专利名称：脂蛋白分析方法
技术领域：
本发明涉及通过将样品中所含的脂蛋白颗粒分级成各个亚类来分析脂蛋白的方法，所述方法使得有可能进行数据分析以有效诊断各种疾病。
背景技术：
日本专利申请(公开)第9-15225 A号(1997)公开了通过凝胶过滤液相色谱对受试者样品中所含的脂蛋白颗粒根据颗粒大小进行分类，然后对分类脂蛋白中所含的胆固醇或甘油三酯进行定量的方法，其中通过使所获得的色谱图进行数据处理如高斯分布近似，将脂蛋白颗粒分级成乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。
日本专利申请(公开)第2002-139501 A号公开了通过凝胶过滤液相色谱对受试者样品中所含的脂蛋白颗粒根据颗粒大小进行分类，然后对分类脂蛋白中所含的胆固醇或甘油三酯进行定量的方法，其中脂蛋白颗粒被分类成20个亚类。
但是，以上专利文件2公开的分类方法只被应用于使用特定的柱的情况，20个亚类的各自峰位置(即颗粒大小)未得到理论基础的支持。例如，LDL的颗粒大小，当使用GGE方法(聚丙烯酰胺密度梯度凝胶电泳)时测定为25.5nm截断值，当使用NMR方法时基于电子显微镜所观察到的大小测定为约25.5nm，当使用凝胶过滤FPLC方法时基于GGE方法所获得的大小测定为25.5nm，当使用凝胶过滤HPLC时基于乳胶小珠(latex bead)或球状蛋白质同样测定为25.5nm。当使用光散射方法时根据估测方法颗粒大小可不同。此外，如按平衡超速离心法测定分子量，则该颗粒大小可能又变成不同的值。因此，基于颗粒大小的脂蛋白亚类定义和在这些亚类之间对受试者样品中所含各种脂蛋白的比较会导致混淆。
发明公开 鉴于上述情况，本发明人使得有可能基于在代谢疾病患者观察到的峰位置进行多个样品的各亚类之间的比较成为可能，所述患者的脂蛋白代谢表明VLDL、LDL和HDL的大小范围窄，即使使用具有不同分离规格和分子大小范围的不同凝胶过滤柱也是这样。
本发明的脂蛋白分析方法包括通过液相色谱分离受试者样品中所含的多种类别脂蛋白，然后检测来自分离脂蛋白颗粒中所包括的成分的信号的步骤；和假定脂蛋白由从包括锚定峰(anchor peak)和额外必要峰(extra essential peak)的成分峰推测出的亚类组成，然后用上述检测信号计算对应于成分峰总和的近似曲线的步骤。
另外，分离脂蛋白颗粒中所包括的成分的实例包括胆固醇、甘油三酯、游离胆固醇、磷脂、载脂蛋白等。在本发明的脂蛋白分析方法中，近似曲线可基于来自至少一种成分的检测信号来计算，如胆固醇、甘油三酯、游离胆固醇、磷脂、载脂蛋白等。
锚定峰是其位置经实验测定的峰。另一方面，额外必要峰是其位置和宽度用数学法确定的峰。假定LDL亚类的分布宽度与HDL的几乎相同，然后确定额外必要峰的位置和宽度，以使其以几乎相等的间隔位于各锚定峰之间。
成分峰的数量可以是但不具体限于13-20个。例如，当使用能够分离多种脂蛋白(从CM到HDL的脂蛋白都可分离)的TSKgelLipopropakXL柱作为液相色谱柱时，最多可建立20个成分峰。在使用分级范围覆盖VLDL到HDL(CM未覆盖)的Pharmacia(或Amersham Biosciences)生产的Superose 6HR 10/30柱或SkylightBiotech Inc.生产的SkylightPak-LDL柱的情况下，可建立数量小于20个的成分峰。另外，当例如使用TSK G3000SWXL柱时，可建立至少13个成分峰，以分析LDL和HDL亚类。
锚定峰的洗脱时间(颗粒大小)可定义为使用得自正常血脂中年男性人群的上述样品获得的谱图(profile)中VLDL大小、LDL大小和HDL大小的颗粒的平均洗脱时间。锚定峰的洗脱时间(颗粒大小)也可定义为使用得自脂蛋白脂肪酶活性没有或极低的病例的上述样品所获得的谱图中VLDL大小、LDL大小和HDL大小的颗粒的平均洗脱位置。另外，锚定峰的洗脱时间(颗粒大小)还可定义为使用得自胆固醇酯转移蛋白缺乏的病例的上述样品获得的谱图中HDL大小的颗粒的平均洗脱位置。此外，锚定峰的洗脱时间(颗粒大小)亦可定义为使用得自具有ApoE2/2的III型高脂血症的上述样品获得的谱图中VLDL大小的颗粒的平均洗脱位置。
已基于得自胆固醇的检测信号进行定义的成分峰，可用以计算关于得自胆固醇的谱图的近似曲线及关于得自胆固醇之外成分(如甘油三酯、游离胆固醇、磷脂、载脂蛋白等)的谱图的其它近似曲线。
本发明的内脏脂肪积累所致疾病的诊断方法包括制备由待诊断受试者收集的受试者样品的步骤；通过液相色谱分离上述样品中所含的多种类别脂蛋白的步骤；检测来自分离脂蛋白颗粒中所包括的各成分的信号的步骤；假定脂蛋白由从包括锚定峰和额外必要峰的成分峰推测出的亚类组成，然后用上述检测信号计算对应于成分峰总和的近似曲线的步骤；和分析所述计算出的近似曲线的步骤。
内脏脂肪积累所致疾病的实例包括例如以缺血性心脏病为代表的动脉硬化疾病。也就是说，由于近来生活方式改变所伴随的营养过度或低体力劳动导致脂肪积累和肥胖，因各种风险因素的累加所致的以缺血性心脏病为代表的动脉硬化疾病的发生率已增加。通过造成胰岛素抗性的遗传易感性与获得性因素如肥胖相结合引起胰岛素抗性而产生这类疾病。重要的是将腹部内内脏脂肪积累认为是主要的上游原因。肥胖者及非肥胖者所引起的腹部内内脏脂肪积累密切地促成糖尿病、高血压和冠状动脉疾病(CAD)的发作。因此，内脏脂肪积累所致疾病的实例的实例包括糖尿病、高血压、高脂血症和冠状动脉疾病。
在本发明的内脏脂肪积累所致疾病的诊断方法中，例如说，内脏脂肪面积与VLDL的大、中或小亚类和与LDL的中、小或极小亚类中的胆固醇含量成正比，而内脏脂肪面积与HDL的大或中亚类中的胆固醇含量成反比。换句话说，内脏脂肪积累所致疾病通过VLDL的大、中或小亚类和LDL的中、小或极小亚类中的胆固醇含量的增加来诊断，和通过HDL的大或中亚类中的胆固醇含量的减少来诊断。
高水平的LDL胆固醇是重要的风险因素之一。当LDL胆固醇浓度正常时(LDL-C＜130mg/dL)，小和极小LDL亚类中的胆固醇浓度与内脏脂肪面积成正比，而大LDL亚类中的胆固醇浓度与内脏脂肪面积成反比。这意味着LDL中包括抗动脉粥样硬化的LDL亚类，大LDL亚类起作用以抑制动脉硬化的发作。虽然大LDL亚类的成分峰被确定为额外必要峰，并被确定为VLDL和LDL之间的过渡成分，但该成分峰可最新判断为具有本发明临床意义的新亚类。换句话说，因内脏脂肪积累所致的动脉硬化的发作可通过大LDL亚类的成分峰处的胆固醇含量来诊断。
另外，在冠状动脉疾病中观察到，小VLDL亚类的胆固醇浓度增加，小和极小LDL亚类的胆固醇浓度也增加，大HDL亚类的胆固醇浓度减少，因此可以通过测量小VLDL、小和极小LDL和大HDL亚类中的胆固醇浓度来诊断冠状动脉疾病。
本发明的冠状动脉疾病的诊断方法包括用本发明的脂蛋白分析方法分析获自待诊断受试者的受试者样品中所含的脂蛋白的步骤；和根据选自(I)-(V)的任一公式计算数值 (I)Vs+Ls-Hs； (II)Vs+Ls； (III)Ls； (IV)(Vs+Ls)/Hs；和 (V)Ls/Hs， 其中“Vs”表示小VLDL中的胆固醇含量；“Ls”代表小LDL和极小LDL中的胆固醇含量之和；“Hs”代表大HDL中的胆固醇含量。
在本发明的冠状动脉疾病的诊断方法中，分析步骤还优选包括将计算值与参考值相比较的步骤。
在冠状动脉疾病中显著增加的小VLDL亚类的成分峰是锚定峰，该峰由得自具有ApoE2/2的III型高脂血症的VLDL大小确定，因此对应于具有ApoE2/2的III型高脂血症中增加的残粒(remnant)，由此认识到本程序中同样是冠状动脉的重要风险因素的残粒可从对应于小VLDL亚类的成分峰来判断。
