ATP酶结合结构域。本发明也提供了相关核酸、载体、宿主细胞、药用组合物和产品。本发明进一步提供了确定试验化合物是否与atpE蛋白相互作用(即是否与本发明的ATP酶结合结构域相互作用)的方法,也提供了包含所述试验化合物的药用组合物,具体的,所述试验化合物被用作抗微生物药,更具体来说用作抗分枝杆菌药,尤其被用以治疗患结核的患者。
背景技术
在全世界成人死亡原因中结核(TB)排名前列(次于AIDS),每年导致2-3百万成人死亡,并且是减少全球贫困和疾病工作的关键性障碍(1)。引起该病重新泛滥的因素包括,许多国家在实施抗结核计划中遇到的困难,免疫抑制人数的迅速增加(主要由于HIV感染),以及进出结核高发区的人群流动。TB和HIV在双重感染人群中互相促进传染—目前有1100万人—不仅提高发病率也提高了死亡率(2,3)。另外在HIV感染者的致死原因中,TB也排名前列(4)。
尽管第一线抗TB药物能取得90%以上的有效率,但它们的复杂性会在缺乏适当医疗措施和抗TB计划时引起差药物依从性(poorcompliance),并从而引起抗性(5)。结核病菌的多重药物抗性(MDR)菌株会使得治疗变得非常复杂(6)。全球结核药物开发联盟(The GlobalAlliance for TB Drug Development)已经指出,任何新的治疗方法都必须具有以下三种相对于已有治疗方法的优势中的至少一种缩短或简化有效TB疗法;提高针对MDR菌株的效率;改进潜在TB感染形式的治疗。这种新药能够极大地改善病人的依从性,从而降低TB治疗计划(例如世界卫生组织的现代结核病控制策略(DirectlyObserved Treatment Short-course(DOTs))(7))的成本。
当前处于研发期和临床使用期的新型抗TB候选药物很可能来自现有的药物家族(例如莫西沙星),或者来自第一线药物的类似物例如MJH-98-1-81(来自异烟肼)、唑烷酮类,和利福喷丁(一种非常类似利福平的物质)(8)。尽管这些药物可能是有效的,但结构类似物只能暂时解决抗性问题(9),因为它们的作用机制与现有药物家族一致。
总体上抗生素通常通过特定机制来抑制细菌代谢从而抑制细菌的复制。例如异烟肼对合成枝菌酸的酶作用机制进行干扰,其中枝菌酸是细胞壁的必需成分,而利福平则对细菌的DNA转录机制加以干扰。因此人们热衷于探索新的方法来鉴别新型抗TB化合物,与已知药物相比,这些化合物靶作用于分枝杆菌细胞生长和复制过程中不同的特定方面。
发明概述本发明提供了分离的突变atpE蛋白,其氨基酸序列选自(SEQ IDNo.1)、(SEQ ID No.2)、(SEQ ID No.3)、(SEQ ID No.4)和(SEQ IDNo.5),和分离的突变atpE蛋白的编码核酸序列,选自(SEQ IDNo.6)、(SEQ ID No.7)、(SEQ ID No.8)、(SEQ ID No.9)和(SEQ IDNo.10),以及包含瞬时表达核酸的载体。在一个具体实施方案中突变atpE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2,而其编码核酸序列由SEQID No.7组成。
本发明还提供了宿主-载体系统,其中包括具有瞬时表达载体的细胞。
本发明也提供了包含突变atpE蛋白的分离的细胞,其中所述蛋白使得这些细胞具有抗微生物药的抗性。
本发明也提供了鉴别抗微生物化合物的方法,其步骤包括(a)在生理条件下使试验化合物与表达atpE蛋白的细胞相接触;(b)确定此试验化合物是否与该atpE蛋白相互作用。
本发明也提供了评价试验化合物与atpE蛋白相互作用潜力的方法,其步骤包括(a)使用分子建模(molecular modeling)技术来建立atpE蛋白的三维结构;(b)使用计算方法在试验化合物和atpE蛋白三维结构间进行契合操作;和(c)分析契合操作结果,以量化试验化合物和atpE蛋白三维结构间的联系。
本发明也致力于提供ATP酶的F0部分的结合位点,其中至少包含一个C亚基的Ala24、Gly27、Phe53、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64和Phe65;一个A亚基的Ser182、Leu183、Ser184、Leu185和Arg186,并且所述氨基酸都具有表3、4或5中任一个所列的原子坐标。
本发明的另一目标,是提供使用前述结合结构域的,用以鉴别可与ATP酶的F0部分相互作用的化合物以及鉴别它们作为抗微生物化合物潜力的方法,特别是使用前述结合结构域来鉴别抗分枝杆菌化合物。
因此本发明的另一目的是提供治疗微生物感染者的方法,该法包括给予感染者可与ATP酶的F0部分相互作用的化合物,尤其是与atpE蛋白中赋予其抗性的突变位点或与本发明的结合位点相互作用的化合物。本发明还提供了治疗患有结核的患者方法,包括给予患者通过上述任何筛选方法得到的可与atpE蛋白相互作用的药物。这种治疗方法使用可与ATP酶的F0部分相互作用,特别是与atpE蛋白相互作用的化合物,但是,先前已知的可与ATP酶的F0部分相互作用,特别是与atpE蛋白相互作用的化合物要排除在外。特别是要排除按照任何公开治疗方法使用DARQ J(11)化合物。
本发明也提供了药用组合物,其中包括可在细胞中与atpE蛋白相互作用的药物,和药学可接受的载体。最后,本发明提供了产品,包括包装和药物,其中(a)药物可在细胞中与atpE蛋白相互作用,(b)包装包括指导如何使用该药物治疗细菌感染者的标签。在本发明的一个具体实施方案中,描述了如何使用DARQ J来制备抗微生物药物。
下文中将对本发明的各个方面进行更加详细的说明。
附图简述表1.先导DARQ化合物(J)的最小抑制浓度(MIC),此浓度的J化合物将不同分枝杆菌的生长抑制90%。如果没有特别指出,试验菌株数的n=1。
表2.DARQ J化合物的结合位点周围的氨基酸。
表3.结核分枝杆菌(M.tuberculosis)野生型和DARQ J抗性突变株中DARQ J化合物的结合位点周围氨基酸的原子坐标。
表4.野生型结核分枝杆菌中DARQ J化合物的结合位点的原子坐标。
表5.突变型结核分枝杆菌中DARQ J化合物的结合位点的原子坐标。
表6.结核分枝杆菌突变atpE蛋白(SEQ ID No.2)的原子坐标。
表7.结核分枝杆菌野生型atpE蛋白(SEQ ID No.1)的原子坐标。


图1.R207910,这里也指J或DARQ J的绝对构型。
图2.结核分枝杆菌和突变耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)atpE蛋白的序列比对。Mtb_S结核分枝杆菌H37Rv的药物敏感株,atpE(1-81)。收录号(Accession number)Swiss-ProtQ10598(SEQ ID No.1)。Mtb_R结核分枝杆菌BK12的耐药株,atpE(1-81)(SEQ ID No.2)。Msm_S耻垢分枝杆菌的药物敏感株,atpE(1-86)。从Institute for GenomeResearch得到的序列(SEQ ID No.3)。Msm_R09(SEQ IDNo.4)和R10(SEQ ID No.5)耻垢分枝杆菌的耐药株,atpE(1-86)。内部得到的序列,人人(Homo sapiens),ATP5G3(66-142)。收录号Ensembl ENSP00000284727。顶端序号结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌atpE。底端序号人ATP5G3(66-142)。阴影部分表示使用BLOSUM62矩阵得到的氨基酸相似度(黑色=高度相似;灰色=中度相似)。箭头表示在抗性突变株中发现的点突变位置。
图3.在DARQ J、异烟肼和DCCD存在时结核分枝杆菌中总细胞ATP测量结果。在结核分枝杆菌野生型和DARQ J抗性突变株内,波长526nm处测得的氧化萤光素的相对发光单位(Relative Luminescence Units)。
图4.三个C亚基(A链、K链和L链)和A亚基(M链)的带状结构表示,这些亚基共同形成DARQ J化合物的结合位点。
发明详述定义如果没有另外加以明确说明,本申请中使用的下列术语的含义均在下文列出。
“atpE蛋白”指ATP酶复合体F0亚基的C链(由SwissProt entryQ10598,结核分枝杆菌代表),或者是与所述结核分枝杆菌序列具有至少70、80、90、95或99%序列同一性的蛋白。
“F1F0ATP酶”又称为ATP酶、ATP合酶或F1F0ATP酶,其是指催化ATP合成或水解的多亚基大复合体。F1F0ATP酶由两个结构域组成F1部分,它位于膜的外部并含有催化位点;F0部分,它跨越双层膜并含有质子孔(proton pore)。在细菌原生质膜、叶绿体内囊体膜和线粒体内膜上都发现了ATP酶,ATP酶使用质子电化学梯度来驱动ATP的合成。
“给药”指以某种方式递药,可通过本领域技术人员已知的各种方法中任何一种和递药系统来进行。可通过如局部给药、静脉内给药、心包内给药、口服给药、移植给药、透粘膜给药、透皮给药、肌内给药、皮下给药、胸(膜)腔内给药、鞘内给药、淋巴管内给药、皮损内注射或者硬膜外给药进行。也可进行如一次、多次给药,和/或在一个或多个较长时期内进行给药。
“宿主细胞”包括(但不仅限于)细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。可通过本领域熟知的磷酸钙沉淀法、电穿孔法和微注射法等方法来转染细菌细胞。
“分离的”atpE蛋白指包含atpE蛋白的膜片段制备物,或者其它合适的制备物,其中atpE蛋白保留了其天然功能并且不含有一些/所有其天然环境中的其它蛋白。这意味着包括含F0F1ATP酶的F0部分的膜制备物,特别是含有本发明的突变atpE蛋白的F0部分的膜制备物。
“细菌细胞”指任何细菌细胞。细菌细胞包括(但不仅限于)正常、不正常和转化的细胞,例如分枝杆菌,特别是结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌、棒状杆菌、诺卡氏菌、革兰氏阳性菌例如链球菌、葡萄球菌和肠球菌,革兰氏阴性菌例如大肠杆菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。
“核酸”和“多核苷酸”在本文中含义相同,都指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物。脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸可以指天然产物或合成的类似物。
当提及给定细胞的“生理条件”时,通常指细胞所处的生化环境。细胞的生化环境包括(但不仅限于)细胞通常面对的所有/一些蛋白酶。这种条件包括(但不仅限于)体内条件。
