专利名称：琼脂糖水凝胶固定化酶电极及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化酶电极及其制备方法和应用，具体说是一种琼脂糖水凝胶固定化酶电极及其制备方法和应用。
背景技术：
电化学酶传感器结合了电化学方法的高灵敏性和酶的高选择性，其主要应用是定量检测复杂样品中组分的含量。为了提高电化学酶传感器测定的专一性、灵敏度、准确度、稳定性和使用寿命，研究工作主要集中在构筑酶传感器条件的优化，如选择固定酶的材料、固定方法、适当的媒介体和电极基底材料等。
生物电化学酶传感器的制备中，最关键的技术包括(1)如何将酶固定在电极表面；(2)如何保持固定化酶的催化活性；(3)酶修饰电极能在有机相使用。使用的方法有吸附法，包埋法，自组装法等，其中吸附法容易造成酶的流失，电极寿命短，而自组装法固定酶的量较少，而且制作过程所需的时间较长。所以固定化酶的方法主要是包埋法。使用包埋法，要求固定材料能形成稳定的膜；具有生物亲和性；能保持酶的催化活性等特点。存在的不足是传统的包埋法中所用的凝胶主要有聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚乙烯醇等有机合成高分子材料，这些材料的生物亲合性较差、传质阻力大，制备的酶电极不能用于有机相。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较高的稳定性、响应快和重现性好、能在有机相等特殊条件下使用、应用范围广，可用于化工、医药、环境等行业的安全检测、环保监测、生产过程控制等的琼脂糖水凝胶固定化酶电极，为制备生物传感器寻找新的固定化材料。
本发明的另一目的在于提供上述琼脂糖水凝胶固定化酶电极的制备方法。
本发明的目的还在于提供上述琼脂糖水凝胶固定化酶电极的应用。
本发明的设计思想是琼脂糖在热水溶液中呈粘稠无序的水溶胶，冷却后聚糖链呈螺旋状且聚集成空腔，空腔里含有大量的水。在有机小分子的协同作用下，形成的琼脂糖水凝胶膜具有较强的弹性和较高稳定性。利用琼脂糖这一特性和良好的生物亲和性，制备琼脂糖固定化酶电极。
本发明的技术方案是这样实现的将琼脂糖0.4～0.8克溶解于100mL沸水中，然后室温冷却，配制成琼脂糖水凝胶；将有机溶剂与上述琼脂糖水凝胶按有机溶剂∶琼脂糖水凝胶＝1∶3～1∶6体积比混合后，再与酶溶液等体积混合，搅拌均匀制成混合溶液；滴涂在电极表面，室温干燥，得到琼脂糖固定化酶电极。
本发明可在有机溶剂中加入媒介体，其浓度为0.01mol·L-1，将含有媒介体的有机溶剂，与琼脂糖水凝胶混合(含有媒介体的有机溶剂与琼脂糖水凝胶体积比为1∶3～1∶6)均匀后，再与酶溶液等体积混合，搅拌均匀，滴涂在电极表面，室温干燥，得到含有媒介体的琼脂糖固定化酶电极。
本发明所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甘油、吡啶或环己烷等。
本发明所述的酶为血红蛋白、肌红蛋白、过氧化物酶、过氧化氢酶、酪氨酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶或乙醇脱氢酶等。
所述的媒介体为二茂铁及其衍生物；锇、钌有机配合物；醌类或有机染料等。
本发明利用琼脂糖在有机小分子的协同作用下，形成稳定的膜，能将酶固定在电极表面；而且琼脂糖水凝胶具有较好生物亲和性，为固定化酶提供良好的微环境，保持酶的催化活性；琼脂糖膜在水溶液和有机溶液中均较稳定。
由于本发明制备的琼脂糖水凝胶具有网状结构，加入有机溶剂后，加速了凝胶化过程，使琼脂糖水凝胶溶胀效应小，具有较强的弹性、高稳定性和良好的生物亲和性，制备的酶电极响应稳定。制备酶电极时，将酶、媒介体与琼脂糖水凝胶混合均匀成膜，制备的酶电极响应快，稳定性和重现性好，使用寿命长，准确度高，精密度好，测量范围宽。在水相、含水有机相和有机相中，能催化还原有机氯化物、过氧化物、酚和一氧化氮等。
本发明制备的酶电极使用范围广，在水相、含水有机相和有机相中均能工作且均具有生物催化活性。因为琼脂糖水凝胶为包埋在凝胶内的酶提供微水环境，保持酶的原始构象和催化活性，同时酶不易泄漏出来，所以该酶电极具有较高的稳定性。
图1为实施例1的琼脂糖水凝胶包埋血红蛋白的原子力显微形貌。
图2为实施例1的血红蛋白修饰电极检测六氯乙烷的循环伏安图。
图3为实施例2的肌红蛋白修饰电极检测NO2-的循环伏安图。
图4为实施例3的辣根过氧化物酶修饰电极检测氢过氧化叔丁基的循环伏安图。
具体实施例方式
实施例1制备血红蛋白修饰电极。琼脂糖(0.4g，agarose，Sigma)溶解于100mL沸水中，然后室温冷却，配制成0.4％的水凝胶，将琼脂糖水凝胶和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(agarose∶DMF＝4∶1)，与血红蛋白溶液(1.34×10-4M)等体积混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨电极表面，罩上有孔的小管，室温干燥约8小时。该电极具有优异的性能，响应时间快(30秒)；使用寿命长(30天)；准确度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有机相和有机相中，能检测一氧化氮，过氧化物和氯代乙烷，测量范围宽。