附图简述
图1是显示脂蛋白分析仪的系统配置的图，该分析仪定量受试者样品的脂蛋白颗粒中所含的胆固醇和甘油三酯； 图2是特性图，显示胆固醇色谱图及甘油三酯色谱图，横轴表示洗脱时间(min.)，纵轴表示检测值(mV)； 图3是特性图，显示用两根TSKgel LipopropalXL柱(Tosoh Corp.生产)获得的支持锚定峰定义的数据； 图4是特性图，显示用Superose 6HR 10/30柱(Pharmacia生产)获得的支持锚定峰定义的数据； 图5是特性图，显示用SkylightPak-LDL柱(Skylight Biotech Inc生产)获得的支持锚定峰定义的数据； 图6(a)是谱图，显示用获自健康女性的血清样品获得的胆固醇含量；6(b)是谱图，显示用获自脂蛋白脂肪酶缺乏患者的血清样品获得的胆固醇含量； 图7(a)是散点图，显示高LDL-C组(空心圆圈)和低LDL-C组(实心圆圈)的内脏脂肪面积和大LDL-C浓度之间的关系，图7(b)是散点图，显示高LDL-C组(空心圆圈)和低LDL-C组(实心圆圈)的内脏脂肪面积和小LDL-C浓度之间的关系，图7(c)是散点图，显示高LDL-C组(空心圆圈)和低LDL-C组(实心圆圈)的内脏脂肪面积和极小LDL-C浓度之间的关系； 图8(a)是特性图，显示用Superose 6HR 10/30柱对获自健康人受试者的混合血清进行的胆固醇分析的结果； 图8(b)是特性图，显示用Superose 6HR 10/30柱对获自健康人受试者的混合血清进行的甘油三酯分析的结果； 图9(a)是特性图，显示用两根TSKgel LipopropakXL柱对获自健康人受试者的混合血清进行的胆固醇分析的结果； 图9(b)是特性图显示用两根TSKgel LipopropakXL柱对获自健康人受试者的混合血清进行的甘油三酯分析的结果； 图10(a)是特性图，显示用SkylightPak-LDL柱对获自健康人受试者的混合血清进行的胆固醇分析的结果； 图10(b)是特性图，显示用SkylightPak-LDL柱对获自健康人受试者的混合血清进行的甘油三酯分析的结果； 图11是特性图，显示G7至G20各峰处的平均胆固醇含量的计算结果，其来自用Superose 6HR 10/30柱对表8所示59名受试者所得的图8所示结果； 图12是特性图，显示G7至G20各峰处的平均胆固醇含量的计算结果，其来自用TSKgel LipopropakXL柱对表8所示59名受试者所得的图9所示结果； 图13是特性图，显示对于G7至G13(对应于从小VLDL亚类到LDL亚类的范围)各成分峰处的胆固醇含量Superose 6HR 10/30和TSKgel LipopropakXL柱之间比较的结果，其基于对表8所示59名受试者所得的图11和12所示结果； 图14是特性图，显示对于G14至G20(对应于HDL亚类)各成分峰处的胆固醇含量Superose 6HR 10/30和TSKgel LipopropakXL柱之间比较的结果，其基于对表8所示59名受试者所得的图11和12所示结果； 图15是特性图，显示G6至G20各峰处的平均胆固醇含量的计算结果，其来自用TSKgel LipopropakX柱对表9所示44名受试者所得的图9所示结果； 图16是特性图，显示G6至G20各峰处的平均胆固醇含量的计算结果，其来自用SkylightPak-LDL柱对表9所示44名受试者所得的图10所示结果； 图17是特性图，显示对于G6至G13(对应于从中VLDL亚类到LDL亚类的范围)各成分峰处的胆固醇含量TSKgel LipopropakXL和SkylightPak-LDL柱之间比较的结果，其基于对表9所示44名受试者所得的图15和16所示结果； 图18是特性图，显示对于G14至G20(对应于HDL亚类)各成分峰处的胆固醇含量TSKgel LipopropakXL和SkylightPak-LDL柱之间比较的结果，其基于对表9所示44名受试者所得的图15和16所示结果。
实施本发明的最佳方式 现参考附图详细说明本发明。
如图1所示，应用本发明分析方法和分析程序的脂蛋白分析仪包括例如，用以分离受试者样品中所含脂蛋白成分的柱1、用以将柱1洗脱出的含脂蛋白颗粒的洗脱缓冲液分流成2部分的分流器2、通过分流器2分流的第一通道3和第二通道4、置于第一通道3上的胆固醇(下文称“TC”)反应部件5、置于第二通道4上的甘油三酯(下文称“TG”)反应部件6、位于第一通道3上的TC反应部件5下游的TC检测部件7、位于第二通道4上的TG反应部件6下游的TG检测部件8、起到控制本系统运行的作用且来自TC检测部件7和TG检测部件8的信号输入其中的系统控制器9和连接到系统控制器9的运算器10。本文所用的受试者样品并没有具体限制，指获自生物体的样品如血清、血浆、脊髓液、组织液或淋巴液及含衍自细胞培养物的分泌性颗粒的样品。
脂蛋白分析仪还包括用以将血清样品供应到柱1的取样器11、用以将洗脱缓冲液供应到柱1的第一泵12和用以给待通过第一泵12供应给柱1的洗脱缓冲液除去气体的除气器13。
虽然用于本脂蛋白分析仪的柱1没有具体限制，但特别优选使用充填凝胶过滤用填料的柱。具体的说，柱1的一个实例可以是充填平均微孔大小为800-1200埃的填料的柱。当使用平均微孔大小低于800埃的填料时，难以使颗粒大小较大的脂蛋白颗粒如CM或VLDL渗透到微孔中。另一方面，当使用平均微孔大小大于1200埃的填料时，填料分离颗粒大小较小的脂蛋白颗粒如LDL或HDL的能力降低。因此，优选使用上述平均微孔大小为800-1200埃的填料。其中，平均微孔大小为900-1100埃的填料其分离能力优越，最终使得脂蛋白的分析可以以高精密度进行。
另外，需要对填料加以选择，使其具有充分的机械强度以经受其在液相色谱中的应用。这种填料的实例包括例如硅胶、聚乙烯醇、聚羟基甲基丙烯酸酯和其它基于亲水性树脂的材料(例如Tosoh Corp.生产的TSKgel Lipopropak(商品名))。
洗脱缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲溶液，tris缓冲溶液，bis-tris缓冲溶液等，不过并不具体限于它们，只要溶液能分离脂蛋白颗粒即可。缓冲溶液的浓度优选在20-200mM的范围，更优选在50-100mM的范围，因为缓冲溶液浓度低于20mM不足以提供合适的缓冲能力，浓度超过200mM可能会抑制下文描述的酶试剂和TC或TG之间的反应。缓冲溶液的pH值为5-9，更优选7-8，因为pH值小于5或大于9可能会抑制下文描述的酶试剂的反应。但是，只要不用酶来进行TC和/或TG的测量，pH值就不限于如此。
TC反应部件5通过第二泵15连接到装有试剂的TC试剂罐14，该试剂用于定量柱1洗脱出的含脂蛋白颗粒的洗脱缓冲液中所包括的TC。用于定量TC的试剂的实例包括但不具体限于例如通过将酶如胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或过氧化物酶与染料如N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀基乙二胺、4-氨基安替比林或N-乙基-N-(3-磺基丙基)间茴香胺组合而获得的酶-染料试剂。可优选使用的这种试剂的实例是市售的测定试剂(determiner)L TCII(Kyowa Medex Co.，Ltd.)和typeL CHO·H(Wako Pure Chemical Industries Ltd.)。这些试剂与TC反应而提供能发射或吸收荧光的反应产物，荧光可通过光谱仪如荧光检测器或紫外-可见光检测器来检测。