“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中含义相同,都指氨基酸残基的聚合物。氨基酸残基可是天然产物或者是其化学类似物。多肽、肽和蛋白也包括修饰后产物,例如糖基化、连接上脂质、硫酸化、羟基化和ADP-核糖基化。
“受试者”又称为“感染者”或“患者”,包括任何动物,例如哺乳动物或鸟类,包括(但不仅限于)牛、马、绵羊、山羊、猪、狗、猫、啮齿类如小鼠或大鼠、火鸡、小鸡和灵长类。在优选的实施方案中受试者指人。
“治疗”包括(但不仅限于)将受试者的疾病加以消除、使疾病过程逆转、延缓疾病发展、减轻病痛,或者其它改善。
“载体”指本领域已知的任何核酸载体。这种载体包括(但不仅限于)质粒载体、粘粒载体和噬菌体载体。
“候选物”和“试验化合物”在本文中含义相同,都指相信可作为生物反应修饰剂而与其它基团(即atpE蛋白)相互作用的物质。例如相信代表性候选物可与atpE蛋白相互作用,并可修饰ATP酶活性。可使用本发明的方法进行研究的候选物包括如(但不仅限于)肽、酶、酶底物、辅因子、糖、寡核苷酸、小分子量化合物和单抗。
“调节”指将野生atpE蛋白或突变atpE蛋白的任一或所有化学和生物学活性/特性,加以提高、降低,或进行其它改变。
“相互作用”指分子间可检测性的互相作用,包括分子间的“结合”相互作用。相互作用可以是如天然发生的蛋白-蛋白间或者蛋白-核酸间相互作用。可以使用本领域已知方法来检测这些相互作用,如使用酵母双杂交系统、免疫沉淀反应、闪烁亲近分析法、或滤器结合检测。
这里所用的“原子坐标”或“结构坐标”指描述原子在Protein DataBank(PDB)格式(format)中位置的数学坐标,包括每个原子的X、Y、Z和B坐标。本领域技术人员应理解,由X射线结晶学确定的一组结构坐标并不是没有标准偏差的。在本发明中,任何来源的一组ATP合酶结构坐标,当叠加在相应于表3、4、5、6或7所列原子坐标的非氢原子位置上时,其非氢原子位置的均方根偏差小于1.5,即认为它们均有实质同一性或同源性。在更优选的实施方案中,任何来源的ATP合酶的任何组的结构坐标,当叠加在相应于表3、4、5、6或7所列原子坐标的非氢原子位置上时,其非氢原子位置的均方根偏差小于0.75,即认为它们均有实质同一性或同源性。
发明的实施方案突变atpE蛋白本发明提供了分离的突变atpE蛋白,具体来说是细菌atpE蛋白,再具体来说是分枝杆菌atpE蛋白,更具体来说是结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌atpE蛋白。突变选自单点突变、插入或删除。在本发明的一个实施方案中,所述突变包括在20-40位氨基酸特别是30-40位氨基酸之中任意位置(优选在34位氨基酸)引入至少一个点突变,或者在60-75位氨基酸特别是62-73位氨基酸之中任意位置(优选在69位氨基酸)引入至少一个点突变,如图2中的序列比对所示。在另一实施方案中,分离的突变atpE蛋白选自Mtb_R(SEQ ID No.2)、Msm_R09(SEQ ID No.4)和Msm_R10(SEQ ID No.5),如图2所示,或者是与上述的任何氨基酸序列具有至少70、80、90、95、97或98%的序列同一性的蛋白。
本发明还提供了分离的编码所述突变atpE蛋白的核酸。在一个实施方案中,所述核酸序列包含所有编码F0部分的基因(参见如J.Biol.Chem,1994,Vol.269(10),p.7285-7289),其中所述基因转录自一个单启动子,并包含编码本发明突变atpE蛋白的核酸序列。核酸可以是DNA或RNA,优选为DNA,在另一实施方案中核酸选自编码Mtb_R(SEQ ID No.7)、Msm_R09(SEQ ID No.9)或Msm_R10(SEQ IDNo.10)的核酸序列,或者是与上述任何核酸序列具有至少70、80、90、95、97或98%的序列同一性的核酸序列。
可使用商品化计算程序来计算核酸和多肽序列的同一性百分比,这些工具将查询序列与参考序列进行比较。可使用以下程序(由National Center for Biotechnology Information提供)来确定同源性/同一性BLAST、gapped BLAST、BLASTN和PSI-BLAST(均可使用默认参数)。
algorithm GAP算法(Genetics Computer Group,Madison,WI)使用Needleman和Wunsch algorithm比较两个完整序列,它们可使契合数达到最大并使缺口数(gap)为最小。一般使用默认参数,gap扣分(gap creation penalty)=12,gap延伸扣分(gap extension penalty)=4。
FASTDB软件基于Brutlag等人报道的算法(Comp.App.Biosci.,6;237-245(1990)),是另一种确定一个核酸序列(或其部分)与查询序列间最佳整体契合度的方法。该软件能够对序列进行全面比对。全面比对的结果在同一性百分比中。使用FASTDB搜索DNA以计算同一性百分比时合适的参数为Matrix=Unitary,k-tuple=4,Mismatchpenalty=1,Joining Penalty=30,Randomization Group Length=0,CutoffScore=1,Gap Penalty=5,Gap Size Penalty=0.05,Window Size=500或者等于查询序列的碱基长度(二者之中较短者)。计算氨基酸序列同一性百分比和相似度时合适的参数为Matrix=PAM 150,k-tuple=2,Mismatch Penalty=1,Joining Penalty=20,Randomization GroupLength=0,Cutoff Score=1,Gap Penalty=5,Gap Size Penalty=0.05,Window Size=500或者等于查询序列的碱基长度(二者之中较短者)。
本发明还提供了包含瞬时核酸的载体。在一个实施方案中载体是质粒载体。
本发明也提供了宿主-载体系统,包括具有瞬时质粒载体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞,在一个实施方案中宿主细胞是细菌细胞,特别是分枝杆菌细胞例如结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌。
本发明也提供了包含突变atpE蛋白的分离细胞,该蛋白在细胞中引起抗微生物药的抗性。在一个实施方案中,这种分离细胞是转化有突变分枝杆菌atpE蛋白的耻垢分枝杆菌细胞,该突变蛋白特别是指在20-40位氨基酸特别是30-40位氨基酸之中任意位置(优选在34位氨基酸)引入至少一个点突变,或者在60-75位氨基酸特别是62-73位氨基酸之中任意位置(优选在69位氨基酸)引入至少一个点突变的突变蛋白,如图2中序列比对所示。
筛选方法本发明也提供了鉴别抗微生物化合物的方法,所述方法的步骤包括(a)在生理条件下使试验化合物与表达atpE蛋白的细胞相接触;(b)确定该试验化合物是否与atpE蛋白相互作用。
在一个实施方案中,上述方法中所用的atpE蛋白为细菌atpE蛋白(特别是分枝杆菌蛋白),包括上文所述的野生型蛋白和突变蛋白。在本发明的另一实施方案中,上述方法中所用的分枝杆菌atpE蛋白,是本发明的突变分枝杆菌atpE蛋白。在上述方法的一个特殊实施方案中,使用转化有本发明的突变atpE蛋白的宿主细胞,并且通过确定对F1Fo-ATP酶(包含所述突变atpE蛋白)酶活的可能抑制来测量该试验化合物与所述atpE蛋白间的相互作用。使用本领域已知方法来确定对F1Fo-ATP酶活性的抑制,例如向包含有ATP酶和作为底物的ATP的系统中添加该物质,并通过将ADP的生成与NADPH的氧化(经由丙酮酸激酶和乳酸氢化酶反应)相偶联来检测酶活。
在这种方法的一个实施方案中,可以在结合试验中使用atpE蛋白。结合试验可以是竞争性的或者是非竞争性的。这种试验可以对大量化合物进行快速筛选,来确定任何能够与多肽相结合的化合物。
这里本发明提供了用以鉴别试验化合物是否与本发明的分离atpE蛋白相结合的方法,从而鉴别潜在的抗微生物化合物,所述方法步骤包括a)使表达atpE蛋白的细胞,在存在或不存在已知能与该蛋白结合的化合物的情况下,与试验化合物相接触,其中所述细胞不正常表达所述atpE蛋白。
b)使用已知能与该atpE蛋白结合的化合物作为参考,来确定该试验化合物与atpE蛋白的结合。
使用本领域已知的研究蛋白-配体相互作用的方法,来测量试验化合物或已知能与atpE蛋白结合的化合物(下文中也指参考化合物)的结合作用。例如可使用标记的物质或参考化合物来测量这种结合作用。可使用本领域已知的任何便利方法来对试验化合物或参考化合物,特别是化合物J(图1)进行标记,例如放射性标记、荧光标记或酶标记。在上述方法的一个具体实施方案中,对已知能与atpE蛋白结合的化合物(也即参考化合物)进行可检测性标记,并且使用所述标记确定试验化合物与atpE蛋白的结合。使用放射性标记、荧光标记或酶标记,更优选使用放射性标记对所述参考化合物进行标记,在本发明的另一可选实施方案中,上述结合实验在细胞组合物上进行,即在含有上文所定义atpE蛋白的细胞提取物中,细胞碎片或细胞器中进行。更具体来说,上述结合试验在细胞组合物中进行,即在含有上文所定义atpE蛋白片段的膜制备物中进行,其中所述的细胞组合物(即膜制备物)由耻垢分枝杆菌细胞获得,而该细胞转化有突变分枝杆菌atpE蛋白,这种突变蛋白特别是指在20-40位氨基酸特别是30-40位氨基酸之中任意位置(优选在34位氨基酸)引入至少一个点突变,或者在60-75位氨基酸特别是62-73位氨基酸之中任意位置(优选在69位氨基酸)引入至少一个点突变的突变蛋白,如图2中序列比对所示。以Mtb_S(SEQ ID No.1)或Mtb_R(SEQ ID No.2)的序号作为参照,上述区域相应于14-34位氨基酸,特别是24-34位氨基酸,优选相应于28位氨基酸,或者相应于54-69位氨基酸,特别是56-67位氨基酸,优选为63位氨基酸。
在的一个实施方案中,结合实验使用膜制备物进行。可在传统滤器-结合实验(如使用Brandel过滤实验装置)或者高通量闪烁亲近分析法(SPA and Cytostar-T flashplate technology;Amersham PharmaciaBiotech)中使用这些膜制备物,来检测具有放射性标记的atpE配体(包括3H标记的DARQs)的结合作用,和结合位点竞争物对这些放射性标记的替换。可使用Packard Topcount或能够对96-、384-、1536-微滴定板进行快速测量的类似装置来测量放射性。SPA/Cytostar-T技术尤其适用于高通量筛选,因此该技术适合用于对能够替换标准配体的化合物进行筛选。
其它在近似自然条件下研究配体与atpE结合作用的方法,利用了Biacore(Biacore)装置开发的表面胞质团共振效应。膜制备物中或整个细胞中的atpE蛋白可被连接到Biacore的生物传感器芯片上,在存在和不存在化合物的情况下检测配体的结合作用,来鉴别结合位点的竞争物。
