一种蛋白质芯片的制作方法

专利名称：一种蛋白质芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质芯片。
背景技术：
生物芯片技术是在20世纪90年代兴起的一种高通量分析遗传信息的生物技术。在人类基因组计划的带动下，改进对基因组序列的测定和分析方法就成为生物技术发展的重点。在此基础上，一种全新的杂交测序技术便应运而生。该技术是将一系列错落重叠的寡脱氧核苷酸，以点阵排列固定在一块很小的基片上，形成一个高密度的寡核苷酸微阵列，称为DNA芯片或基因芯片。基因组DNA标记后与芯片上的寡核苷酸杂交，根据全部杂交斑点的已知序列就可以推导出样品DNA的全序列。1994年光导寡核苷酸阵列化学合成法问世，为DNA芯片技术奠定了基础。
DNA芯片包含巨大的信息量，它不仅具有快速测序的能力，而且可以对基因组的信息进行种种分析，因此在生命科学、医学诊断和生物鉴定等方面得到广泛应用。芯片上固定的分子检测器除DNA和寡脱氧核苷酸外，还可以用蛋白质或RNA，以识别待测分子的结构特征。DNA芯片技术获得巨大成功鼓励科学家和公司将此技术用于蛋白质信息分析。蛋白质具有最广泛的生物功能，人们在实践中需要最多检测和鉴定的生物分子可能是蛋白质，因此蛋白质芯片有更广阔的用途。但是蛋白质芯片技术难度远大于DNA芯片。首先，用于制作芯片的蛋白质必需逐个制备，费时费力，既不能体外扩增，也不能原位合成。其次，蛋白质较不稳定，在制作蛋白质微阵列时易受基片表面作用而失去或降低活性。第三，各蛋白质的物理化学性质很不一样，难于使阵列各点蛋白质在同一条件下与样品分子反应。即使存在这些技术上的困难，蛋白质芯片技术还是获得了长足的发展。
蛋白质芯片在蛋白质组学的研究中是一项关键的技术。人类基因组计划的提前完成，使生命科学进入后基因组时代，研究的核心问题已不是基因组的序列，而是基因组编码哪些基因产物？基因产物如何起作用？也即开展结构基因组学和功能基因组学的研究。显然，仅仅研究基因组的结构与功能仍不足以揭示生命的奥秘，因为生物在不同生长、发育和生理条件下都只有一部分基因被表达，而且同一基因在表达过程中经选择性信息加工可以形成不同蛋白质，蛋白质在合成后还可以发生种种化学修饰而改变其性质和功能。这就是说研究细胞的全部蛋白质组成，它们的相互作用以及在不同状态下的变化，具有重要的意义，有关研究即称为蛋白质组学。蛋白质芯片在确定蛋白质组的成分，监测某些蛋白质的变化，找出蛋白质相互识别和作用的关系，是十分有用的工具。
蛋白质芯片通过固定在基片微阵列点上的蛋白质分子检测器，借其与待测分子间的亲和力，捕捉样品中的待测分子，从而达到高通量、快速、灵敏检测的目的。迄今蛋白质芯片都是直接将蛋白质分子固定在芯片表面。
蛋白质芯片在医学诊断、环保监测和法医鉴定中也有重要作用。例如，将各种病原体的抗体做成抗体芯片，可以迅速确定疾病的感染原，而无需反复进行多重排查试验。又如，将细胞cDNA构建成表达文库，然后把全部或与某种疾病相关的部分克隆制作成蛋白质芯片，即可找出疾病过程中蛋白质的变化。蛋白质芯片已在化验、诊断、检疫、环保、刑侦等领域用于各种蛋白质的检测和鉴定。由于制作蛋白质芯片在技术上还存在一些困难，因而限制了它的应用。

发明内容
本发明的目的是提供一种新型的蛋白质芯片，即噬菌体展示蛋白质芯片。
本发明所提供的蛋白质芯片，是由基片和将用作分子检测器(检测探针)的蛋白质展示于表面的重组噬菌体组成，所述重组噬菌体以微阵列固定在基片上(如图1、3)。