TG反应部件6通过第二泵15连接到装有试剂的TG试剂罐16，该试剂用于定量柱1洗脱出的含脂蛋白颗粒的洗脱缓冲液中所包括的TG。用于定量TG的试剂的实例包括但不具体限于例如通过将酶如抗坏血酸氧化酶、甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶、脂蛋白脂肪酶和过氧化物酶与染料如醌基发色染料组合而获得的酶-染料试剂。醌基发色染料的实例包括N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀基乙二胺或N-乙基-N-(3-磺基丙基)间茴香胺与4-反氨基吡啶的氧化缩合物。可优选使用的这种试剂的实例是市售的测定试剂L TGII(Kyowa MedexCo.，Ltd.)和type L TG·H(Wako Pure Chemical Industries Ltd.)。
提供具有反应线圈的TC反应部件5和TG反应部件6，以在上述试剂与TC或TG的反应过程控制温度。TC反应部件5或TG反应部件6中上述试剂与TC或TG的反应温度为35-50℃，优选45-50℃，因为低于35℃的反应温度可能不足以进行反应，而超过50℃的反应温度可能会导致酶在其反应过程中变性。
提供具有例如紫外-可见光检测器的TC检测部件7，以检测TC反应部件5中TC与试剂之间的反应所产生的反应产物的吸光度。提供具有例如紫外-可见光检测器的TC检测部件8，以检测TG反应部件6中TG与试剂之间的反应所产生的反应产物的吸光度。例如，当醌基发色染料用作上述试剂时，紫外-可见光检测器的测量波长可为540-560nm。
TC检测部件7和TG检测部件8的输出信号输入其中的系统控制器9，具有输出TC色谱图和TG色谱图作为结果的功能。例如如图2所示，系统控制器9的色谱图输出能显示TC色谱图和叠加于其上的TG色谱图，其中横轴表示洗脱时间(min.)、纵轴表示检测值(mV)。
作为运算器10，例如可以使用安装了下述分析程序的计算机。运算器10连接到系统控制器9，具有以下功能用分析程序对系统控制器9输出的色谱图进行数据处理，将受试者样品中所含的脂蛋白颗粒分离成20个成分峰，计算TC和TG的数量。运算器10还可通过信息通讯线路网络如因特网、局域网或内联网连接到系统控制器9。
根据上述脂蛋白分析仪，各种脂蛋白首先通过柱1依其颗粒大小被分类，然后柱1洗脱出的洗脱缓冲液中所含的TC和TG被定量。因此，脂蛋白分析仪能够依靠柱1的分辨力为每一脂蛋白亚类定量TC和TG。
脂蛋白根据诸如颗粒大小、水合密度、电泳度等性质上的差异被分类成多种类别。本分析仪按照下述分析程序将血清样品中所包括的脂蛋白颗粒分离成20个成分峰。
现描述分析程序。分析程序遵循包括步骤1和步骤2的流程控制运算器10。
步骤1是首先将系统控制器9输出的色谱图作为输入信号通过运算器10的输入装置输入。也就是说，分析程序在步骤1将计算机执行为检测装置，输入系统控制器9输出的色谱图作为输入信号。
现详细描述步骤1。首先，图2所示的TC色谱图和TG色谱图通过运算器10的输入装置输入，然后所述色谱图和/或支持所述色谱图的数值数据被储存在运算器10的固有存储器中或被记录在运算器10可记录的记录介质中。
接着，步骤2是对输入的色谱图进行数据处理，然后将所获得的结果分类成20个成分峰，以计算高斯接近曲线。也就是说，分析程序在步骤2中将计算机执行为数据处理装置，用以计算高斯接近曲线。数据处理装置使步骤1输入的色谱图得以分离成20个独立的峰。在以下描述中，20个独立的峰按大小降低的顺序称为G1至G20。G1和G2是对应于乳糜微粒(CM)的成分峰，G3-G7是对应于极低密度(比重)脂蛋白(VLDL)的成分峰，G8-G13是对应于低密度脂蛋白(LDL)的成分峰，G14-G20是对应于高密度(HDL)的成分峰。在对应于VLDL的成分峰当中，G3-G5表示大VLDL，G6表示中VLDL，G7表示小VLDL。在对应于LDL的成分峰当中，G8表示大LDL，G9表示中LDL，G10表示小LDL，G11-G13表示极小LDL。在对应于HDL的成分峰当中，G14和G15表示极大HDL，G16表示大HDL，G17表示中HDL，G18表示小HDL，G19和G20表示极小HDL。
步骤2的数据处理装置是将步骤1输入的色谱图或数值数据分离或分类成20个成分峰，然后让运算器10进行包括G1-G20的高斯近似曲线的计算。20个成分峰是按脂蛋白颗粒的大小分离的。
20个成分峰各自的峰位置如下描述进行定义。对于包括G1-G20的各20个峰，首先确定标准峰(锚定峰)的峰位置(洗脱时间)，然后确定锚定峰之外的峰(额外必要峰)的峰位置。具体举例说，将G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17和G18定义为锚定峰，G1-G4、G8、G11-G14、G16、G19和G20定义为额外必要峰。图3显示支持G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17和G18作为锚定峰的定义的数据实例。
由于正常血脂的中年男性(年龄30岁至40岁)人群中VLDL大小、LDL大小和HDL大小的颗粒分别分布在一定的范围，它们各自的洗脱位置确定为在这些锚定峰当中的G6、G9和G17(见图3(a))。具体的说，从采集自多个正常血脂的中年男性(年龄30岁至40岁)的血清样品获得图2所示的TC色谱图和TG色谱图。在所获得的色谱图上，对应于主类别VLDL、LDL和HDL的峰按这个顺序出现。计算出从多个正常血脂的中年男性获得的色谱图上各自对应于VLDL、LDL和HDL的峰位置的平均值，分别将平均VLDL大小、平均LDL大小和平均HDL大小定义为G6、G9和G17的洗脱位置。
在脂蛋白脂肪酶活性没有或极低的情况下，富TG脂蛋白中的甘油三酯不被分解，大小仍较大的VLDL保持在血液中。因此，脂蛋白脂肪酶活性没有或极低情况下的VLDL大小的颗粒比正常血脂男性的显著大得多，并分布在一定的大小范围内。VLDL的平均洗脱位置定义为锚定峰当中的G5的洗脱位置(见图3(b))。
另外，在血液中呈现的胆固醇酯转移蛋白的功能作用下，甘油三酯从VLDL转移到LDL，而胆固醇酯从LDL转移到VLDL。LDL变成富含甘油三酯的颗粒，LDL中的甘油三酯被肝脏脂肪酶分解，LDL变得更小。脂蛋白脂肪酶活性没有或极低情况下的LDL的颗粒大小比正常血脂男性的LDL大小显著小得多，并分布在一定的大小范围内。因此，此LDL的平均洗脱位置定义为锚定峰当中的G10的洗脱位置(见图3(b))。
另外，在脂蛋白脂肪酶活性没有或极低的情况下，甘油三酯从LDL或VLDL转移到HDL，而胆固醇酯从HDL转移到LDL或VLDL。结果，HDL变得富含甘油三酯，HDL中的甘油三酯被肝脏脂肪酶分解，从而HDL变得更小。因此，脂蛋白脂肪酶活性没有或极低情况下HDL大小的颗粒比正常血脂男性的显著更小，且分布在一定范围内。因此，此HDL的平均洗脱位置定义为锚定峰当中的G18的洗脱位置(见图3(b))。
还另外，在胆固醇酯转移蛋白缺乏的情况下，胆固醇酯没有从HDL转移到LDL或VLDL，而甘油三酯没有从LDL或VLDL接受到，结果HDL变得富含胆固醇，同时大小变得更大。特别是在胆固醇酯转移蛋白缺乏情况下，HDL包括极少的甘油三酯。胆固醇酯转移蛋白完全缺乏情况下HDL大小的颗粒比正常血脂男性的显著更大，且分布在一定大小范围内。因此，此HDL的平均洗脱位置定义为锚定峰当中的G15的洗脱位置(见图3(d))。