分子建模本发明还提供了评价试验化合物与atpE蛋白发生相互作用潜力的方法,步骤包括(a)使用分子建模技术来阐明atpE蛋白的三维结构;(b)使用计算机方法在试验化合物和atpE蛋白的三维结构间进行契合操作;(c)分析所述契合操作的结果,以量化试验化合物和atpE蛋白三维结构间的联系。
本领域已知的分子建模技术,包括硬件和软件都适于创建受体模型和酶的构象,并加以利用。
有许多可用的计算机程序都适合于进行计算机建模、模型建立操作,以及对本文所述方法中与化合物相互作用的atpE进行鉴别、选择和测量操作。这些程序包括如,GRID(来自Oxford University,UK),MCSS(来自Accelrys,Inc.,San Diego,CA),AUTODOCK来自Oxford Molecular Group),FLEX X(来自Tripos,St.Louis.MO),DOCK(来自University of California,San Francisco,CA),CAVEAT(来自University of California,Berkeley),HOOK(来自Accelrys,Inc.,San Diego,CA),以及3D数据库系统如MACCS-3D(来自MDLInformation Systems,San Leandro,CA),UNITY(来自Tripos,St.Louis.MO)和CATALYST(来自Accelrys,Inc.,San Diego,CA)。也可使用软件包如LUDI(来自Biosym Technologies,San Diego,CA),LEGEND(来自Accelrys,Inc,San Diego,CA)和LEAPFROG(来自Tripos,St.Louis.MO)Potential来在计算机中从头(“de novo”)设计潜在候选物。可使用程序如GAUSSIAN 92,AMBER,QUANTA/CHARMM和INSIGHT II/DISCOVER来分析化合物的变形能(deformation energy)和静电排斥力。可在任何合适的硬件上进行这些计算机测量和建模操作,如Silicon Graphics,Sun Microsystems工作站等。这些建模技术、方法、硬件和软件包都只是代表,不仅限于所列举的这些。也可依照本发明使用本领域已知的其它建模技术,参见如N.C.Cohen,Molecular Modeling in Drug Design,AcademicPress(1996)。
在本发明的一个实施方案中,atpE蛋白的三维结构,用Ile28、Glu61和Ile63的原子坐标(E.coli(Protein Database 1Q01))+/-所述氨基酸骨架原子的均方根偏差(不超过10,优选不超过5)得到。
如下文例子所述,本发明的目的之一是提供atpE蛋白的三维结构。表6和7提供了突变atpE蛋白(SEQ ID No.2)和野生型atpE蛋白(SEQ ID No.1)的原子坐标。因此在一个实施方案中,使用表6或7的原子坐标得到atpE蛋白的三维结构。在特别的实施方案中,使用表7的原子坐标得到atpE蛋白的三维结构。DARQ J化合物抑制A亚基的Arg186与C亚基的去质子形式的Glu61之间的相互作用。因此本发明的目的之一是提供使用表6或7中的原子坐标来评价试验化合物与atpE蛋白发生相互作用潜力的方法。
结合位点在本发明的另一实施方案中鉴定了ATP酶的F0部分。结合位点是被鉴别为能够与DARQ J化合物结合的位点,发现它与上文中鉴别的结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的atpE蛋白(17)中抗性赋予突变位点区域一致。因此本发明提供了ATP酶的F0部分中的结合位点,其特性为包含atpE蛋白中的抗性赋予突变位点。这里所用的抗性赋予突变位点指atpE蛋白的14-34位氨基酸,特别是24-34位氨基酸,以及53-69位氨基酸,特别是56-67位氨基酸,这里使用Mtb_S(SEQ ID No.1)或Mtb_R(SEQ ID No.2)的序号作为参照。
在另一实施方案中,结合位点至少包含一个C亚基的氨基酸Ala24、Gly27、Phe53、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64和Phe65,以及一个A亚基的氨基酸Ser182、Leu183、Leu185和Arg186(A亚基为,表3、4、5中的Ser 206-Leu 207-Leu 209和Arg 210),这里所述氨基酸具有表3、4、5中任一个所列原子坐标,或者具有同源结构坐标,其中同源结构坐标叠加在相应于表3、4或5所列原子坐标的非氢原子位置上时,其非氢原子的均方根偏差小于1.5,优选小于0.75。在特别实施方案中,结合位点包含第一C亚基的氨基酸Ala21、Gly25;第二C亚基的氨基酸Ala24、Gly27、Phe53、Phe54、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64、Phe65;第三C亚基的氨基酸Met17、Gly19、Gly20、Ala21、Ile22、Gly23、Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64和Phe65;以及一个A亚基的氨基酸Leu183、Leu185和Arg186,其中所述氨基酸具有表3、4、5中任一个所列原子坐标,或者具有同源结构坐标,其中同源结构坐标叠加在相应于表3、4或5所列原子坐标的非氢原子位置上时,其非氢原子的均方根偏差小于1.5,优选小于0.75。在更特别的实施方案中,结合位点组成为第一C亚基的Ala21、Gly25;第二C亚基的Ala24、Gly27、Phe53、Phe54、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64、Phe65;第三C亚基的Met17、Gly19、Gly20、Ala21、Ile22、Gly23、Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64、Phe65以及一个A亚基的Leu183、Leu185和Arg186,其中所述氨基酸具有表3、4、5中任一个所列原子坐标。在最特别的实施方案中,结合位点组成为第一C亚基的Ala21、Gly25;第二C亚基的Ala24、Gly27、Phe53、Phe54、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64、Phe65;第三C亚基的Met17、Gly19、Gly20、Ala21、Ile22、Gly23、Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64、Phe65以及一个A亚基的Leu183、Leu185和Arg186,这里所述氨基酸具有表3所列原子坐标。
因此本发明的目的之一,是在计算机筛选程序中使用上述原子坐标来评价试验化合物与atpE蛋白发生相互作用的潜力。在一个实施方案中,本发明提供了评价试验化合物与atpE蛋白发生相互作用潜力的方法,包括使用分子建模技术产生ATP酶F0部分结合位点的三维结构;使用计算机方法在试验化合物和结合位点三维结构之间进行契合操作;分析所述契合操作结果,以量化试验化合物与结合位点三维结构间的相互联系。在本发明的另一实施方案中,结合位点的三维结构用表3、4或5所列原子坐标产生,或者用同源结构坐标产生,其中同源结构叠加在相应于表3、4或5所列原子坐标的非氢原子位置上时,其非氢原子的均方根偏差小于1.5,优选小于0.75。在特别的实施方案中,三维结构从以下原子坐标得到,表3、4或5中任一个的A链的Ala21、Gly25;表3、4或5中任一个的K链的Ala24、Gly27、Phe53、Phe54、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64、Phe65;表3、4或5中任一个的L链的Met17、Gly19、Gly20、Ala21、Ile22、Gly23、Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64、Phe65;表3、4或5中任一个的M链的Ser206、Leu207、Leu207和Arg210。
在这种筛选方法中,或者通过形状互补性,或者通过估计的相互作用能来判断这些化合物与结合位点的契合度(Meng,E.C.et al.,J.Coma.Chem 13505-524(1992))。
结合位点的应用在设计结合到本发明的atpE蛋白并增强或抑制其活性的化合物时,通常考虑两个因素。第一,该化合物必须能够与atpE蛋白发生物理的、结构上的结合。在atpE蛋白和该化合物间的相互联系中,非共价分子相互作用起重要作用,包括氢键、范德华力和疏水相互作用。第二,该化合物必须能够呈现出可允许它与atpE发生联系的构象。尽管该化合物的某些部分不直接参与它与atpE的相互联系,但这些部分仍可能会影响分子的整体构象,从而对结合亲和力、疗效、药物样(drug-like)性质和药效产生显著影响。对构象的要求包括化学实体或化合物的整体三维构象和方向,这些化学实体或化合物涉及到全部或部分的atpE活性位点,或者其它区域,或者涉及到(含有多个直接与atpE作用的化学实体的)化合物中功能基团的间距。
在实际合成配体或其它化合物对并其进行测试之前,可以先使用计算机建模技术对配体或其它化合物对atpE的潜在的、预测的、抑制性的激动剂、拮抗剂或结合作用进行分析。如果给定化合物理论结构不足以使其与atpE发生联系并产生相互作用,那么就可以不合成并测试该化合物。但是如果计算机建模说明化合物对atpE具有强烈的作用,那么该分子即可以被合成并测试它与atpE发生相互作用的能力。如此即可避免合成不起作用的化合物。在某些情况下,通过建模预测其失活化合物,合成并对其进行测试,以研究与atpE特定区域发生相互作用的化合物的SAP(结构-活性关系)。
本领域技术人员可从多种方法选取一种来对化学实体片段、化合物或药物进行筛选,筛选依据它们与atpE的发生联系的能力,特别是依据它们与atpE的单个结合口袋(pocket)或活性位点发生联系的能力来进行。使用这种方法时,可以首先根据atpE或atpE-配体复合体的原子坐标,在计算机上对如活性位点等进行目测(visual)。然后可将选出的化学实体、化合物或药物以多个不同方向进行放置,或者将它们装(dock)在atpE的一个单独结合口袋内。可使用Quanta和Sybyl等软件来进行装入操作,然后使用标准分子力场(mechanicsforcefields)软件如CHARMM和AMBER使分子能量最小化,并进行分子动力学分析。