展示蛋白质的噬菌体可以是各类细菌噬菌体，最常采用的有丝状噬菌体f1、fd、M13，长尾噬菌体λ，短尾噬菌体T7等。丝状噬菌体的次要外壳蛋白pIII(拷贝数少)和主要外壳蛋白pVIII(拷贝数多)可用于N端展示，次要外壳蛋白pVI(拷贝数少)可用于C端展示。λ噬菌体的外壳蛋白pV和T7噬菌体的p10可用于展示cDNA表达的蛋白质。
用于噬菌体展示的载体有两种类型一种是噬菌体载体，由噬菌体基因组改造而成；另一种是噬菌粒载体，由噬菌质粒改造而成。噬菌体载体的外壳蛋白因与外源蛋白融合而会失去其原有功能，为保持外壳蛋白的功能，需将外壳蛋白基因倍增。其一具野生型功能；另一可与外源蛋白融合。噬菌粒载体删除了噬菌体各基因，只保留与外源蛋白融合的外壳蛋白基因，以及与复制和组装有关的序列，其繁殖有赖于辅助噬菌体。上述载体可以从生物技术公司购买后按需要加以改造，或自己构建。
可按照以下方法将所述用作分子检测器的蛋白质展示于噬菌体表面将用作分子检测器的蛋白质基因通过编码柔性链的序列与噬菌体载体或噬菌粒载体的外壳蛋白基因融合，使用作分子检测器的蛋白质表达并展示在噬菌体表面；所述柔性链具有序列表中序列1的氨基酸残基和序列2的核苷酸序列。
所述噬菌体载体或噬菌粒载体的外壳蛋白基因根据蛋白质展示的功能进行优选。用于淘选，主要选择拷贝数少的外壳蛋白基因；用于检测，主要选择拷贝数多的外壳蛋白基因。对于丝状噬菌体，前者为pIII，后者为pVIII(如图2中A和B)。
所述制成噬菌体展示蛋白质芯片的蛋白质包括抗原和抗体、酶和作用物、配体和受体、活性多肽、cDNA表达的蛋白质。
所述基片可为滤膜、玻片或硅片，以玻片较为价廉合宜。
本发明是将用于检测的蛋白质分子与噬菌体外壳蛋白融合，使其展示在噬菌体表面，然后固定在微阵列点上，制成噬菌体展示蛋白质芯片。通过噬菌体展示而使蛋白质得到克隆，任意蛋白质克隆都可借此方便制成噬菌体展示蛋白质芯片。
本发明的蛋白质芯片突出优点是①展示的蛋白质与其基因存在于同一重组噬菌体内，在获得蛋白质的同时也得到了它的编码基因。②通过克隆技术可以得到单一展示的蛋白质，无需进行逐个蛋白质的分离纯化后处理，并可通过淘选获得各种特异功能的蛋白质克隆。③蛋白质展示于固定在芯片表面的噬菌体之上，消除了芯片表面对蛋白质的影响。各类特定功能的蛋白质都可以与噬菌体外壳蛋白融合，制成噬菌体展示的蛋白质芯片。本发明的新型噬菌体展示蛋白质芯片必将有更广泛的应用前景。


图1为噬菌体展示蛋白质芯片示意2为不同丝状噬菌体展示系统之间的转换图3为重组丝状噬菌体固定在芯片上的原子力显微镜照片图4为正常人和白血病患者白细胞样品的荧光图谱比较图5为pIII和pVIII展示系统强度的比较具体实施方式
下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
用于制备芯片的噬菌体展示库，最常用的是抗体库、随机多肽库和cDNA展示库。噬菌体展示载体可由生物工程技术公司购买，或自己构建。丝状噬菌体展示载体pCANTAB 5E购自Pharmacia，可用于构建噬菌体抗体库和随机多肽库。λ噬菌体载体和体外包装系统Gigapaka Gold III购自Stratagene；T7噬菌体展示系统购自Novagen，此两系统可用于构建cDNA展示库。Novagen公司有已构建好的肝癌、结肠癌、老年痴呆症、肺癌、乳腺癌和正常组织的噬菌体展示cDNA库出售。构建cDNA展示库需要从真核细胞中提取mRNA，以oligo(dT)和随机六核苷酸引物通过RT-PCR合成cDNA。将cDNA插入适宜的噬菌体展示载体，并转化大肠杆菌细胞，收集重组噬菌体，即为cDNA展示库。cDNA编码的蛋白质与外壳蛋白的C端融合，展示于噬菌体表面。从各种展示库中淘选出靶蛋白质克隆，并以微阵列固定在芯片上，即获得各种用途的噬菌体展示蛋白质芯片。