还另外，在具有ApoE2/2的III型高脂血症中，在第158位Cys替代Arg导致结合以ApoE为配体的LDL受体(ApoB/E)、LDL受体相关蛋白和VLDL受体的位点发生构象变化，结果小VLDL(残粒)的掺入减少，对应于小VLDL的成分在血液中增加，从而观察到特定的峰。因此，这种情况下VLDL的平均洗脱位置定义为锚定峰当中的G7的洗脱位置(见图3(c))。小VLDL的洗脱位置对应于中密度脂蛋白(IDL)的洗脱位置，IDL是通过超离心法从多个患有具有ApoE2/2的III型高脂血症的人受试者分离到的密度在1.006g/ml至1.019g/ml之间的级分(参见Shinichi Usui，Yukichi Hara，Seijin Hosaki，and Mitsuyo Okazaki，Journal of Lipid Research，Volume 43，p 805-814，(2002))。此外，IDL级分中的胆固醇含量与本发明的小VLDL中的胆固醇含量高度相关。因此，在具有ApoE2/2的III型高脂血症中显著增加的由锚定峰G7确定的小VLDL对应于残粒脂蛋白和/或IDL。
虽然图3所示的数据是用两根TSKgel LipopropakXL柱(TosohCorp.生产)获得的，但用其它的柱获得的数据也可用作支持锚定峰定义的数据。
例如，如图4所示，用Superose 6HR 10/30柱(Pharmacia生产)同样能获得数据，因此锚定峰可基于这些数据定义。在这种情况下，G9和G17的洗脱位置可从正常血脂的中年男性(年龄30岁到40岁)的谱图定义(图4(a))。G10和G18的洗脱位置可从脂蛋白脂肪酶活性没有或极低的病例的谱图定义(图4(b))。G7的洗脱位置可从具有ApoE2/2的III型高脂血症病例的谱图定义(图4(c))。G15的洗脱位置可从胆固醇酯转移蛋白完全缺乏的病例的谱图定义(图4(d))。
再举例说，如图5所示，用SkylightPak-LDL柱(Skylight Biotech Inc.生产)同样可获得数据，因此锚定峰可基于这些数据定义。在这种情况下，G6、G9和G17的洗脱位置可从正常血脂的中年男性(年龄岁17到30岁)的谱图定义(图5(a))。G10和G18的洗脱位置可从脂蛋白脂肪酶活性没有或极低的病例的谱图定义(图5(b))。G7的洗脱位置可从具有ApoE2/2的III型高脂血症病例的谱图定义(图5(c))。G15的洗脱位置可从胆固醇酯转移蛋白完全缺乏的病例的谱图定义(图5(d))。
如上所述，在G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17和G18是锚定峰的条件下，定义了各个洗脱位置。
接着，对于额外必要峰，峰的位置和宽度通过数学法确定。额外必要峰对于通过高斯近似来分析成分峰来说是必需的，在高斯近似中成分峰的大小和分布是固定的(时间和宽度固定)。就LDL和HDL而言，包括锚定峰和额外必要峰的成分峰的分布宽度假定为相互间几乎相同，额外必要峰还假定为以几乎相等的间隔位于锚定峰之间。在G10和G15之间设置了四个额外必要峰(峰11-14)，在G7和G9之间设置了一个额外必要峰(峰8)，在G15和G17之间设置了一个额外必要峰(峰16)，在G18之后设置了两个额外必要峰(峰19和20)。属于HDL的额外必要峰(峰16-20)的位置，可参考正常人群中的峰观察频率与使用另一HDL特异性柱的分析中进行重新色谱所获得的实验值之间的对应性来定义(参见Okazaki M et al.，J Biochem.，1982；92517-524)。
成分峰G8-20的位置确定为间隔几乎相等，它们的宽度也确定为几乎相等。成分峰2、3、4对于孔隙体积(Void)处的峰1和锚定峰G5之间进行高斯近似是必需的，也按照峰间隔和宽度规则来确定。
另外，成分峰宽度的最小值可定义为从分析系统获得的游离甘油(分子量92、大小均匀的颗粒，图2所示FG)宽度，最大值可定义为相邻成分峰间隔的两倍。
对于20个成分峰，峰宽度可设置为通过以下方程式获得的数值SD(min.)＝半峰宽(sec.)/143。具体的说，下述数值被输入或预置为20个成分峰的峰宽度G01为033min.；G02为0.40min.；G03为0.55min.；G04为0.55min.；G05为0.55min.；G06为0.50min.；G07为0.40min.；G08为0.38min.；G09为0.38min.；G10为0.38min.；G11为0.38min.；G12为0.38min.；G13为0.38min.；G14为0.38min.；G15为0.38min.；G16为0.38min.；G17为0.38min.；G18为0.38min.；G19为0.38min.和G20为0.48min.。
步骤2的数据处理装置可例如通过应用高斯曲线拟合计算算法来执行。根据高斯曲线拟合计算算法，可如下获得20个成分峰。
即，首先假设色谱图上的单个峰呈对称高斯分布的形式，时间t时的峰高h(t)可表示为 h(t)＝H×exp(-(t-T)2/2σ2) 式中T为峰位置，σ为宽度(标准偏差)(H为峰高的最大值)。已知峰还可呈以下形式(1)Peason VII，(2)Lorentzian，(3)指数修正的Gaussian，(4)Weibull，(5)bi-Gaussian，(6)Poisson，(7)Gram-Charlier，(8)Gauss和Cauchy函数的组合，(9)统计动差的组合或(10)凸轮驱动模拟峰(cam-driven analog peak)，因此可假定峰呈(1)至(8)任一形式。
第n个峰的高度hn(t)可表示为 hn(t)＝Hn×exp(-(t-Tn)2/2σn2)...I 式中Tn为第n个峰的位置，σn为宽度(标准偏差)(Hn为第n个峰(高度)的最大值)。
假设exp(-(t-Tn)2/2σn2)＝Gn(t)，则公式I可表示为 hn(t)＝Hn×Gn(t)...II. 假设N个峰相互独立，时间t时的合成曲线A(t)可表示为 A(t)＝h1(t)+h2(t)+...+hn-1(t)+hn(t) ＝H1×G1(t)+H2×G2(t)+...+Hn-1×Gn-1(t)+Hn×Gn(t)...III. 假设数据点的数量为m，上述公式III可如下m种不同方式表示 A(t1)＝H1×G1(t1)+H2×G2(t1)+...+Hn-1×Gn-1(t1)+Hn×Gn(t1)； A(t2)＝H1×G1(t2)+H2×G2(t2)+...+Hn-1×Gn-1(t2)+Hn×Gn(t2)； ...；和 A(tm)＝H1×G1(tm)+H2×G2(tm)+...+Hn-1×Gn-1(tm)+Hn×Gn(tm)。
假设时间t时的色谱图的实际曲线由R(t)表示，用曲线拟合方法来确定峰数量n、峰位置T和宽度(标准偏差)σ，以获得R(t)＝A(t)。在实际上，由于通过线性最小二乘法在任何时间都不能实现公式R(t)＝A(t)，故确定使(R(t)-A(t))2之和为最小值的参数。
除曲线拟合方法外，还可以应用例如迭代方法(如F1etcherPowell、Marquardt、Newton-Raphson、Simplex minimization、Box-Complex方法)。但是，这些曲线拟合方法之外的方法具有如下缺点，即初始值对计算结果有影响；必需先假定曲线对应于Gaussian还是对应于Lorentzian；和当峰的数量较大时(4个或更多)收敛难以实现。因此，非常重要的是知道如何确定更接近于真实值的初始值。最近已报道了诸如(1)因子分析、(2)矩分析、(3)正交多项式分析和(4)反扩散模型的方法作为克服这些缺点的峰分离方法，这些方法也可应用于本发明算法。