可使用专门的计算机程序来辅助选择化学实体。这包括(但不仅限于)GRID(Goodford,P.J.,“一种确定重要生物大分子的能量有利的结合位点的方法”,″A Computational Procedure for DeterminingEnergetically Favorable Binding Sites on Biologically ImportantMacromolecules,″J.Med.Chem.28849-857(1985),来自OxfordUniversity,Oxford,UK);MCSS(Miranker,A.and M.Karplus,“结合位点的功能图一种同时多拷贝搜索方法”″Functionality Maps ofBinding SitesA Multiple Copy Simultaneous Search Method.″ProteinsStructure,Function and Genetics 1129-34(1991),来自MolecularSimulations,Burlington,Mass.);AUTODOCK(Goodsell,D.S.and A.J.Olsen,“通过模拟退火来进行底物道蛋白的自动停泊”″AutomatedDocking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing″ProteinsStructure.Function,and Genetics 8195-202(1990),来自ScrippsResearch Institute,La Jolla,Calif.);DOCK(Kuntz,I.D.et al.,“分析大分子-配体相互作用的基因组方法”″A Geometric Approach toMacromolecule-Ligand Interactions,″J.-Mol.Biol.161269-288(1982),来自University of California,San Francisco,Calif.)可以使用软件来分析表面位点以确定相似的抑制蛋白或化合物的结构,如GRID软件,它可以确定探针与不同特性功能基团以及与大分子表面间可能存在的作用位点。用分子上合适的抑制基团(如质子化的伯胺(protonated primary amine))作为探针,可使用GRID工具在合适的能量等高线(energy contour)水平上鉴别可接近位点周围的潜在热点。可使用DOCK程序来分析活性位点或配体结合位点,并找出具有互补空间特性的配体。
一旦选定化学实体、化合物或药物,可以将它们组装成单独配体、化合物、抑制剂或活化剂。可通过在三维图像上对片段间的相互关系进行目测来进行组装。然后使用如Quanta或Sybyl等软件进行人工建模。
可有助于将单独化学实体、化合物或药物进行连接的计算机软件程序包括(但不仅限于)CAVEAT(Bartlett,P.A.et al.,“CAVEAT一种生物活性分子的结构-起源设计工具”″CAVEATA Program toFacilitate the Structure-Derived Design of Biologically ActiveMolecules.″In Molecular Recognition in Chemical and BiologicalProblems,Special Pub.,Royal Chem.Soc.,78,pp.82-196(1989));3D数据库系统如MACCS-3D(MDL Information Systems,San Leandro,Calif.and Martin,Y.C.,“药物设计中的3D数据库”″3D DatabaseSearching in Drug Design″,J.Med.Chem.352145-2154(1992);HOOK(来自Molecular Simulations,Burlington,Mass.)。
有若干种方法可用来搜索三维数据库测试药效团假设并为下一步筛选选出化合物。这些方法包括CAVEAT软件(Bacon et al.,J.Mol.Biol.225849-858(1992))。例如,CAVEAT使用环状化合物数据库,这些化合物可以作为间隔基团(″spacers″)将任何数目的已经定位在活性位点的化学片段连接起来。该软件使得本领域技术人员可以很快得到几百种可能的方法,来将已知的(或怀疑是)紧密连接所必需的片段连接起来。不是逐步构建atpE的抑制活化剂、激动剂或拮抗剂,如上文所述一次构建出一个化学实体,而是可使用空活性位点或已知分子的任意部分来整体设计或从头设计这些化合物。这些方法包括LUDI(Bohm,H.-J.,LUDI软件一种新型从头设计酶抑制剂的方法,″The Computer Program LUDIA New Method for the De NovoDesign of Enzyme Inhibitors″,J.ComR.Aid.Molec.Design,6,pp.61-78(1992),Biosym Technologies,San Diego,Calif.);LEGEND(Nishibata,Y.and A.Itai,Tetrahedron 478985(1991),MolecularSimulations,Burlington,Mass.)和LeapFrog(Tripos Associates,St.Louis,Mo.)。
例如,LUDI软件可以确定出一系列相互作用位点,以将氢键和疏水片段放置进去。然后LUDI使用接头文库将最多四个不同相互作用位点连接起来形成一个片段。接着更小的“桥”(bridging)分子例如--CH2-和--COO-被用来将这些片段连接起来。例如就DHFR酶而言,LUDI复制了其公认抑制剂氨甲喋呤内的关键功能基团的放置情况。也参见Rotstein and Murcko,J.Med.Chem.361700-1710(1992)。
依据本发明也可使用其它分子建模技术。参见如Cohen,N.C.etal.,“药物化学的分子建模软件和方法”″Molecular Modeling Softwareand Methods for Medicinal Chemistry,J.Med.Chem.33883-894(1990);Navia,M.A.and M.A.Murcko,“药物设计中结构信息的运用”″The Use of Structural Information in Drug Design,″CurrentOpinions in Structural Biology,2,pp.202-210(1992)。
一旦通过上述方法设计并选定某化合物,即可通过计算机方法和/或合成化合物后测试生物活性,来测试该化合物与atpE发生结合或联系的亲和力并加以优化。抑制剂或化合物可能会与一种以上整体结合能相似的atpE构象发生相互作用。在这些情况下,结合带来的变形能就是自由化合物能量与化合物结合到atpE时所观察到构象的平均能量之间的差异。
设计或选定的用以与atpE结合或发生联系的化合物可被进一步通过计算机方法进行优化,以使其结合态中其与atpE相互之间优选没有静电排斥力。这种非互补(如静电力)相互作用包括排斥性电荷-电荷、偶极(dipole)-偶极和电荷-偶极相互作用。具体来说,当抑制剂结合后,抑制剂与atpE之间的所有静电相互作用的总和优选对结合焓起抵消或有利的作用。通过这些方法也设计出弱结合化合物以确定SAR,参见如U.S.Appl.Nos.60/275,629;60/331,235;60/379,617;and,10/097,249。
本领域中已有明确的计算机软件来评价化合物的变形能和静电相互作用。为这种应用设计的软件如,Gaussian 92,C版本(M.J.Frisch,Gaussian,Inc.,Pittsburgh,Pa.,COPYRGT 1992);AMBER,4.0版本(P.A.Kollman,University of California at San Francisco,COPYRGT 1994);QUANTA/CHARMM(Molecular Simulations,Inc.,Burlington,Mass.COPYRGT 1994);Insight II/Discover(BiosysmTechnologies Inc.,San Diego,Calif.COPYRGT 1994)。本领域技术人员也知道其它的硬件系统和软件包。
一旦按上述方法优化选定或设计出与atpE联系的化合物,即可对其一些原子或侧链基团进行替换以改善或调节其结合特性。通常一开始替换为保守性替换,即新的基团具有与原基团相似的大小、形状、疏水性和电荷。当然,应避免使用本领域中已知会改变构象的组分。然后同样使用上文详述的计算机方法,对这些经化学替换的化合物与atpE的契合有效性进行分析。
本发明也提供了系统尤其是计算机系统,其中包含了本文所述的序列和/或结构坐标。设计这些系统的目的是为atpE或ATP酶F0部分中的结合位点确定结构和合理的药物设计。计算机系统是指上文所述的任何计算机方法中,用于分析本发明的序列和/或结构坐标的硬件、软件和数据库。本发明中基于计算机的系统中的硬件至少应包括CPU、输出装置、输入装置和数据存储装置。技术人员可很容易的认识到目前的商品计算机系统适于应用在本发明中。
因此本发明的目的之一是提供计算机可读的数据存储装置,其中包含本文所述结构坐标。这里所用的“计算机可读的数据存储装置”指任何可被计算机读取或直接存取的装置。这种装置包括(但不仅限于)磁存储装置如软盘、硬盘和磁带;光存储装置如光盘CD-ROM;电存储装置如RAM和ROM;以及这些装置的综合如磁/光存储装置。
治疗方法如上文所述,提供使用从上述任意筛选方法得到的化合物来治疗微生物感染受试者的治疗方法也是本发明的目的之一。总体上细菌病原体被分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。同时具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的抗微生物化合物通常被认为具有广谱抗菌活性。本发明的化合物具有抗革兰氏阳性菌活性和/或抗革兰氏阴性菌活性。特别的,本发明的化合物至少可抵抗一种革兰氏阳性菌,优选可抵抗若干种革兰氏阳性菌,更优选可抵抗一种或多种革兰氏阳性菌和/或一种或多种革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性和革兰氏阴性需氧菌和厌氧菌包括葡萄球菌如金黄色葡萄球菌(S.aureus);肠球菌如粪肠球菌(E.faecalis);链球菌如肺炎链球菌(S.pneumoniae)、变异链球菌(S.mutans)、产脓链球菌(S.pyogens);杆菌例如芽孢杆菌(Bacillus subtilis);李斯特氏菌如单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes);嗜血杆菌如流感嗜血杆菌(H.influenza);莫拉氏菌如卡他莫拉菌(M.catarrhalis);假单胞菌如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和埃希氏菌如大肠杆菌(E.coli)。