实施例1、噬菌体展示抗体芯片的制作和检测(1)噬菌体展示抗体库的构建将诸多外源抗体基因分别插入噬菌体展示载体即获得噬菌体展示抗体库。具体方法如下从人外周血分离白细胞，提取总RNA，利用整套抗体引物通过RT-PCR合成抗体cDNA。每个抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)之间以柔性链(序列表中序列1)连接，构成单链抗体(scFv)基因，两端引入Sfi I和Not I限制性内切酶识别位点，经双酶切后分别插入pIII展示载体pCANTAB 5E的Sfi I和Not I限制性内切酶识别位点之间，得到重组噬菌体pCANTAB 5E-scFv(图2中A)，用以电击转化大肠杆菌TG1细胞。转化细胞加入辅助噬菌体M13K07，室温静置30分钟，离心沉淀菌体，悬浮于培养基，培养过夜。重组噬菌体繁殖并以出芽方式释放到培养基中。离心除去菌体，上清液加入1/5体积的由20％PEG和2.5M NaCl组成的溶液，冰上放置1小时，再离心即得到噬菌体沉淀。沉淀的噬菌体溶于PBS溶液，经0.45μm滤膜过滤除菌，测定滴度，冰箱保存。
(2)从噬菌体展示库中淘选特异的展示蛋白质克隆构建的噬菌体展示库一般都比较大，通常库容量在108克隆形成单位(cfu)以上，用于制备芯片需要从库中选出用于检测的靶克隆，此过程称为淘选(panning)。从库中挑选出所需要的特异展示蛋白质克隆称为正淘选，从库中淘汰不需要的克隆称为负淘选。
从步骤(1)构建的噬菌体抗体库中淘选识别白细胞表面蛋白的噬菌体抗体克隆，具体方法如下用正常人白细胞对噬菌体抗体库进行五轮细胞淘选。每轮淘选取一定量白细胞加入噬菌体抗体库溶液中，室温放置30分钟，离心沉淀白细胞，洗脱被细胞吸附的重组噬菌体，测定滴度。将洗脱的重组噬菌体再感染大肠杆菌宿主，用辅助噬菌体M13K07感染后回收扩增的重组噬菌体，测定滴度，重复淘选。在五轮淘选过程中对白细胞表面具有特异吸附能力的噬菌体抗体逐步被富集，得到针对白细胞表面共同抗原的噬菌体抗体克隆，其过程如表1所示。
表1正常人白细胞对噬菌体抗体库的细胞淘选

注5份正常人白细胞来自不同人再用白血病患者白细胞对经过正常人白细胞扣除过的噬菌体抗体库进行三轮淘选，即用正常白细胞对噬菌体抗体库进行负淘选，然后用白血病白细胞对噬菌体抗体库进行正淘选，前后进行三轮，获得对白血病白细胞表面抗原特异的噬菌体抗体克隆。白血病白细胞特异噬菌体抗体的富集过程如表2所示。
表2白血病患者白细胞对噬菌体抗体库的淘选过程

注三份白血病患者白细胞来自不同的个体。