由于ti(i＝1，2，...，m)为常数，任何Gn(ti)也变成常数。因此，上述公式III可如下m种不同方式表示 A(t1)＝H1×G1(t1)+H2×G2(t1)+...+H19×Gn-1(t1)+H20×G20(t1)； A(t2)＝H1×G1(t2)+H2×G2(t2)+...+H19×Gn-1(t2)+H20×G20(t2)； ...；和 A(tm)＝H1×G1(tm)+H2×G2(tm)+...H19×G19(tm)+H20×G20(tm)。
假设R(t)＝A(t)，可获得m个基本表达式，其各自包含20个未知数H1、H2...、H19和H20。若m＝20，则解开该m个基本表达式即得解。
虽然在实际数据中数据点的数量不是20，但方便地选择容易高速进行计算的20个点(例如20个峰位置，各位置存在于20个成分峰的每一个中)用于本发明算法中的计算。在本发明算法中，数据点的数量可不选择为20个点，而是可通过最小二乘法确定。
根据上述包括步骤1和步骤2的流程，系统控制器9输出的色谱图(例如图2所示的色谱图)可分离成20个成分峰。通过分离成20个成分峰获得的，显示内脏脂肪面积(VFA)的明显相关性的谱图，被有效地用来检查内脏脂肪积累所致疾病的风险。
内脏脂肪积累所致疾病的实例包括例如以缺血性心脏病为代表的动脉硬化疾病。也就是说，由于近来生活方式改变所伴随的营养过度或低体力劳动导致脂肪积累和肥胖，因各种风险因素的累加所致的以缺血性心脏病为代表的动脉硬化疾病的发生率已增加。通过造成胰岛素抗性的遗传易感性与获得性因素如肥胖相结合引起胰岛素抗性而产生这类疾病。重要的是将腹部内的内脏脂肪积累认为是主要的上游原因。肥胖者及非肥胖者所引起的腹部内内脏脂肪积累密切地促成糖尿病、高血压和冠状动脉疾病(CAD)的发作。因此，内脏脂肪积累所致疾病的实例的实例包括糖尿病、高血压、高脂血症和冠状动脉疾病。
在本发明的内脏脂肪积累所致疾病的诊断方法中，例如说，内脏脂肪面积与VLDL的大、中或小亚类和与LDL的中、小或极小亚类中的胆固醇含量成正比，而与HDL的大或中亚类中的胆固醇含量成反比。换句话说，内脏脂肪积累所致疾病通过VLDL的大、中或小亚类和LDL的中、小或极小亚类中的胆固醇含量的增加，和通过HDL的大或中亚类中的胆固醇含量的减少来诊断。
高水平的LDL胆固醇是重要的风险因素之一。当LDL胆固醇浓度正常时(LDL-C＜130mg/dL)，小和极小LDL亚类中的胆固醇浓度与内脏脂肪面积成正比，而大LDL亚类中的胆固醇浓度与内脏脂肪面积成反比。这意味着LDL中包括抗动脉粥样硬化的LDL亚类，大LDL亚类起作用以抑制动脉硬化的发作。虽然大LDL亚类的成分峰被确定为额外必要峰，并被确定为VLDL和LDL之间的过渡成分，但该成分峰可最新判断为具有本发明临床意义的新亚类。换句话说，因内脏脂肪积累所致的动脉硬化的发作可通过大LDL亚类的成分峰处的胆固醇含量来诊断。
另外，在冠状动脉疾病中观察到，小VLDL亚类的胆固醇浓度增加，小和极小LDL亚类的胆固醇浓度也增加，大HDL亚类的胆固醇浓度减少，因此可以通过测量小VLDL、小和极小LDL和大HDL亚类中的胆固醇浓度来诊断冠状动脉疾病。
因此，根据本发明可提供冠状动脉疾病的诊断方法。冠状动脉疾病的诊断方法利用根据上述包括步骤1和步骤2的流程分离的20个成分峰。具体的说，冠状动脉疾病的诊断方法包括以下步骤根据上述包括步骤1和步骤2的流程分析获自待诊断受试者的受试者样品中所含的脂蛋白，以获得得自受试者的20个成分峰；根据选自(I)-(V)的任一公式计算数值 (I)Vs+Ls-Hs； (II)Vs+Ls； (III)Ls； (IV)(Vs+Ls)/Hs；和 (V)Ls/Hs， 其中“Vs”表示小VLDL中的胆固醇含量；“Ls”代表小LDL和极小LDL中的胆固醇含量之和；“Hs”代表大HDL中的胆固醇含量。
通过冠状动脉疾病的诊断方法获得的数值可用于涉及冠状动脉疾病的临床检查。在冠状动脉疾病的诊断方法中，分析步骤可包括将计算值与参考值相比较的步骤。参考值可设置为预定的数值，该数值基于对正常受试者组和冠状动脉疾病组的分析结果计算出。参考值可针对年龄组、种族组、性别等进行设置。
在冠状动脉疾病中显著增加的小VLDL亚类的成分峰是锚定峰，该峰由得自具有ApoE2/2的III型高脂血症的VLDL大小确定，因此对应于具有ApoE2/2的III型高脂血症中增加的残粒，由此认识到本程序中同样是冠状动脉的重要风险因素的残粒可从对应于小VLDL亚类的成分峰来判断。
实施例 用实施例详细解释本发明。但是，本发明的技术范围并不受以下实施例的限制。
[实施例1] <方法> 受试者 本研究招募62名男性(年龄22至67岁)，他们包括15名健康志愿者和47名大阪大学医院的住院病人。所有受试者在参加研究前都根据大阪大学医院伦理委员会的要求表示了他们的知情同意。所有患者都没有严重的肝病或肾病，且他们都没有服用任何已知会影响胰岛素作用或血清脂蛋白水平的药物。在过夜禁食后抽取静脉血。血清样品保存在冰箱中，在血液收集后7天内进行分析。
HPLC方法 简言之，将5mL全血清样品注射到2根连接在一起的TSKgelLipopropakXL(Tosoh)柱(300k×7.8mm)，用TSKeluent Lp-1(Tosoh)洗脱。柱洗脱液与市售试剂盒Determiner L TC(Kyowa Medex)进行在线酶促反应后于550nm处进行连续监测。各大类脂蛋白及其亚类的胆固醇浓度用我们自己的计算机程序来计算，该程序设计来用修饰的高斯曲线拟合处理复杂的色谱图，以通过数学处理来解析重叠的峰。
我们确定了亚类分析用的每个高斯成分峰的数量、位置和宽度，以在恒定的条件下对来自动物和人类的各种样品进行充分的曲线拟合分析，在该条件下每个高斯曲线的峰宽和位置都不改变。为此目的，我们先说明健康的正常血脂男性(n＝28)的VLDL和LDL的平均颗粒大小。因此，成分峰6和9的位置分别对应于健康受试者的VLDL(36.8±2.5nm)和LDL(25.5±0.4nm)的位置。类似地，峰5和10的位置分别是有和没有脂蛋白脂肪酶(LPL)的极高甘油三酯血症受试者(＞1000mg/dL(n＝7))的VLDL(44.5±2.1nm)和LDL(23.0±0.5nm)的位置。峰7对应于具有ApoE2/2的III型高脂血症受试者(n＝5)的LDL(或VLDL；31.3±1.0nm)。峰15是胆固醇酯转移蛋白缺乏受试者(n＝6)的HDL(13.5±0.4nm)。HDL亚类的其它成分峰(峰16-20)基于用分离范围只针对HDL的凝胶渗透柱(G3000SW)确定的5个亚类。除上述通过一定实验背景确定的11个成分峰外，还引入9个另外的峰(峰1-4、8和11-14)，以便只通过改变每个高斯曲线的峰高就获得最佳曲线模拟分析。峰8的位置(28.6nm)确定为峰7和峰9之间的中间点，代表了从富含TG的残粒脂蛋白到LDL的过渡成分。将四个峰(峰11-14)匀称地插入到峰10和峰15之间，使得从峰8到峰20各峰间隔相似。此外，在孔隙体积(峰1)和峰5之间需要引入至少3个峰(峰2-4)，以进行最佳曲线拟合。另外的峰作其它设置导致对原始色谱图的曲线拟合分析的程度下降。洗脱时间向颗粒直径的换算用柱校准曲线来进行，该曲线是标准样品——直径25和37nm的乳胶小珠(MagsphereInc)和含甲状腺球蛋白(17nm)、铁蛋白(12.2nm)、过氧化氢酶(9.2nm)、清蛋白(7.1nm)和卵清蛋白(6.1nm)的高分子量校准品(PharmaciaBiotech)的颗粒直径对数对其洗脱时间的曲线。