革兰氏阳性病原菌如葡萄球菌、肠球菌和链球菌特别重要,因为这些种类的抗性菌株一旦建立,就很难治疗也很难根除(如从医院环境中根除)。这种菌株的实例有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS),青霉素耐药肺炎链球菌和多耐药性粪肠球菌。
本发明化合物也显示出对耐药菌株的活性。
本发明的化合物对那些生存依赖于F1F0ATP合酶正常功能的细菌尤其有效。与任何现有理论不同(Without being bound to anytheory),认为本发明化合物的活性依赖于对F1F0ATP合酶的抑制,具体是对F1F0ATP合酶F0复合体的抑制,更具体是对F1F0ATP合酶F0复合体中从A亚基Arg186到C亚基Glu61的质子转移的抑制,从而通过降低细菌细胞的ATP水平来杀死细菌。使用上述任何筛选方法鉴别出的化合物对革兰氏阳性菌特别有效,尤其是分枝杆菌,特别对由以下细菌引起的感染最为有效,非洲分枝杆菌(M.africanum)、鸟分枝杆菌(M.avium)、牛分枝杆菌(M.bovis)、牛分枝杆菌-BCG(M.bovis-BCG)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、偶然分枝杆菌(M.fortuitum)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、麻风杆菌(M.leprea)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)和偶发分枝杆菌(M.ranae)引起的感染。
在上文和下文中,化合物能够治疗细菌感染都指的是该化合物能够治疗由一种或更多菌株引起的感染。但是,当用DARQ J作为抗微生物化合物时,此处的“抗微生物”是指化合物能够治疗一种或更多菌株引起的感染,只要所述菌株不是分枝杆菌。
可用本发明的化合物治疗的感染包括如(但不仅限于)中枢神经系统感染、外耳感染、中耳感染例如急性分泌性中耳炎、硬脑膜窦(cranialsinuses)感染、眼部感染、口腔感染如牙齿、牙龈和粘膜感染、上呼吸道感染、下呼吸道感染、泌尿生殖器感染、胃肠感染、妇产科感染、败血病、骨骼与关节感染、皮肤与皮肤结构感染、细菌性心内膜炎、烧伤、手术后的感染预防和免疫抑制病人例如癌症化疗病人和器官移植病人的感染预防。
本发明也提供了治疗结核患者的方法,包括给予患者能够与atpE蛋白相互作用的药物。
药用组合物本发明也提供了药用组合物,包含能在细胞中与atpE蛋白相互作用的药物和药学上可接受的载体。
这种药物可被制成包含该药物和药学上可接受载体或稀释剂的组合物。该药物的形式可以为生理条件下的功能衍生物,例如酯或盐,如酸加成盐或碱金属盐,或者N或S氧化物。可根据任何合适的给药途径和方法制备组合物。药学上可接受的载体或稀释剂包括那些通过以下方式给药的制剂中使用的物质口服给药、直肠给药、鼻腔给药、吸入给药、局部给药(包括口腔和舌下)、阴道给药或非胃肠道给药(包括皮下、静脉内、肌肉内、皮内、鞘内、硬膜外)。当然,要依据目的给药途径来选择载体或稀释药,目的给药途径可依赖于药物及治疗目的。可方便的将制剂制成单位剂量的形式并可使用制药学领域熟知的任何方法来进行制备。这些方法的步骤包括将由一种或多种附加成分组成的载体和活性成分联系起来。一般来说,将活性成分与液体载体(或者是细碎的固体载体,或者同时使用两者)均匀并紧密的相联来制备制剂,然后如果必要就对产品进行定形。
对固体组合物来说,常用的无毒固体载体包括如药物级别的甘露醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、蔗糖、葡萄糖、碳酸镁等。可使用如聚亚烷基二醇、乙酰基甘油三酯等载体将上文定义的活性化合物制成栓剂。例如可将上文定义的活性化合物和任选的药学辅料溶解或分散在载体中(如水、葡聚糖生理盐水溶液、甘油、乙醇等)形成溶液或悬液,如此制备液体药用组合物。如果需要,待给予的药物组合物也可包含微小量的无毒辅助物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等,例如醋酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、油酸三乙醇胺等。本领域技术人员已知(或容易理解)制备这些剂型的实际方法,参见如Gennaroet al.,Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,18th Edition,1990。
任何情况下,待给予的组合物或制剂所含有的活性化合物的剂量,都足以有效减轻待治疗受试者的症状。
如本领域技术人员所熟知,确定本发明化合物的精确给药剂量和给药频率的依据是所用的具体化合物、具体的治疗病症、治疗病症的严重性(severity)、年龄、体重、性别、饮食、治疗时间和病人的总体生理条件、治疗模式,以及病人可能采用的其它药物治疗。另外,每天的有效剂量显然可根据治疗受试者的反应和/或开具本发明化合物处方的医生的评价来加以减少和增加。
可以制备的剂型或组合物中含有的活性成分量范围可以为0.25-95%,其余是无毒载体。根据给药模式,药用组合物中活性成分的含量优选为0.05-99%(重量),更优选为0.1-70%,同时药学上可接受的载体含量为1-99.95%,更优选为30-99.9%,所有百分比基数均为组合物总量。
可使用任何常用的赋形剂来制备用以通过口服给药的药学上可接受的无毒组合物,常用的赋形剂例如药物级别的甘露醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、化石、蔗糖、葡萄糖、碳酸镁等。这种组合物的剂型为溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等。这些组合物可含有1-95%的活性成分,优选含2-50%,最优选含5-8%。
非胃肠道给药的一般特征为通过注射给药,通过皮下、肌内或静脉内进行注射。注射剂可被制成常规形式,可以是溶液或混悬液形式、适于注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式,或者乳化液形式。合适的赋形剂包括如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等。另外如果需要待给药的药物组合物也可包含微小量的无毒辅助物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等,例如例如醋酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、油酸三乙醇胺等。
这些非胃肠道给药组合物中活性成分的含量高度依赖于活性成分的具体特性,化合物的活性和受试者的需要。不过溶液中活性成分适用含量为0.1%-10%,并且如果组合物为固体,随后要稀释到上述浓度的话,活性成分的含量可以更高。优选的,组合物溶液中含有0.2-2%的活性药物。
最后,本发明提供了产品,包括包装和药物,其中(a)药物在细胞中与atpE蛋白相互作用,并且(b)包装中含有说明如何使用该药物治疗细菌感染者的标签,特别是将该药物用作抗分枝杆菌药物。
所有本文中的“标准方法”、“标准方案”和“标准程序”,当在分子生物学技术背景下使用时,都指常规实验指南中的方案和程序,例如Current Protocols in Molecular Biology,editors F.Ausubel et al.,John Wiley and Sons,Inc.1994,or Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.,Molecular CloningA laboratory manual,2nd Ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY 1989。
参考下文的实验细节可更好的理解本发明,不过本领域技术人员显然会认识到这些实验细节仅用于阐述本发明,同时在下文权利要求书中将更全面的定义本发明。另外贯穿本文引用了多个出版物,这些出版物的公开内容通过引用结合到本文,以更全面的阐述本发明所属的技术内容。
实验描述使用耻垢分枝杆菌为替代物,我们发现了一系列具有体外抗几种分枝杆菌活性的DARQ(11)。目前,DARQ系列中有20种分子对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv的最小抑制浓度(MIC)小于0.5μg/ml,其中通过小鼠体内模型确认有三种分子具有抗分枝杆菌活性。
DARQ在结构上和机制上都与氟喹诺酮(包括甲氧基喹诺酮)显著不同,并且与其它喹啉类物质也不同,其中包括甲氟喹及其类似物,4-甲基喹啉和4-喹啉基腙(12-16)。DARQ与其它喹诺酮或喹啉类物质的一个主要的结构上的不同是DARQ类物质携带的功能侧链(3’)的特异性。另外,没有与现有化学物质的对分枝杆菌的交叉抗性,这说明了作用机制也不同。
DARQ的先导化合物,这里指J或者DARQ J(图1),我们发现它在体外具有独特的强效和选择性的抗分枝杆菌活性谱(表1)。它对实验室菌株H37Rv和六个完全敏感分离菌株的中值MIC为0.060μg/ml,而利福平为1.00μg/ml。J化合物在体外对耐一线与二线TB药的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)临床分离菌株也表现出相似的效果,所述一线TB药为利福平、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺,二线TB药为莫西沙星具有抗性。J化合物对八个具有异烟肼抗性的临床分离菌株的MIC为0.010μg/ml。J化合物没有与现用抗TB药物的交叉抗药性,这说明J可能保留有抗MDR-TB菌株的活性。事实上,使用BACTECTM培养系统,将MCR-TB菌株暴露在固定浓度的J化合物下,清楚地看见了对细菌生长的剂量依赖性抑制作用。在MDR-TB的30个分离菌株里,有13株(43%)对0.100μg/ml的J化合物敏感,另17株(57%)对0.010μg/ml的J化合物敏感。当使用BACTECTM系统进行测试时,在另外10株完全药物敏感的菌株中,只有一株表现出对J有类似的高敏感性(MIC小于0.010μg/ml),而所有菌株对0.100μg/ml的J化合物都具有敏感性。