(3)噬菌体展示蛋白质芯片的制作和检测丝状噬菌体pIII展示系统的表面展示蛋白拷贝数少，适于淘选高亲和力的展示蛋白；pVIII展示系统的表面展示蛋白拷贝数多，检测能力强，适于制作芯片。由pIII系统淘选到的克隆需按图2所示转变为pVIII系统。将步骤2中用正常人白细胞对噬菌体抗体进行五轮淘选得到的针对白细胞表面共同抗原的噬菌体抗体克隆，和用白血病患者白细胞对经过正常白细胞扣除后的噬菌体抗体库进行三轮淘选得到的针对白血病白细胞特异抗原的噬菌体抗体克隆(存在于pIII展示载体中)，提取重组载体DNA，用Sfi I/Not I双酶切，分离出抗体基因，插入pVIII展示载体中，使噬菌体抗体转换成适于制作芯片的展示系统(图5)。具体方法如下用Sfi I和Not I对pCANTAB 5E-scFv进行双酶切，得到scFv，插入用Sfi I和Not I双酶切的pVIII展示载体pCAU-8，得到pVIII展示载pCAU-8-scFv(如图2所示)。由此得到用于制作芯片的针对白细胞表面共同抗原的噬菌体抗体库，和针对白血病白细胞特异抗原的噬菌体抗体库。
其他噬菌体展示系统也可同样在淘选时用表面展示蛋白拷贝数少的系统，但在制作芯片时转变成拷贝数多的系统。为了简化操作，有时可以用拷贝数适中的系统进行淘选和制作芯片，而无需进行两者的转换。
制作芯片是将淘选到或特殊制备的重组噬菌体，通过偶联剂以微阵列固定在基片上。手工点样效率低，而且规格不易一致；通常都用点样仪或自动化机械臂来制作芯片。
从用于制作芯片的针对白细胞表面共同抗原的噬菌体抗体库，和针对白血病白细胞特异抗原的噬菌体抗体库中各随机挑取48个克隆，用作芯片的检测探针。重组噬菌体溶液滴度分别调整至1012cfu/μL，并在点样前添加十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度0.2％(0.2g/100mL)。将作为检测探针的96份重组噬菌体溶液，和作为阴性对照的2份辅助噬菌体M13K07溶液及2份2％牛血清清蛋白(BSA)溶液，置于384孔板中，固定在操作装置上。使用微阵点样仪ArrayItTMSpotBotRPersonal Microarray Robot(TeleChem International Inc.)，将噬菌体抗体克隆点到环氧基玻片CapitalBioREpoxySlideTM(CapitalBio Corporation)上。每个微阵列由300个点组成，即每个检测探针点三个样，将芯片于37℃固定过夜。利用原子力显微镜(AFM)观察噬菌体与环氧基玻片的偶联情况，扫描采用单晶硅针尖，Tapping模式，以减少由于针尖与表面接触而导致形貌的破坏。结果如图3所示，照片显示重组丝状噬菌体平铺在芯片4μm2表面，表明共价连接的噬菌体能保持其正常生理条件下的细丝状形态，噬菌体呈致密排布，并具有基本相同的取向，这样的固定有利于保持噬菌体的生物活性。
取3名正常人和3名白血病(急性粒细胞白血病)患者白细胞，在100μL含1％(1ml/100mL)Triton-100的磷酸盐缓冲液(PBST)中裂解。将裂解物离心，上清液用Cy3荧光染料(Amersham Biosciences)标记，并用凝胶过滤(FluoroLinkTM-Ab Cy3 labelling kit，Amersham Biosciences)纯化。