其它临床和脂质参数分析 血清TC和TG用市售试剂盒(Kyowa Medex)酶法测定。HDL-C通过肝素Ca2+沉淀方法定量。LDL-C用Friedewald等的公式计算。尿酸(UA)、空腹免疫反应性胰岛素(IRI)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1分别通过酶学方法和通过双抗体放射免疫测定法测量。
体脂肪分布按先前文献的描述通过计算机断层(CT)扫描(GeneralElectric CT/T扫描器，General Electric Co)在仰卧体位测定。皮肤和肌肉之间到腹膜外区域的脂肪层定义为皮下脂肪区域(SFA)，注意广度(attention range)为-40至-140 Hounsfield单位。密度与SFA相同的腹膜内区域定义为VFA。SFA和VFA在脐水平测量。
统计分析 数据以平均值±SD表示，除非另有规定。各变量之间的相关性以Pearson相关系数(r值)给出，P值＜0.05认为有统计学差异。
<结果> 研究受试者的临床特征和脂质水平 本研究的62名男性的临床特征和脂质水平在表1中显示。
表1.62名男性的临床特性、脂质和脂蛋白谱 *用沉淀法测定。
_方程的计算值。
获得的人体测量值相差甚大，因为招募他们就是为了覆盖大范围的体脂肪值体重指数(BMI)21-43kg/cm2，VFA 24-255cm2，SFA55-512cm2。代谢参数相比于参考值显示有偏差UA 3.8-12.5mg/dL，IRI2-43μU/mL，PAI-15.0-75.7ng/mL。
HPLC对各大类脂蛋白及其亚类中血清胆固醇水平的测定的分析性能 如表2所示，我们以脂蛋白颗粒大小(直径)为基础定义了3个VLDL亚类(大、中和小)、4个LDL亚类(大、中、小和极小)和5个HDL亚类(极大、大、中、小和极小)乳糜微粒(＞80nm，峰1-2)、VLDL(30-80nm，峰3-7)、LDL(16-30nm，峰8-13)和HDL(8-16nm，峰14-20)。
表2.各大类血清脂蛋白及其亚类的定义及它们的 胆固醇水平测量的天内精密度(within-day precision)(n＝5) NA.表示无数据。CV，变异系数；CM，乳糜微粒 集合1正常血脂混合血清 集合2高血脂混合血清 用于对正常血脂受试者(TC＝131mg/dL，TG＝39mg/dL)和高血脂受试者(LPL缺乏，TC＝219mg/dL，TG＝1420mg/dL)进行曲线拟合分析的代表性色谱图在图6中给出。
在图6中，代表性的HPLC谱型(a)显示健康女性，(b)显示LPL缺乏患者。将5-μL血清样品注射到2根串连的凝胶渗透柱(TSKgelLipopropakXL)上，用TSKeluent LP-1以0.7mL/min的流速洗脱。实线是TC试剂的在线酶促反应所检测到的真实HPLC谱型。虚线是各个亚类及它们的高斯曲线之和，该曲线为用高斯总和法确定的曲线拟合。血清TC和血清TG水平分别为131mg/dL和39mg/dL(a)及219mg/dL和1420mg/dL(b)。还给出了从所观测到的峰时间确定的颗粒大小(nm)。
对表2所示的2个不同的混合样品(集合(pool)1TC＝177mg/dL，TG＝56mg/dL；集合2TC＝163mg/dL，TG＝428mg/dL)，确定20个亚类和主类别的胆固醇测定的运行内再现性(within-runreproducibility)(n＝5)。
LDL和HDL颗粒大小的运行内再现性(n＝5)，对于集合1分别为25.20±0.07nm(变异系数[CV]，0.27％)和11.25±0.04nm(CV，0.36％)，对于集合2分别为25.63±0.14nm(CV，0.56％)和11.03±0.05nm(CV，0.45％)。
20个高斯曲线的面积之和占原始色谱图下面积的100.2±0.4％(99.1-101.7％，n＝62)。对应于HDL(峰14-20)的峰面积之和占原始色谱图下HDL峰面积的99.741.1％(98.3-103.9％，n＝62)。
获得了沉淀法测出的HDL-C(x)和HPLC测出的总HDL(所有HDL亚类)(y)之间的良好相关性y＝0.975x+5.29(r＝0.973，n＝62，P＜0.0001)。此外，还获得了Friedewald方程计算出的LDL-C(x)和HPLC测出的总LDL(所有LDL亚类)(y)之间的良好相关性y＝0.903x+6.28(r＝0.977，n＝62，P＜0.0001)。
胆固醇HPLC谱图与临床参数的相关性 各大类脂蛋白及其亚类中的胆固醇水平与各种临床参数(年龄、BMI、VFA、SFA、UA、IRI和PAI-1)和血清TG水平的简单相关性在表3中总结。此外，表3还给出LDL和HDL颗粒大小的相关性。
表3.HPLC方法所得胆固醇谱与临床参数的简单相关性(n＝62) 数值是Pearson相关系数 *通过HPLC从LDL和HDL峰时间获得的平均颗粒直径(nm)。
_P＜0.001，_P＜0.01，§P＜0.05 对于年龄，获得了中和小HDL-C的显著负相关性(P＜0.01)。对于BMI，只观察到HDL参数大HDL-C(P＜0.01)和HDL颗粒大小(P＜0.01)的显著负相关性。虽然在SFA和所有脂蛋白亚类之间没有观察到相关性，但VFA与VLDL-C亚类(大、中和小)和LDL-C亚类(中、小和极小)有显著的正相关性(P＜0.01)，与大和中HDL-C、LDL和HDL颗粒大小有负相关性(P＜0.01)。
对于UA，对VLDL-C亚类(中和小)获得了正相关性(P＜0.01)，对大HDL-C和HDL颗粒大小获得了负相关性(P＜0.01)。在IRI情况下，对小和极小LDL-C获得了正相关性(P＜0.01)，对大HDL-C和HDL颗粒大小获得了负相关性(P＜0.01)。对于PAI-1，对小HDL-C和极小HDL-C观察到正相关性(P＜0.01)。对于血清TG水平，VFA与VLDL-C亚类(大、中和小)和LDL-C亚类(小和极小)有显著的正相关性(P＜0.01)，与大LDL-C、HDL-C亚类(大和中)、LDL和HDL颗粒大小有负相关性(P＜0.01)。
传统脂质参数对VFA与脂蛋白亚类之间相关性的影响 在表3的人体测量值当中，VFA水平显示出与脂蛋白亚类最强的相关性。因此，通过分别调整血清TG、血清TC、HDL-C和LDL-C水平来研究传统脂质参数对VFA与脂蛋白亚类之间相关性的影响(表4)。分别调整TG、TC、HDL-C和LDL-C后，VFA与小LDL-C和极小LDL-C的正相关性仍保持显著(P＜0.01)。
表4 HPLC方法所得的胆固醇谱与VFA的部分相关性 数值是Pearson相关系数。
TC、HDL-C和LDL-C是通过酶学方法、沉淀法和Friedewald方程获得的数值。
*通过HPLC从LDL和HDL峰时间获得的平均颗粒直径(nm)。
_P＜0.001，_P＜0.01，§P＜0.05 对于VLDL亚类，简单的相关性分析显示，所有的VLDL亚类都与VFA正相关，但在调整血清TG水平后大VLDL和小VLDL分别与VFA负相关和正相关。在LDL亚类情况下，LDL-C的调整引起大LDL和VFA之间的显著负相关性(P＜0.01)，但消除中LDL和VFA之间的显著正相关性。
LDL-C对VFA和LDL亚类之间相关性的影响 将研究受试者按总LDL-C水平(所有LDL亚类之和)的平均值分成低LDL-C组(n＝31，LDL-C＜130mg/dL)和高LDL-C组(n＝31，LDL-C≥130mg/dL)。如表3所给出，在总人群中(n＝62)，获得了VFA与总LDL-C之间的显著正相关性(r＝0.431，P＜0.001)。VFA与总LDL-C之间在低LDL-C组中没有相关性，但在高LDL-C组中有显著正相关性(r＝0.546，P＜0.002)。VFA与LDL亚类之间的散点图在图7中给出。