其强效活性在其它分枝杆菌上也被证明,包括牛结核分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌,以及对许多抗TB药物具有天然抗性并参与机会感染的菌,例如鸟分枝杆菌复合体(MAC)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abcessus)、偶发分枝杆菌和海鱼分枝杆菌。
令人惊奇的是,J的活性表现出对分枝杆菌的特异性。J对分枝杆菌的近缘细菌种几乎没有活性,这些菌例如棒状杆菌(Corynebacterium)(MIC 4.00μg/ml)和诺卡氏菌(Nocardia)(MIC>4.00μg/ml),并且对其它生物没有活性,这包括革兰氏阳性菌肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌(包括甲氧西林抗性菌株)(MIC>32μg/ml)和粪肠球菌,以及革兰氏阴性菌大肠杆菌、流感嗜血杆菌和幽门螺杆菌。
将处于对数生长期的结核分枝杆菌用100 x MIC浓度的J化合物处理,12d后细菌计数结果减少3个数量级(103log reduction),这说明J在体外具有杀菌活性。J对静止期的结核杆菌的作用目前尚未研究。
突变株筛选,交叉抗药性和推定的药物靶点我们致力于通过考查分枝杆菌抗性,来鉴别出分子药物靶点并提出作用机制。在体外使用抑制浓度的J化合物选择出结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的抗性突变株,目的是
---确定分枝杆菌中抗性突变株的比例(以利福平作为对照)---评估抗性突变株的抗性模式(包括对喹诺酮类药的交叉/非交叉抗性)---考查作用机制筛选实验中,结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌中对J敏感性降低的突变株比例分别为,MIC x 4浓度下5×10-7和2×10-8,MIC x 8浓度下5×10-8和1×10-8(支持在线数据(supporting online text))。结核分枝杆菌中的突变株比例与那些对利福平具有抗性的突变株所占比例(10-7-10-8)相当,这说明几乎不存在对J的天然抗性。另外,对J具有抗性的结核分枝杆菌菌株对抗TB药物异烟肼、利福平、链霉素、阿米卡星、乙胺丁醇和莫西沙星的敏感性没有变化。对结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌中J敏感性降低的突变株的进一步研究表明,在DNA回旋酶的gyrA和gyrB区域中没有突变,在典型产生喹诺酮抗性的序列上也没有突变。这证明J化合物的分子靶点与氟喹诺酮的靶点不同。
一种确定J的分子靶点并推断作用机制的方法是,在结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的敏感和抗性菌株中,鉴别出抗性赋予突变并加以对比。对结核分枝杆菌抗性菌株BK12、两个耻垢分枝杆菌抗性菌株R09和R10,以及亲代耻垢分枝杆菌的基因组测序已接近完成。通过对结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的敏感和抗性菌株的基因组序列进行对比分析,我们鉴别出了抗性赋予突变(图2)。我们的结果表明,与相应亲代野生型相比,在所有三个独立突变株中都发挥作用的唯一基因编码atpE(ATP合酶F0亚基的一部分)。这提示突变株对J的抗性由atpE引起,说明J抑制了新的结核分枝杆菌靶点----ATP合酶的质子泵。
进行了互补研究以说明突变atpE引起对J的抗性,直接推断出atpE基因产物就是J对分枝杆菌的作用靶点。假设已知ATP合酶操纵子的所有基因都必须以协同方式表达,即所有编码F0部分的基因都必须从同一位置表达,我们就扩增了耻垢分枝杆菌抗性突变株(D32V)操纵子的F0部分,并通过PCR选择出没有额外突变的克隆。用含有如此选出的突变F0片段的质粒转化野生型耻垢分枝杆菌。所得细胞获得了对J的抗性,其MIC几乎与耻垢分枝杆菌抗性突变株R09(D32V)相同。另外,当从该转化体中重新分离出质粒并对atpE基因进行测序后,发现它具有保留的突变等位基因(D32V)。
使用Roche公司的ATP Bioluminescence Luciferase Assay Kit HSII试剂盒测量J对分枝杆菌中存在的总细胞ATP量的作用,进一步证实了DARQ J对结核分枝杆菌中ATP生成的影响。该实验的依据是,在526nm波长下可以测量由ATP驱动的从D-虫萤光素到氧化虫萤光素的转化情况。
简要来说,在野生结核分枝杆菌和突变株中检测了DARQ J对总ATP的作用。使用DCCD(已知它是ATP合酶的抑制剂)作为阳性对照,使用异烟肼(它抑制细胞壁某些成分的生物合成,但是对ATP生成没有作用)作为阴性对照。
如图3所示,使用DARQ J处理野生型结核分枝杆菌,在这些细菌中引起了剂量依赖性的ATP生产下降。与之对比,异烟肼则对ATP生成没有作用。如上文所述,将这些细菌暴露在高浓度的DARQJ下得到了具有二芳基喹啉抗性的结核分枝杆菌突变株。即使用100倍MIC浓度的J处理这些结核分枝杆菌突变株,它们的ATP生成也没有任何下降。与之对比,DCCD则能够阻遏这些突变株中ATP的生成,这提示DARQ J和DCCD在ATP合酶上具有不同的结合口袋。
DARQ J结合区域的计算机建模和鉴别为进一步探索DCCD和DARQ J的不同作用机制,分别建立了野生结核分枝杆菌和DARQ J抗性突变株的ATP合酶的计算机3D模型。通过建立公开氨基酸序列P63691和AJ865377的3D模型,对表4和表5中的原子坐标进行了计算。发现DARQ J的实际结合位点位于A亚基和C亚基的接触区域,更具体来说是在A亚基的“Arg210”和C亚基的“Glu 61”周围,如表3、4或5所示。这与上文中对结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的敏感和抗性突变株的抗性赋予突变筛选结果完全一致。
该模型的依据是对ATP酶结构中A-和C-螺旋的相对位置、氨基酸骨架和侧链方向进行最小内在应力计算优化的结果。从先前公开的不同生物的常规螺旋几何构型出发[E-Coli PDB entry code 1C17-V.K.Rastogi and M.E.Girvin,Nature,402,263-268(1999)],通过若干分子动力学模拟循环和分子力学弛豫方法得到了几何构型。使用根据MMFF94s[Halgren,T.A.(1996),J.Comput.Chem.,17,490-519]确定的力场参数(forcefield parameterization)也进行了分子动力学和弛豫几何分析。事实上可以使用任何分子动力学分析软件[Berendsen,H.J.C.,van der Spoel,D.and van Drunen,R.,Comp.Phys.Comm.91(1995),43-56;Lindahl,E.,Hess,B.and van der Spoel,D.,J.Mol.Mod.7(2001)306-317.],然后进行适当的几何优化[J.W.Ponder and F.M.Richards,J.Comput.Chem.,8,1016-1024(1987).]。
根据提出的抑制模式和生物试验中出现的抗性诱导突变位点,表3、4和5中的计算坐标包含进了部分的预测结构(半径30埃范围),该结构在这些酶中被认为与MTB ATP酶活性抑制有关的区域的结构。
讨论DARQ J是一类新型抗TB化学药物的一员,它具有与参考化合物相同或更低的MIC。其抗菌谱的独特之处在于,对分枝杆菌具有特异性,包括在人类致病菌中重要的非典型分枝杆菌;MAC,堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)和快速生长的偶发分枝杆菌及脓肿分枝杆菌(M.abscessus)。这种特异性抗分枝杆菌谱与异烟肼(它对MAC没有作用)不同。J化合物的临床用途将主要用于定向治疗TB和分枝杆菌感染。与具有广谱抗菌能力的抗生素相比,J不能抑制非分枝杆菌微生物的特性会产生更小的选择压力,也降低了其它种类细菌产生抗药性的风险(9)。
J化合物的靶点和作用机制与其它抗TB药物不同。不同细菌和真核生物ATP合酶序列间的对比,尤其是ATP酶复合体F0亚基C链序列的对比,以及野生型和突变型结核分枝杆菌的ATP合酶的3D模型,共同提供了J抗菌谱特异性的基本原理,也在较小程度上提供了安全性。
对建立的分枝杆菌ATP酶模型的动力学分析表明,这些结构中的A亚基和C亚基的接触区域上(在A亚基的“Arg 210”和C亚基的“Glu 61”周围)存在一个洞穴(根据表3的原子坐标,即为结合位点)。表4和表5提供了两个研究变异体中此位点周围的原子坐标,以及它们的平均位置。通过禁止这两个氨基酸相互作用,DARQ J抑制剂能够干扰涉及到这两个氨基酸的正常质子转移步骤。可以从预测的结合位点的不对称性来理解DARQ J的立体特异性;活性手性对映体也理想的容纳于此洞穴,而该化合物的其它形式与变异ATP酶的契合度降低。
我们在这里得出的结合位点在ATP酶系统上所处位置与DCCD的结合位点所处位置完全不同。根据牛ATP酶结晶″1E79″(参见C.Gibbons,M.G.Montgomery,A.G.W.Leslie,J.E.Walker,Nat.Struct.Biol.,7,1055(2000)),DARQ结合位点位于酶的膜部分,而DCCD结合位点在胞内约90埃。因此可参与DCCD类型MTB ATP酶抑制的原子不在本文的结合位点(它仅跨越酶的膜部分)原子坐标表所列区域之内,反之,酶中涉及到DARQ J抑制模式的部分也不存在于报道的“1E79”结构中(它仅出现于胞内部分)。这种结合位点上的差异可以解释结核分枝杆菌在体外ATP生成试验中的不同反应。
但是更早的关于DCCD对线粒体ATP酶作用的研究推测,在该酶F0区域亲脂性(lipophyllic)环境中的一个酸性氨基酸周围存在另一个结合位点,如Sebald W,Machleidt W,Wachter E.,Proc NatlAcad Sci USA.1980 Feb;77(2)785-789。可以认为这个线粒体ATP酶上的结合位点与本文描述的分枝杆菌位点类似。
同时,新的作用机制也确保,目前流行的对现有治疗措施具有抗性突变的TB菌株对J化合物没有交叉抗药性。从我们的体外研究可清楚地看出,J化合物至少对MDR-TB分离菌株具有高效抗菌作用,甚至对那些对四种药物都具有抗药性的菌株也有作用,其作用程度与对结核分枝杆菌的野生型全敏感(pan-susceptible)菌株的作用程度相同。这一发现具有重要意义,因为它清楚地说明J与现有的抗TB药物间没有交叉抗药性。如果对ATP酶膜部分中的结合口袋进行进一步鉴别,则该研究的结果将有助于进一步开发新型抗菌化合物,特别是开发以这些生物体中ATP合成为靶点的抗分枝杆菌化合物。
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表1.
