专利名称：应用特异性靶蛋白检测姜黄素对前列腺癌细胞抑制作用的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，尤其是一种应用特异性靶蛋白检测姜黄素对前列腺癌细胞抑制作用的方法。
背景技术：
前列腺癌是男性死亡率较高的一种恶性肿瘤，雄激素及其受体在前列腺癌的发生发展过程中发挥重要作用。前列腺癌与前列腺特异性抗原(prostatespecific antigen，PSA)关系密切，多数前列腺癌患者无论早期或晚期均有PSA持续表达，高度表达者占90％以上，因此PSA已作为前列腺癌临床诊断和治疗监测的敏感指标之一。PSA的表达受雄激素调节，雄激素进入前列腺上皮细胞后首先与细胞核内雄激素受体蛋白(androgen receptor，AR)结合，引起AR构象改变，随后AR与热休克蛋白解离，受体磷酸化形成二聚体，二聚体与PSA启动子中雄激素应答元件(ARE)结合，诱导PSA基因的转录表达。有些物质可调节AR的表达，例如生长因子使AR增加五倍等。有研究发现雄激素非依赖的前列腺癌中AR同样是非常重要的分子，其作用有待进一步研究。
通过以上分析可知，利用诱导PSA基因转录表达的AR作为特异性靶蛋白来检测姜黄素对前列腺癌细胞抑制作用将具有突出的实际意义，申请人目前还没有发现通过特异性靶蛋白定向检测姜黄素对前列腺癌细胞抑制作用的具体方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用特异性靶蛋白检测姜黄素对前列腺癌细胞抑制作用的方法，该方法具有精确度高、适用性广、特异性强的优点。
本发明应用特异性靶蛋白检测姜黄素对前列腺癌细胞抑制作用的方法由以下步骤组成(1)由姜黄素处理LNCap细胞，显微镜下观察细胞形态变化并进行图像采集；MTT法检测LNCap细胞生长情况；流式细胞技术FCM检测细胞凋亡率；(2)用免疫印迹Western-blotting技术检测雄激素受体AR的表达①由姜黄素处理的前列腺癌雄激素依赖性细胞至少24h后收集，用PBS洗涤三次后加入细胞裂解液，细胞裂解后离心取上清液，沸水浴蛋白变性后Bradford蛋白定量测定蛋白浓度，其合适浓度范围为0.5-2μg/μL；②裂解后所得细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，经电泳后的凝胶于60mA恒流转移，将蛋白质条带转移至硝酸纤维素膜，选用可复性丽春红染液振荡染色，并根据蛋白质Marker比较条带分子量大小去除非特异性条带，先后加入一抗和二抗后，用ECL荧光western-blotting试剂盒显色，显影、定影。
所述的特异性裂解液的组分及其浓度为甘油108mmol/L，曲拉通(TritonX-100)150mmol/L，氯化钠137mmol/L，氟化钠10mmol/L，乙二醇双(a-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)1mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)5mmol/L，焦磷酸钠1mmol/L，三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)20mmol/L，原矾酸钠1mmol/L，SDS 3.7mmol/L，苯甲基磺酰氟(PMSF)1mmol/L，β-磷酸甘油100mmol/L，抑肽酶3.6mmol/L，二硫苏糖醇(DTT)2.8mmol/L，溴酚蓝1.5mmol/L。
本发明的优点和有益效果是1.本发明所公开的一种应用特异性靶蛋白定向检测姜黄素对前列腺癌雄激素依赖性LNCaP细胞是否有抑制作用的方法，其结果证明该方法利用特异性靶蛋白AR、通过癌细胞生长情况和凋亡率检测姜黄素对前列腺癌细胞抑制作用是准确的。同时，也能证明免疫印迹技术在本方法中的具体应用也是可靠的。
2.本发明的方法具有简单和易于推广应用的突出优点。
附图1LNCap细胞原形态特征照片。
附图2经姜黄素处理后的LNCap细胞形态特征照片。
附图3MTT法测定细胞存活率统计图。
附图4western blotting法测定LNCap细胞AR的表达结果照片。
附图5western blotting法测定LNCap细胞常规蛋白(β-actin)结果照片。
具体实施例方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。
实施例一、细胞培养LNCap细胞在37℃，5％CO2条件下培养，培养基为RPMI-1640，含10％新生牛血清及青霉素、链霉素各100U/ml，其形态特征如图1照片所示。
二、姜黄素对LNCap细胞形态的影响以五种浓度的姜黄素分组进行以下操作在生长对数期的LNCap细胞中分别加入浓度为0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L的姜黄素，并分别于0h、12h、24h、48h倒置显微镜下观察LNCap细胞形态，激光扫描共聚焦显微镜摄像系统对各实验组细胞形态进行图像采集，其中姜黄素浓度40μmol/L组24h后细胞形态照片如图2所示。
图2所示照片与图1对照组比较，在显微镜下清楚显示LNCap细胞形态有明显的变化，部分细胞出现凋亡征象，表现为细胞收缩变圆，胞体变小，与周围失去联系，胞膜形成泡状突起，胞质收缩，有典型凋亡小体存在。