将噬菌体抗体芯片用含2％(2g/100mL)BSA的PBS溶液37℃封闭30mim，然后用2％乙酰化BSA的PBS溶液37℃再封闭30min。向每个样品池中加入40μL Cy3标记的白细胞裂解物样品，于37℃保温1h。将芯片用0.1％PBST清洗三次，用PBS清洗一次，最后用微阵共聚焦扫描仪ScanArray Express Microarray Scanner(Perking Elmer)检测微阵点Cy3荧光强度。实验结果如图4所示。在图4中，左上角(A1)和右上角(A20)各3个点均为BSA，左下角(E1)和右下角(E20)各3个点均为M13K07，分别作为蛋白质和噬菌体的空白对照。每一芯片右半边各点为针对白细胞表面共同抗原的噬菌体抗体克隆；左半边各点为针对白血病患者白细胞表面特异抗原的噬菌体抗体单克隆。芯片与正常人和白血病人白细胞提取物反应，结果表明针对白细胞表面共同抗原的噬菌体抗体单克隆(即右半边各阵列点)，对白血病患者样品和正常人样品反应的结果基本相同；然而针对白血病患者白细胞表面特异抗原的噬菌体抗体单克隆(左半边阵列点)，对白血病患者样品和正常人样品反应的结果差异较大。特别是在A6、A9、B1、B7、B8、C2、D6和D9位的荧光探针(重组噬菌体)对白血病样品是特异的，这些斑点在白血病患者样品的检测图谱中具有很强的信号(高出正常人3倍)。也就是说该处的噬菌体抗体对白血病白细胞表面抗原具有特异性，可用于白血病的诊断，还可以进一步找出白血病白细胞表面的特异抗原。
实例2、噬菌体展示多肽库、展示cDNA库和展示多肽芯片(1)噬菌体展示多肽库的构建噬菌体展示多肽库可以参照如下方法进行构建编码随机十五肽的模板序列为5’TTCCGATGCTAAGCTTCGCT(NNK)15GGTGGTGGCTCGGATCCATTC 3’，其中N为等量的A、G、C或T，K为等量的G或T。用5’引物5’TTCCGATGCTAAGCTTCGCT 3’和3’引物5’GAATGGATCCGA GCCACCAC 3’进行PCR，扩增得到双链片段用Hind III和BamH I双酶切，插入丝状噬菌体展示载体，得到含有十五肽编码序列的重组噬菌体。按实施例1的方法转化大肠杆菌TG1，用辅助噬菌体M13K07感染，在SOC-AK培养基内培养过夜。上清液加入1/5体积的由20％PEG和2.5M NaCl组成的溶液沉淀噬菌体，沉淀溶于PBS即为噬菌体展示多肽库，测定滴度并置冰箱保存。
(2)噬菌体展示cDNA库的构建可以参照如下方法进行构建构建cDNA展示库需要从真核细胞中提取mRNA，以oligo(dT)和随机六核苷酸引物通过RT-PCR合成cDNA。将cDNA插入适宜的噬菌体展示载体，并按上述步骤转化大肠杆菌细胞，收集重组噬菌体，即为cDNA展示库。cDNA编码的蛋白质与外壳蛋白的C端融合，展示于噬菌体表面。
(3)噬菌体展示葡激酶突变体库的构建葡激酶是人体纤溶酶原的激活剂，可作为有效的溶栓药物用于血栓病治疗，但它的毒副反应较大，限制了其临床的应用。通过基因突变和重组，获得突变体库，可从中挑选出毒副反应小的突变体。突变体库可以参照如下方法进行构建将葡激酶基因通过DNA改组(DNA shuffling)技术，即将基因切碎并用PCR重新连接，由此得到一系列大大小小改组的葡激酶基因突变体。所有突变体基因插入T7噬菌体展示载体，与外壳蛋白p10基因融合。按照实施例1的方法将该重组噬菌体制成芯片，与人纤溶酶原进行杂交，结果从200多个突变体中得到3个分子量变小并有高亲和力的突变葡激酶，将有助于研制低毒或无毒的新型葡激酶。