在图7中，显示VFA对高LDL-C组(○)和低LDL-C组(●)的(a)大LDL-C、(b)小LDL-C和(c)极小LDL-C的散点图。虚线表示低LDL-C组的线性回归。还给出了低LDL-C组(n＝31)的相关系数和P值。
大LDL-C在总人群和高LDL-C组中没有显示与VFA的显著相关性，但在低LDL-C组中显示显著负相关性(r＝-0.446，P＜0.02)。小LDL-C和极小LDL-C在总人群和两组中显示与VFA的显著正相关性，高LDL-C组中的极小LDL-C除外。
[实施例2] <方法> 受试者 从在1996年12月到1998年12月两年间在日本Yamagata大学医院相续进行心导管术的609名男性中选择62名受试者，排除了接受任何脂质降低药物的人或者患有糖尿病或患有任何肾病和肝病的人。所有受试者在参加本实施例研究前都根据大阪大学医院伦理委员会的要求表示了他们的知情同意。
将选出的年龄为62±9岁(范围41-76岁)的受试者根据是否患有CAD分成两组。在患有CAD的患者组(n＝45)中，21名患者有心肌梗塞(MI)史(急性MI 3人；1个月内的MI 1人；过往MI 7人)，7名患者有劳累性心绞痛，11名患者有血管痉挛性心绞痛，4名患者有不稳定型心绞痛，2名患者没有心脏症状但有明显的冠状动脉狭窄(无症状心肌缺血)。在不患CAD的对照受试者(n＝17)中，4名患者有非典型胸痛，6名患者有心肌病，4名患者有主动脉瓣病变，3名患者有心电图异常。
在本实施例中，定义了以下-1到3的5等级标度以评估血管疾病的严重性-1，没有血管疾病；0，血管疾病伴狭窄＜75％；1，单血管疾病伴狭窄≥75％；2，双血管疾病伴狭窄≥75％；3，三血管疾病伴狭窄≥75％。
在过夜禁食后抽取静脉血。血浆样品保存在冰箱中，在血液收集后7天内进行分析。
HPLC方法 血浆脂蛋白按实施例1描述的方法分析。
其它临床和脂质参数分析 血浆TG用市售试剂盒(Kyowa Medex，日本东京)酶法测定。血浆载脂蛋白A-I、A-II、B、C-II、C-III和E水平用日本东京DaiichiChemicals公司的免疫比浊法测定。空腹血糖(FBS)通过酶学方法测量。用病史档案和调查表获得有关年龄、体重、身高、吸烟史、家族史、高血压、先前的MI、心绞痛、糖尿病和药物使用的资料。体重指数(BMI)从体重和身高计算为(kg)/[身高(m)]2。
统计分析 数据以平均值±SD表示，除非另有规定。用Student t检验确定各组之间差异的统计学显著性。各个变量之间的相关性以Pearson相关系数(r值)给出，P值＜0.05认为有统计学差异。
结果 临床特征、脂质和脂蛋白水平的比较 本研究的62名男性的临床特征、脂质和载脂蛋白水平在表5中显示。对于年龄、BMI、FBS、风险标志(目前吸烟者、高血压和家族史)百分比分布、血浆TC和TG水平，患者组和对照组之间没有显著差异。对于载脂蛋白谱图，在患者组获得显著更高的载脂蛋白B(P＜0.05)和载脂蛋白E(P＜0.01)。
表5 _P＜0.01，§P＜0.05(与对照受试者相比) 数据代表平均值±SD或受试者的数量(％)。
我们通过HPLC后的成分分析确定了3个VLDL亚类(大、中和小)、4个LDL亚类(大、中、小和极小)、5个HDL亚类(极大、大、中、小和极小)中的胆固醇水平，还定义了各大类脂蛋白(总VLDL、总LDL和总HDL)中的胆固醇水平。表6比较了患者组与对照组的各大类脂蛋白及其亚类中的胆固醇水平。
表6 _P＜0.001，_P＜0.01，§P＜0.05 对于各大类脂蛋白，患者组有显著(P＜0.05)更高的总LDL-C和更低的总HDL-C，但在总VLDL-C水平上没有差异。对于脂蛋白亚类，患者组的小VLDL-C(P＜0.001)、小LDL-C(P＜0.05)和极小LDL-C(P＜0.001)显著增加，但大HDL-C(P＜0.001)显著减少。所有传统风险标记、非HDL-C、TC/HDL-C比和LDL-C/HDL-C比都是患者组显著高于对照组。
为了更清楚地区分两个组，从每个亚类计算出几个衍生变量。将在患者组中显著增加的三个亚类(小VLDL、小LDL和极小LDL)合并表示为“Vs+Ls”。“Vs”表示小VLDL中的胆固醇水平。“Ls”表示小LDL和极小LDL中的胆固醇水平之和。增加的亚类(Vs+Ls)和减少的亚类(大HDL)之差或之比分别表示为“Vs+Ls-Hs”和“(Vs+Ls)/Hs”或“Ls/Hs”。“Hs”表示大HDL中的胆固醇水平。
所有这些衍生变量也是患者组显著高于对照组，“Vs+Ls-Hs”显示最强的差异。
各大类脂蛋白及其亚类中的胆固醇水平和衍生变量与血管疾病分数的相关性 各大类脂蛋白及其亚类中的胆固醇水平与血管疾病分数(CAD的指标)的简单相关性在表7中显示。血管疾病分数与小VLDL-C和小LDL-C呈强正相关(P＜0.01)，与大HDL-C呈负相关(P＜0.01)。
表7 数值是Pearson相关系数。
a)VD分数血管疾病分数，-1，没有血管疾病；0，血管疾病伴狭窄＜75％；1，单血管疾病伴狭窄≥75％；2，双血管疾病伴狭窄≥75％；3，三血管疾病伴狭窄≥75％。
_P＜0.001，_P＜0.01，§P＜0.05 我们还研究了血管疾病分数和表6所给出的几个衍生变量之间的相关性。如表7所示，所有变量与血管疾病分数都有高于r＝0.333(n＝62，P＜0.01)的强正相关性，“Vs+Ls-Hs”获得最强的相关性(r＝0.428，P＜0.001)。对于传统的脂质风险标记，血管疾病分数与LDL-C/HDL-C比和TC/HDL-C比显著(P＜0.01)相关，但与非HDL-C不显著相关(结果未给出)。
传统脂质参数对CAD严重性与脂蛋白亚类及其衍生变量的相关性的影响 研究了传统脂质参数对血管疾病分数和脂蛋白亚类及其衍生变量之间的相关性的影响，以评估这些变量对CAD严重性关联的临床有用性。表7显示控制每个传统单变量(TG、TC、HDL-C、LDL-C和载脂蛋白B)或每个组合变量如非HDL-C、TC/HDL-C和LDL-C/HDL-C后，HPLC变量和血管疾病分数之间的部分相关系数。控制血浆TG、TC和HDL-C并不对血管疾病分数和HPLC变量之间的相关性产生很大的影响。另一方面，在控制LDL-C、载脂蛋白B或非HDL-C后，极小LDL-C和血管疾病分数的正相关性变得不显著。调整LDL-C后产生了大LDL-C和血管疾病分数的显著负相关性。控制TC/HDL-C或LDL-C/HDL-C消除了所有的显著相关性，但在控制TC/HDL-C后中VLDL-C和血管疾病分数的负相关性变得显著。即使在控制任何因素后，“Vs+Ls-Hs”和血管疾病分数的正相关性仍保持。此外，除控制TC/HDL-C或LDL-C/HDL-C外，“Vs+Ls”和血管疾病分数的显著正相关性仍保持。
[实施例3] 在本实施例中，用Superose 6HR 10/30柱(Pharmacia生产)和两根TSKgel LipopropakXL柱(Tosoh Corp.生产)分析表8所示的59个样品，然后将获得的结果相互比较。
[表8] 在本实施例中，还用Superose柱(Pharmacia生产)和两根TSKgelLipopropakXL柱(Tosoh Corp.生产)分析表9所示的44个样品，然后将获得的结果相互比较。
[表9] 在本实施例中，20个成分峰的洗脱时间(颗粒大小)如表10所示定义。