三、MTT法测细胞生长曲线LNCap细胞以3.0×104个孔密度接种于96孔细胞培养板中，37℃ 5％CO2培养箱培养，0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L不同浓度的姜黄素分别处理12h、24h、36h、48h终止培养，终止培养前4h加入5mg/mLMTT10μl，终浓度为0.5mg/mL，4h后弃上清液，DMSO溶解MTT结晶，用BiotekMicroplate EJ309酶标测定仪测OD值，检测波长570nm，参考波长为630nm，各组每次测12孔，重复三次取均值，以下式计算细胞相对存活率细胞相对存活率％＝(OD实验组/OD对照组)×100％(以空白组OD值调零)结果进行统计学分析。各组实验均重复3次。
MTT法测的LNCap细胞的存活率，结果如图3所示，从图中可以看出10～40μmol/L的姜黄素都能够抑制细胞的增殖和生长，并且在0h以上都有抑制作用，其中40μmol/L作用24h最强，细胞存活率为对照组的40％。说明40μmol/L的姜黄素最具临床意义。
四、FCM测细胞生长周期分别以浓度为0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L的姜黄素处理LNCaP细胞24h后收集，1000r/m离心10min，PBS洗涤，70％乙醇4℃固定过夜，保存于4℃备用；LNCaP细胞同法洗两次，500目铜网过滤，离心，加PI(碘化丙啶propidium iodide)染色液，4℃避光过夜。流式细胞仪测定DNA荧光强度及散射光参数，激发光波长488nm，并用凋亡软件测定细胞凋亡率及细胞周期分布。
姜黄素可诱导LNCap细胞凋亡，浓度为0、10、20、30、40μmol/L姜黄素作用细胞的凋亡率分别为1.20％、1.22％、2.22％、3.69％和9.23％。其中40μmol/L姜黄素效果最显著，10、20μmol/L姜黄素作用不明显，30μmol/L姜黄素效果优于10、20μmol/L的姜黄素。
五、免疫印迹western blotting检测雄激素受体AR的表达
(1)以浓度为0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L的姜黄素分别处理LNCap细胞，24h后收集细胞，PBS洗涤，用以下组分和重量的裂解液裂解细胞，裂解液组成是甘油108mmol/L，曲拉通(TritonX-100)150mmol/L，氯化钠(NaCl)137mmol/L，氟化钠(NaF)10mmol/L，乙二醇双(a-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)1mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)5mmol/L，焦磷酸钠1mmol/L，三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)20mmol/L，原矾酸钠1mmol/L，SDS 3.7mmol/L，苯甲基磺酰氟(PMSF)1mmol/L，β-磷酸甘油100mmol/L，抑肽酶3.6mmol/L，二硫苏糖醇DTT(DTT)2.8mmol/L，溴酚蓝1.5mmol/L。
裂解细胞后离心取上清液，沸水浴蛋白变性后用Bradford蛋白定量测定试剂初步测定蛋白浓度，浓度为1.5μg/μL。
(2)上述所得细胞总蛋白作SDS-PAGE电泳分析配制8％的分离胶10ml，灌胶后，用0.1％SDS封胶，并静置30min，使其完全聚合；倾出SDS溶液，用双蒸水将未聚合的分离胶冲除，反复数次后，用滤纸吸净；配制4％的浓缩胶5ml插号梳子后灌胶，静置30min后，加入电泳缓冲液(runningbufferTris-base 15.1g，Glycine 94g，SDS 5.0g，溶解于双蒸水中定容至1000ml)，并将加样孔中未聚合的浓缩胶冲除；每加样孔中加入蛋白质样品30μg，在100V电压下进行电泳；取胶做考马斯亮蓝染色45min，脱色液过夜脱色，扫描凝胶保存结果。
(3)经SDS-PAGE电泳后的凝胶于60mA恒流进行转移，转移时间常规蛋白β-actin为45min，AR为1.5h，将蛋白质条带转移至硝酸纤维素膜上，具体过程为将分离胶从电泳仪上剥离，放在事先用电泳缓冲液[三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)5.8g，甘氨酸(Glycine)2.9g，十二烷基硫酸钠(SDS)0.37g，甲醇200ml溶解于双蒸水中定容至1000ml]浸润的滤纸上，并依次覆盖硝酸纤维素膜和滤纸，然后用电泳缓冲液彻底浸润并去除气泡；将处理后的分离胶和硝酸纤维素膜放入电转移槽中，以100V电压转移1h；电转移结束后，可用丽春红染液振荡染色4～5min，取出硝酸纤维素膜，用蒸馏水洗净观察，去除非特异条带。