表2序列P63691=SEQ ID No.1=MYCTUB C-亚单位,wt序列AJ865377=SEQ ID No.2=MYCTUB C-亚单位,突变型序列P63654=SEQ ID No.11=MYCTUB A-亚单位,wt和突变型基于表3的原子坐标的结合位点周围的氨基酸##C-亚单位1 ##-A链Ala21、Gly25##C-亚单位2 ##-K链Ala24、Gly27、Phe53、Phe54、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64、Phe65##C-亚单位3 ##-L链Met17、Gly19、Gly20、Ala21、Ile22、Gly23、Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64、Phe65.
##A亚单位 ##-M链Ser182、Leu183、Leu185、Arg186(在表3中为Ser 206-Leu 207-Leu 209和Arg 210)
表3
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表7
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序列表<110>Janssen Pharmaceutica N.V.
<120>Mutant atpE proteins<130>PRD2323p<150>EP 04104720.0<151>2004-09-28<150>US 60/620500<151>2004-10-20<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>81<212>PRT<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)<400>1Met Asp Pro Thr Ile Ala Ala Gly Ala Leu Ile Gly Gly Gly Leu Ile1 5 10 15Met Ala Gly Gly Ala Ile Gly Ala Gly Ile Gly Asp Gly Val Ala Gly20 25 30Asn Ala Leu Ile Ser Gly Val Ala Arg Gln Pro Glu Ala Gln Gly Arg35 40 45Leu Phe Thr Pro Phe Phe Ile Thr Val Gly Leu Val Glu Ala Ala Tyr50 55 60Phe Ile Asn Leu Ala Phe Met Ala Leu Phe Val Phe Ala Thr Pro Val65 70 75 80Lys<210>2<211>81<212>PRT<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)<400>2
Met Asp Pro Thr Ile Ala Ala Gly Ala Leu Ile Gly Gly Gly Leu Ile1 5 10 15Met Ala Gly Gly Ala Ile Gly Ala Gly Ile Gly Asp Gly Val Ala Gly20 25 30Asn Ala Leu Ile Ser Gly Val Ala Arg Gln Pro Glu Ala Gln Gly Arg35 40 45Leu Phe Thr Pro Phe Phe Ile Thr Val Gly Leu Val Glu Ala Pro Tyr50 55 60Phe Ile Asn Leu Ala Phe Met Ala Leu Phe Val Phe Ala Thr Pro Val65 70 75 80Lys<210>3<211>86<212>PRT<213>耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)<400>3Met Asp Leu Asp Pro Asn Ala Ile Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ile Gly1 5 10 15Gly Gly Leu Ile Met Gly Gly Gly Ala Ile Gly Ala Gly Ile Gly Asp20 25 30Gly Ile Ala Gly Asn Ala Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gln Pro Glu35 40 45Ala Gln Gly Arg Leu Phe Thr Pro Phe Phe Ile Thr Val Gly Leu Val50 55 60Glu Ala Ala Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Phe Met Ala Leu Phe Val Phe65 70 75 80Ala Thr Pro Gly Leu Gln85<210>4<211>86<212>PRT<213>耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)<400>4Met Asp Leu Asp Pro Asn Ala Ile Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ile Gly1 5 10 15Gly Gly Leu Ile Met Gly Gly Gly Ala Ile Gly Ala Gly Ile Gly Val20 25 30
Gly Ile Ala Gly Asn Ala Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gln Pro Glu35 40 45Ala Gln Gly Arg Leu Phe Thr Pro Phe Phe Ile Thr Val Gly Leu Val50 55 60Glu Ala Ala Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Phe Met Ala Leu Phe Val Phe65 70 75 80Ala Thr Pro Gly Leu Gln85<210>5<211>86<212>PRT<213>耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)<400>5Met Asp Leu Asp Pro Asn Ala Ile Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ile Gly1 5 10 15Gly Gly Leu Ile Met Gly Gly Gly Ala Ile Gly Ala Gly Ile Gly Val20 25 30Gly Ile Ala Gly Asn Ala Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gln Pro Glu35 40 45Ala Gln Gly Arg Leu Phe Thr Pro Phe Phe Ile Thr Val Gly Leu Val50 55 60Glu Ala Ala Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Phe Met Ala Leu Phe Val Phe65 70 75 80Ala Thr Pro Gly Leu Gln85<210>6<211>246<212>DNA<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)<400>6atggacccca ctatcgctgc cggcgccctc atcggcggtg gactgatcat ggccggtggc 60gccatcggcg ccggtatcgg tgacggtgtc gccggtaacg cgcttatctc cggtgtcgcc120cggcaacccg aggcgcaagg gcggctgttc acaccgttct tcatcaccgt cggtttggtt180gaggcggcat acttcatcaa cctggcgttt atggcgctgt tcgtcttcgc tacacccgtc240aagtaa 246<210>7<211>246<212>DNA<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)<400>7
atggacccca ctatcgctgc cggcgccctc atcggcggtg gactgatcat ggccggtggc 60gccatcggcg ccggtatcgg tgacggtgtc gccggtaacg cgcttatctc cggtgtcgcc120cggcaacccg aggcgcaagg gcggctgttc acaccgttct tcatcaccgt cggtttggtt180gaggcgccat acttcatcaa cctggcgttt atggcgctgt tcgtcttcgc tacacccgtc240aagtaa 246<210>8<211>261<212>DNA<213>耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)<400>8atggatctcg atcccaacgc catcatcacg gccggcgccc tgatcggcgg tggattgatc 60atgggtggcg gcgccatcgg tgccggtatc ggcgacggta tcgcgggtaa cgcgctgatc120tcgggtatcg cccgtcagcc cgaggcccag ggccggctgt tcaccccgtt cttcatcacc180gtcggtctgg tggaagccgc gtacttcatc aacctggcct tcatggcgct gttcgtcttc240gccactcctg gccttcagta a261<210>9<211>261<212>DNA<213>耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)<400>9atggatctcg atcccaacgc catcatcacg gccggcgccc tgatcggcgg tggattgatc 60atgggtggcg gcgccatcgg tgccggtatc ggcgtcggta tcgcgggtaa cgcgctgatc120tcgggtatcg cccgtcagcc cgaggcccag ggccggctgt tcaccccgtt cttcatcacc180gtcggtctgg tggaagccgc gtacttcatc aacctggcct tcatggcgct gttcgtcttc240gccactcctg gccttcagta a261<210>10<211>261<212>DNA<213>耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)<400>10atggatctcg atcccaacgc catcatcacg gccggcgccc tgatcggcgg tggattgatc 60atgggtggcg gcgccatcgg tgccggtatc ggcgtcggta tcgcgggtaa cgcgctgatc120tcgggtatcg cccgtcagcc cgaggcccag ggccggctgt tcaccccgtt cttcatcacc180gtcggtctgg tggaagccgc gtacttcatc aacctggcct tcatggcgct gttcgtcttc240gccactcctg gccttcagta a261<210>11<211>753<212>DNA<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)<400>11atgactgaga ccatcctggc cgcccaaatc gaggtcggcg agcaccacac ggccacctgg 60ctcggtatga cggtcaacac cgacaccgtg ttgtcgacgg cgatcgccgg gttgatcgtg120atcgcgttgg ccttttacct gcgcgccaaa gtgacttcga cggatgtgcc aggcggggtg180cagttgtttt ttgaggcgat caccattcag atgcgcaatc aggtcgaaag cgccatcggg240