表10 对于来自健康受试人的混合血清，图8(a)和(b)显示用Superose6HR 10/30柱获得的分析结果，图9(a)和(b)显示用TSKgelLipopropakXL柱获得的分析结果，图10(a)和(b)显示用SkylightPak-LDL柱获得的分析结果。图8(a)、9(a)和10(a)中描绘的粗线显示胆固醇在分离成成分峰之前的谱图。图8(b)、9(b)和10(b)中描绘的粗线显示甘油三酯在分离成成分峰之前的谱图。
图11显示G7至G20每个峰中所包括的平均胆固醇含量的计算结果，其来自用Superose 6HR 10/30柱对表8所示59名受试者所得的图8(a)所示结果。图12显示G7至G20每个峰中所包括的平均胆固醇含量的计算结果，其来自用TSKgel LipopropakXL柱对表8所示59名受试者所得的图9(a)所示结果。图13显示基于对表8所示59名受试者所得的图11和12所示结果，Superose 6HR 10/30和TSKgelLipopropakXL柱之间对于G7至G13(对应于小VLDL亚类到LDL亚类)各成分峰中所包括的胆固醇含量的比较结果。还有，图14显示基于对表8所示59名受试者所得的图11和12所示结果，两种柱之间对于G14至G20(对应于HDL亚类)各成分峰中所包括的胆固醇含量的比较结果。
在图8(a)、9(a)、11-14中可见，G7至G20这14个成分峰中所包括的胆固醇含量用Superose 6HR 10/30柱或TSKgel LipopropakXL柱证实是大约一致的。
图15显示用TSKgel LipopropakXL柱对表9所示44名受试者所得的图9(a)所示结果当中，G6至G20各峰中所包括的平均胆固醇含量的计算结果。图16显示用SkylightPak-LDL柱对表9所示44名受试者所得的图10(a)所示结果当中，G6至G20各峰中所包括的平均胆固醇含量的计算结果。图17显示基于对表9所示44名受试者所得的图15和16所示结果，TSKgel LipopropakXL柱和SkylightPak-LDL柱之间对于G6至G13(对应于中VLDL亚类到LDL亚类)各成分峰中所包括的胆固醇含量的比较结果。图18显示基于对表9所示44名受试者所得的图15和16所示结果，两种柱之间对于G14至G20(对应于HDL亚类)各成分峰中所包括的胆固醇含量的比较结果。
在图9(a)、10(a)、15-18中可见，G6至G20这15个成分峰中所包括的胆固醇含量用TSKgel LipopropakXL柱或SkylightPak-LDL柱证实是大约一致的。
因此，根据本发明的分析方法，即使在使用任何柱而不论其一些特性如分辨力如何时，都能获得可靠性优越的数据分析结果。而且，如图8(b)、9(b)和10(b)所示，本发明的分析方法可应用于甘油三酯的分析，类似于上述胆固醇的分析。换句话说，根据本发明的分析方法，基于得自胆固醇的检测信号进行定义的成分峰被用来计算有关得自甘油三酯、游离胆固醇、磷脂、载脂蛋白等的谱图的近似曲线。
产业适用性 上文已详细描述到，本发明提供脂蛋白颗粒的分析装置和方法，用该分析装置和方法即使在使用分辨力或分子大小范围不同的凝胶过滤柱时都可以进行多个样品各亚类之间的比较。根据本发明的脂蛋白颗粒分析装置和方法，可以比常规和公知的方法和装置以更高的可靠性获得数据。通过本发明的脂蛋白颗粒分析装置和方法获得的数据，能有效地用于诊断例如由内脏脂肪积累所致的各种疾病，如糖尿病、高血压、高血脂症和冠状动脉疾病。
权利要求
1.一种脂蛋白颗粒分析方法，所述方法包括以下步骤
通过液相色谱分离受试者样品中所含的多种类别脂蛋白，然后检测来自分离脂蛋白颗粒中所包括的成分的信号；
假定每种脂蛋白颗粒由从锚定峰和额外必要峰组成的成分峰推测出的亚类组成，然后用上述检测信号计算对应于成分峰总和的近似曲线。
2.权利要求1的分析方法，其中一个或多个所述锚定峰的洗脱位置通过在代谢疾病患者中观察到的洗脱位置来确定，所述患者的脂蛋白代谢表明VLDL、LDL和HDL的大小范围窄。
3.权利要求1的分析方法，其中所述锚定峰对应于至少一个选自以下的峰洗脱位置在44.5±2.1nm的峰、洗脱位置在36.8±2.5nm的峰、洗脱位置在31.3±1.0nm的峰、洗脱位置在25.5±0.4nm的峰、洗脱位置在23.0±0.5nm的峰、洗脱位置在13.5±0.4nm的峰、洗脱位置在10.9±0.2nm的峰和洗脱位置在9.8±0.2nm的峰。
4.权利要求1的分析方法，其中对所述额外必要峰的洗脱位置和峰宽度进行预设置，以使其以几乎相等的间隔位于所述各锚定峰之间。
5.权利要求1的分析方法，其中所述近似曲线由20个成分峰组成。
6.一种内脏脂肪积累所致疾病的诊断方法，所述方法包括以下步骤
提供得自待诊断受试者的受试者样品；
通过液相色谱分离所述受试者样品中所含的多种类别脂蛋白，然后检测来自分离脂蛋白颗粒中所包括的成分的信号；
假定每种脂蛋白由从锚定峰和额外必要峰组成的成分峰推测出的亚类组成，然后用上述检测信号计算对应于成分峰总和的近似曲线；
分析所述计算出的近似曲线。
7.权利要求6的诊断方法，其中一个或多个所述锚定峰的洗脱位置通过在代谢疾病患者中观察到的洗脱位置来确定，所述患者的脂蛋白代谢表明VLDL、LDL和HDL的大小范围窄。
8.权利要求6的诊断方法，其中所述锚定峰对应于至少一个选自以下的峰洗脱位置在44.5±2.1nm的峰、洗脱位置在36.8±2.5nm的峰、洗脱位置在31.3±1.0nm的峰、洗脱位置在25.5±0.4nm的峰、洗脱位置在23.0±0.5nm的峰、洗脱位置在13.5±0.4nm的峰、洗脱位置在10.9±0.2nm的峰和洗脱位置在9.8±0.2nm的峰。
9.权利要求6的诊断方法，其中对所述额外必要峰的洗脱位置和峰宽度进行预设置，以使其以几乎相等的间隔位于所述各锚定峰之间。
10.权利要求6的诊断方法，其中所述近似曲线由20个成分峰组成。
11.权利要求6的诊断方法，其中所述分析步骤是将大VLDL、中VLDL、小VLDL、中LDL、小LDL、极小LDL、大HDL和中HDL中的胆固醇含量与参考值进行比较。
12.权利要求6的诊断方法，其中所述分析步骤是通过将大LDL中的胆固醇含量与参考值进行比较，将疾病诊断为动脉硬化症。
13.权利要求6的诊断方法，其中所述分析步骤是通过将小VLDL、小LDL、极小LDL和大HDL中的胆固醇含量与参考值进行比较，将疾病诊断为冠状动脉疾病。
14.一种冠状动脉疾病诊断方法，所述方法包括以下步骤
用权利要求1-5中任一项的脂蛋白分析方法分析得自待诊断受试者的受试者样品中所含的脂蛋白；
根据选自(I)-(V)的任一公式计算数值
(I) Vs+Ls-Hs；
(II) Vs+Ls；
(III) Ls；
(IV) (Vs+Ls)/Hs；
(V) Ls/Hs，
其中“Vs”表示小VLDL中的胆固醇含量；“Ls”代表小LDL和极小LDL中的胆固醇含量之和；“Hs”代表大HDL中的胆固醇含量。
15.权利要求14的诊断方法，其中所述分析步骤还包括将计算值与参考值进行比较的步骤。
全文摘要
本发明的脂蛋白分析方法包括以下步骤通过液相色谱分离受试者样品中所含的多种类别脂蛋白，然后检测来自分离脂蛋白中所包括的成分的信号；和假定脂蛋白由从包括锚定峰和额外必要峰的成分峰推测出的亚类组成，然后用上述检测信号计算对应于成分峰总和的近似曲线。
文档编号G01N30/88GK101107519SQ20058004708
公开日2008年1月16日 申请日期2005年11月24日 优先权日2004年11月24日
发明者冈崎三代 申请人:冈崎三代