待蛋白转移至硝酸纤维素膜上，先用TBST(一种混合洗液T表示三羟甲基氨基甲烷，B表示盐酸，S表示氯化钠，T表示吐温-20)将膜洗净，再用TBST配制的含5％的脱脂牛奶封闭1h；取出膜，将膜放入工作液中振荡杂交2～3h，工作液由TBST、脱脂牛奶、鼠抗人AR单抗和鼠抗人β-actin抗体混合组成，其重量比为1000∶5∶1∶0.5。吸去含一抗的工作液后，再用TBST洗涤硝酸纤维素膜三次，每次10min，以去除多余的一抗；之后将膜放入另一工作液中振荡杂交1h，工作液由TBST、脱脂牛奶和含山羊抗小鼠IgG组成，其重量比为2000∶5∶1。吸去含二抗的工作液后，再用TBST洗涤硝酸纤维素膜三次，每次10min，以去除多余的二抗；用PBS洗涤液(Na2HPO41.15g/L，KH2PO40.2g/L，NaCl8g/L，KCl0.2g/L，PH7.4)浸泡、洗膜2～3min，去除TBST中吐温-20(Tween-20)对荧光反应的影响。
(4)化学发光加强ECL系统Western-blotting试剂盒显色剪取一张保鲜膜，将TBST洗涤过的硝酸纤维素膜放在保鲜膜上。将试剂盒中放射性免疫荧光试剂鲁米钠溶液A(Luminol Reagent SolutionA)与放射性免疫荧光试剂鲁米钠溶液B(Luminol Reagent SolutionB)等比例混匀，按照0.125ml/cm2均匀铺在膜的蛋白面，室温下反应1min后，将保鲜膜折叠，连同靶蛋白膜带入暗室进行包括感光、显影、定影等操作。
分别以不同浓度的姜黄素处理LNCap细胞24h后，Western-blot检测AR表达，结果见图4。图4中AR蛋白免疫印迹条带从左到右依次是经过浓度为40μmol/L、30μmol/L、20μmol/L、10μmol/L、0μmol/L的姜黄素处理LNCap细胞的结果。图4清楚显示，姜黄素可抑制AR的表达，并且对AR表达的抑制程度依赖于姜黄素的浓度，其中姜黄素浓度为40μmol/L时抑制效果最好。
图5是western blotting法测定LNCap细胞常规蛋白β-actin结果照片，说明不同浓度的姜黄素对LNCap细胞常规蛋白β-actin没有影响。
上述实施例中姜黄素剂量范围为0～50μmol/L，50μmol/L为最大非毒性剂量，以上剂量范围对检测结果没有影响。
上述实施例中，姜黄素(Curcurmin)购自Sigma公司，前列腺癌细胞LNCap，由本申请人单位保存。ECL系统western-blotting试剂盒购于北京中山生物公司，硝酸纤维素膜购自北京鼎国生物技术发展中心，AR单克隆抗体(鼠抗人)辣根过氧化酶标记的抗体(羊抗鼠)购自北京中山公司。
权利要求
1.一种应用特异性靶蛋白检测姜黄素对前列腺癌细胞抑制作用的方法，其特征在于由以下步骤组成(1)由姜黄素处理LNCap细胞，显微镜下观察细胞形态变化；MTT法检测LNCap细胞生长情况；流式细胞技术FCM检测细胞凋亡率；(2)用免疫印迹Western-blotting技术检测雄激素受体蛋白AR的表达①由姜黄素处理的前列腺癌雄激素依赖性细胞至少24h后收集，用PBS洗涤三次后加入细胞裂解液，细胞裂解后离心取上清液，沸水浴蛋白变性后Bradford蛋白定量测定蛋白浓度，其合适浓度范围为0.5-2μg/μL；②裂解后所得细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，经电泳后的凝胶于60mA恒流转移，将蛋白质条带转移至硝酸纤维素膜，选用可复性丽春红染液振荡染色，并根据蛋白质Marker比较条带分子量大小去除非特异性条带，先后加入一抗和二抗后，用ECL荧光western-blotting试剂盒显色，显影、定影。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于特异性裂解液的组分及其浓度为甘油108mmol/L，曲拉通(TritonX-100)150mmol/L，氯化钠(NaCl)137mmol/L，氟化钠(NaF)10mmol/L，乙二醇双(a-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)1mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)5mmol/L，焦磷酸钠1mmol/L，三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)20mmol/L，原矾酸钠1mmol/L，SDS3.7mmol/L，苯甲基磺酰氟(PMSF)1mmol/L，β-磷酸甘油100mmol/L，抑肽酶3.6mmol/L，二硫苏糖醇DTT(DTT)2.8mmol/L，溴酚蓝1.5mmol/L。
全文摘要
本发明是一种应用特异性靶蛋白检测姜黄素对前列腺癌细胞抑制作用的方法，属于分子生物学领域，本方法利用特异性靶蛋白AR、通过癌细胞生长情况和凋亡率检测姜黄素对前列腺癌细胞抑制作用，其检测结果证明是准确的，同时，也能证明免疫印迹技术在本方法中的具体应用也是可靠的。该方法具有简单和易于推广应用的突出优点。
文档编号G01N33/531GK1936583SQ20061001619
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月23日 优先权日2006年10月23日
发明者杨磊, 呼文亮, 陈立军, 王洪敏, 牟心红, 靳秋月, 姚丽, 锁江蕊, 谢红, 王瑞岷, 王玮, 程世翔, 樊嵘 申请人:中国人民武装警察部队医学院