atgcggatcg cacccttcgt gctgccgctg gcggtgacca tcttcgtgtt catcctgatc300tccaactggc tggcagtcct cccggtgcag tacaccgata aacacgggca caccaccgag360ttgctcaaat cggcagcagc ggacatcaat tacgtgctgg cgctggcgct tttcgtgttc420gtctgctacc acacggccgg tatttggcgg cgcggtattg tcggacaccc gatcaagttg480ctgaaagggc acgtgacgct cctcgcgccg atcaaccttg tcgaagaagt cgccaagcca540atctcgttgt cgctccgact tttcggcaac attttcgccg gcggcattct ggtcgcactg600atcgcgctct ttccccccta catcatgtgg gcgcccaatg cgatctggaa agcatttgac660ctgttcgtcg gcgcaatcca ggccttcatt tttgcgctgc tgacaatttt gtacttcagc720caagcgatgg agctcgaaga ggaacaccac tag 753<210>12<211>250<212>PRT<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)<400>12Met Thr Glu Thr Ile Leu Ala Ala Gln Ile Glu Val Gly Glu His His1510 15Thr Ala Thr Trp Leu Gly Met Thr Val Asn Thr Asp Thr Val Leu Ser20 25 30Thr Ala Ile Ala Gly Leu Ile Val Ile Ala Leu Ala Phe Tyr Leu Arg35 40 45Ala Lys Val Thr Ser Thr Asp Val Pro Gly Gly Val Gln Leu Phe Phe50 55 60Glu Ala Ile Thr Ile Gln Met Arg Asn Gln Val Glu Ser Ala Ile Gly65 70 75 80Met Arg Ile Ala Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala Val Thr Ile Phe Val85 90 95Phe Ile Leu Ile Ser Asn Trp Leu Ala Val Leu Pro Val Gln Tyr Thr100 105 110Asp Lys His Gly His Thr Thr Glu Leu Leu Lys Ser Ala Ala Ala Asp115 120 125Ile Asn Tyr Val Leu Ala Leu Ala Leu Phe Val Phe Val Cys Tyr His130 135 140Thr Ala Gly Ile Trp Arg Arg Gly Ile Val Gly His Pro Ile Lys Leu145 150 155 160Leu Lys Gly His Val Thr Leu Leu Ala Pro Ile Asn Leu Val Glu Glu165 170 175Val Ala Lys Pro Ile Ser Leu Ser Leu Arg Leu Phe Gly Asn Ile Phe180 185 190Ala Gly Gly Ile Leu Val Ala Leu Ile Ala Leu Phe Pro Pro Tyr Ile195 200 205Met Trp Ala Pro Asn Ala Ile Trp Lys Ala Phe Asp Leu Phe Val Gly210 215 220Ala Ile Gln Ala Phe Ile Phe Ala Leu Leu Thr Ile Leu Tyr Phe Ser
225 230 235 240Gln Ala Met Glu Leu Glu Glu Glu His His245 250
权利要求
1.一种ATP酶F0部分的结合位点,其特征为包含了atpE蛋白的抗性赋予突变位点。
2.权利要求1的结合位点,其中抗性赋予突变位点指atpE蛋白的14-34位氨基酸和53-69位氨基酸,以Mtb_S(SEQ ID No.1)或Mtb_R(SEQ ID No.2)的序号作为参照。
3.权利要求1的结合位点,至少包含一个C亚基的氨基酸Ala24、Gly27、Phe53、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64和Phe65以及一个A亚基的氨基酸Ser182、Leu183、Leu185和Arg186。
4.权利要求4的结合位点,其中所述氨基酸具有表3、4或5中任一个的原子坐标,或者具有同源结构坐标,其中同源结构坐标中非氢原子的均方根偏差小于1.5。
5.权利要求1-4中任一项的结合位点在鉴别和评价方法中的用途,用来鉴别与ATP酶F0部分相互作用的化合物,并评价它们作为抗微生物化合物的潜力。
6.一种评价试验化合物与atpE蛋白相互作用潜力的方法,所述方法包括以下步骤--使用分子建模技术以得到权利要求1-4中任一项的结合位点的三维结构;--在所述试验化合物和所述结合位点的三维结构之间使用计算机方法进行契合操作;--分析所述契合操作结果,以对所述试验化合物与所述结合位点三维结构之间的联系进行量化。
7.权利要求6的方法,其中所述三维结构至少从一个C亚基的氨基酸Ala24、Gly27、Phe53、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64和Phe65以及一个A亚基的氨基酸Ser182、Leu183、Leu185和Arg186,使用表3、4或5中任一个的原子坐标,或者使用同源结构坐标得出,其中同源结构坐标中非氢原子的均方根偏差小于约1.5。
8.权利要求6的方法,其中三维结构用以下氨基酸的原子坐标得出表3、4或5中任一个的A链的Ala21、Gly25;表3、4或5中任一个的K链的Ala24、Gly27、Phe53、Phe54、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64、Phe65;表3、4或5中任一个的L链的Met17、Gly19、Gly20、Ala21、Ile22、Gly23、Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64、Phe65;和表3、4或5中任一个的M链的Ser182、Leu183、Leu185、Arg186。
9.一种治疗微生物感染者的方法,包括给予感染者可与atpE蛋白在其抗性赋予突变位点发生相互作用的化合物。
10.权利要求9的方法,其中抗性赋予突变位点指atpE蛋白的14-34和53-69位氨基酸,使用Mtb_S(SEQ ID No.1)或Mtb_R(SEQID No.2)的序号作为参照。
11.一种治疗微生物感染者的方法,包括给予感染者可与权利要求1-4中任一项的结合位点相互作用的化合物。
12.由上述任何筛选方法鉴别出的化合物在治疗方法中的用途,用来对微生物感染者进行治疗。
13.权利要求12的用途,用来治疗由革兰氏阳性菌引起的感染,更具体来说是分枝杆菌引起的感染,最具体来说是治疗非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌-BCG、龟分枝杆菌、偶然分枝杆菌、戈登分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、副结核分枝杆菌、麻风杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌和偶发分枝杆菌引起的感染。
14.权利要求12的用途,用来治疗中枢神经系统感染、外耳感染、中耳感染例如急性分泌性中耳炎、硬脑膜窦感染、眼部感染、口腔感染如牙齿、牙龈和粘膜感染、上呼吸道感染、下呼吸道感染、泌尿生殖器感染、胃肠感染、妇产科感染、败血病、骨骼与关节感染、皮肤与皮肤结构感染、细菌性心内膜炎、烧伤、手术后的感染预防和免疫抑制病人例如癌症化疗病人和器官移植病人的感染预防。
15.DARQ J在制造治疗细菌感染的药物中的用途,条件是所述感染不是分枝杆菌感染。
16.一种分离的突变atpE蛋白,其中所述突变包括至少一个点突变,所述点突变位于图2所示序列比对中的20-40位氨基酸,特别是30-40位氨基酸,或者位于60-75位氨基酸,特别是62-73位氨基酸中任何氨基酸上。
17.权利要求16的分离的突变atpE蛋白,其中所述突变包括至少一个图2所示序列比对中34位氨基酸或69位氨基酸上的点突变。
18.权利要求17的分离的突变atpE蛋白,选自Mtb_R(SEQ ID No.2)、Msm_R09(SEQ ID No.4)、Msm_R10(SEQ ID No.5),和与Mtb_R、Msm_R09或Msm_R10具有至少70、80、90、95、97或98%序列同一性的氨基酸序列。
19.一种分离的核酸序列,编码权利要求16-18中任一项的分离的突变atpE蛋白。
20.一种载体,包含权利要求19的核酸序列。
21.一种宿主细胞,携带权利要求20的载体。
22.一种鉴别抗微生物化合物的方法,所述方法包括a)在生理条件下使试验化合物与表达atpE蛋白的细胞相接触,和b)确定所述试验化合物是否与atpE蛋白相互作用。
23.权利要求22的方法,其中atpE蛋白选自SwissProt entry Q10598或与SwissProt entry Q10598具有至少70、80、90、95、97或98%序列同一性的蛋白;和权利要求1-3中任一项的突变atpE蛋白。
24.一种鉴别试验化合物是否与分离的atpE蛋白相互作用的方法,所述方法包括a)在已知能与atpE蛋白结合的化合物存在和不存在的情况下,使试验化合物与表达atpE蛋白的细胞相接触,其中所述细胞不正常表达所述atpE蛋白,b)使用已知能与该atpE蛋白结合的化合物作为参考,来确定该试验化合物与atpE蛋白的结合。
25.权利要求24的方法,其中atpE蛋白选自SwissProt entry Q10598或者与SwissProt entry Q10598具有至少70、80、90、95、97或98%序列同一性的蛋白;和权利要求16-18中任一项的突变atpE蛋白。
26.权利要求24的方法,其中已知能与atpE蛋白结合的化合物被可检测性标记,并包括(J)。
27.权利要求24的方法,其中步骤a)包括在已知能与atpE蛋白结合的化合物存在和不存在的情况下,使试验化合物与包含有atpE蛋白的细胞组合物相接触。
28.权利要求27的方法,其中所述细胞组合物由得自权利要求21细胞的膜制备物组成。
29.一种评价试验化合物与atpE蛋白相互作用潜力的方法,所述方法包括a)使用分子建模技术建立所述atpE蛋白的三维结构,b)在所述试验化合物和所述atpE蛋白的三维结构之间使用计算机方法进行契合操作,c)分析所述契合操作结果,以对所述试验化合物与所述atpE蛋白三维结构之间的联系进行量化。
30.权利要求29的方法,其中使用大肠杆菌的Ile28、Glu61和Ile63原子坐标(Protein Database 1Q01)+/-所述氨基酸骨架原子的10以下的均方根偏差,得到所述atpE蛋白的三维结构。
31.权利要求29的方法,其中使用表6或7的原子坐标+/-所述氨基酸骨架原子的1.5以下的均方根偏差,得到所述atpE蛋白的三维结构。
全文摘要
本发明提供了分离的突变atpE蛋白,并从所述突变atpE蛋白出发鉴别了一种ATP酶结合结构域。本发明还提供了相关核酸、载体、宿主细胞、药用组合物和产品。本发明进一步提供了确定试验化合物是否与atpE蛋白相互作用,即是否与本发明的ATP酶结合结构域相互作用的方法,还提供了包含所述试验化合物的药用组合物,具体而言是用作抗微生物药,更具体而言是用作抗分枝杆菌药,尤其是用以治疗患结核的患者。
文档编号G01N33/50GK101065397SQ200580040762
公开日2007年10月31日 申请日期2005年9月28日 优先权日2004年9月28日
发明者K·J·L·M·安德里斯, H·W·H·戈尔曼, J·-M·E·F·M·尼弗斯, P·K·M·弗哈塞尔特, J·温克勒, M·R·德琼格, L·M·H·科伊曼斯 申请人:詹森药业有限公司
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