(4)从噬菌体展示库中淘选特异的展示多肽或蛋白质克隆可以参照如下方法淘选特异的展示多肽克隆细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1)的主要功能是介导细胞间的粘附作用，在炎症时大量表达于有关细胞表面，与多种机体功能紊乱和疾病有关。寻找ICAM-1的配体，可作为抗炎症的侯选药物。利用丝状噬菌体展示载体构建随机十五肽库，以ICAM-1为靶分子，从随机多肽库中淘选出与它特异结合的十五肽。具体方法如下将ICAM-1溶于0.1mol/L PBS，包被于96孔酶标板孔穴中，用4％脱脂奶粉的PBS溶液(PBSM)封闭后加入噬菌体展示十五肽库溶液，吸附过夜。多次洗涤，除去未吸附的重组噬菌体，回收特异吸附于ICAM-1上的噬菌体十五肽克隆。扩增重组噬菌体，重复上述淘选过程，共淘选四轮，然后检测各配体克隆的亲和力，选出五个亲力最强的克隆。其结果如表3所示。
表3噬菌体展示十五肽克隆的性质

(5)噬菌体展示多肽或蛋白质芯片的制备从噬菌体展示随机多肽库、展示cDNA库和突变体库中，按需要用适当的选择剂进行淘选，可以获得各种特异功能的克隆。将这些克隆参照实施例1的操作步骤，以微阵列固定在芯片上，即制备得到不同用途的噬菌体展示蛋白质芯片。它们或用于检测、或用于诊断、或用于筛选药物。
序列表<160>2<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>2<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 4权利要求
1.一种蛋白质芯片，是由基片和将用作分子检测器的蛋白质展示于表面的重组噬菌体组成，所述重组噬菌体以微阵列固定在基片上。
2.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其中，用于制作噬菌体展示蛋白质芯片的噬菌体包括丝状噬菌体f1、fd、M13，长尾噬菌体λ和短尾噬菌体T7。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质芯片，其制作特征在于按照以下方法将所述用作分子检测器的蛋白质展示于噬菌体表面，即将用作分子检测器的蛋白质编码基因通过柔性链的编码序列与噬菌体载体或噬菌粒载体的外壳蛋白基因融合，使用作分子检测器的蛋白质表达在噬菌体表面；所述柔性链具有序列表中序列1的氨基酸残基序列。
4.根据权利要求3所述的蛋白质芯片，其制作特征在于所述噬菌体载体或噬菌粒载体以次要外壳蛋白或主要外壳蛋白基因与外源蛋白基因融合。
5.根据权利要求3所述的蛋白质芯片，其制作特征在于用作分子检测器的蛋白质包括抗原和抗体、酶和作用物、配体和受体、活性多肽、cDNA表达的蛋白质。
6.根据权利要求3所述的蛋白质芯片，其制作特征在于所述基片为滤膜、玻片或硅片。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白质芯片。该蛋白质芯片，是由基片和表面展示有用作分子检测器的蛋白质的重组噬菌体组成，所述表面展示有用作分子检测器的蛋白质的重组噬菌体以微阵列固定在基片上。本发明将制作芯片的蛋白质展示于噬菌体上，使蛋白质得以克隆免除了分离纯化后处理，并可通过淘选获得各种特异功能的蛋白质克隆，而且还消除了芯片的表面影响，克服了当前蛋白质芯片技术的主要困难。本发明的新型噬菌体展示蛋白质芯片必将有更广泛的应用前景。
文档编号G01N33/68GK101086501SQ20061001219
公开日2007年12月12日 申请日期2006年6月9日 优先权日2006年6月9日
发明者朱圣庚, 赵新生, 毕群, 黄仪秀, 洪龙, 廖玮, 岑晓东, 谭涛超 申请人:北京大学