实施例2制备肌红蛋白修饰电极。琼脂糖(0.4g，agarose，Sigma)溶解于100mL沸水中，然后室温冷却，配制成0.4％的水凝胶，将琼脂糖水凝胶和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(agarose∶DMF＝4∶1)，与肌红蛋白溶液(2.04×10-5M)等体积混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨电极表面，罩上有孔的小管，室温干燥约8小时。该电极具有优异的性能，响应时间快(30秒)；使用寿命长(30天)；准确度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有机相和有机相中，能检测一氧化氮，过氧化物和氯代乙烷，测量范围宽。
实施例3制备辣根过氧化物酶修饰电极。琼脂糖(0.4g，agarose，Sigma)溶解于100mL沸水中，然后室温冷却，配制成0.4％的水凝胶，将琼脂糖水凝胶和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(agarose∶DMF＝4∶1)，与辣根过氧化物酶溶液(7.82×10-5M)等体积混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨电极表面，罩上有孔的小管，室温干燥约8小时。该电极具有优异的性能，响应时间快(30秒)；使用寿命长(30天)；准确度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有机相和有机相中，能检测过氧化物，测量范围宽。
实施例4制备过氧化氢酶修饰电极。琼脂糖(0.4g，agarose，Sigma)溶解于100mL沸水中，然后室温冷却，配制成0.4％的水凝胶，将琼脂糖水凝胶和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(agarose∶DMF＝4∶1)，与过氧化氢酶酶溶液(6.53×10-5M)等体积混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨电极表面，罩上有孔的小管，室温干燥约8小时。该电极具有优异的性能，响应时间快(30秒)；使用寿命长(30天)；准确度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有机相和有机相中，能检测过氧化物，测量范围宽。
实施例5制备二茂铁为媒介体的辣根过氧化物酶修饰电极。琼脂糖(0.4g，agarose，Sigma)溶解于100mL沸水中，然后室温冷却，配制成0.4％的水凝胶。将媒介体二茂铁溶于有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，浓度为0.01mol·L-1，然后将二茂铁的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液与琼脂糖水凝胶混合(体积比为1∶5)均匀后，再与辣根过氧化物酶溶液(7.82×10-5M)等体积混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨电极表面，罩上有孔的小管，室温干燥约8小时。该电极具有优异的性能，响应时间快(30秒)；使用寿命长(30天)；准确度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有机相和有机相中，能检测过氧化物，测量范围宽。
图2、图3、图4中，横坐标为相对于饱和甘汞电极(SCE)的电位(E)，单位为V，纵坐标为电流(I)，单位为微安(μA)。
图2中，六氯乙烷浓度分别为(mM)为(a)0，(b)0.3086，(c)0.6098，(d)0.9036。
图3中，NO2-的浓度(mM)分别为(a)0，(b)3.64，(c)16.82(d)33.10。
图4中，氢过氧化叔丁基的浓度(M)分别为(a)0，(b)0.045，(c)0.089，(d)0.13。
琼脂糖是D-半乳糖和3，6脱水的L-半乳糖连接构成的多链糖(图1所示)。在热水溶液中，琼脂糖呈粘稠无序的水溶胶，冷却时聚糖链呈螺旋状且聚集成空腔，空腔里含有大量的水。琼脂糖水凝胶具有较强的弹性、高稳定性和良好的生物亲和性，是固定蛋白质的理想生物聚合物，常用于生物大分子的分离。琼脂糖水凝胶具有一定的孔径，底物分子能自由扩散至琼脂糖凝胶中，与固定化的蛋白质作用。
利用琼脂糖水凝胶将血红蛋白、肌红蛋白、过氧化物酶和辣根过氧化物酶固定在玻碳电极表面，形成稳定的血红素蛋白质-琼脂糖膜修饰电极。在琼脂糖膜中，血红蛋白、肌红蛋白、过氧化物酶和辣根过氧化物酶等血红素蛋白质直接与电极之间传递电子。
在水凝胶之中加入适量的二甲基甲酰胺，增强了琼脂糖水凝胶的凝胶化过程，将蛋白质牢固地固定在电极表面，而且能促进蛋白质与电极之间的电子传递。
血红素蛋白质-琼脂糖修饰电极在乙醇、DMSO和DMF等亲水性有机溶剂与水的混合溶液中，也表现出直接电化学和催化活性，表明有机溶剂并没有较大地影响蛋白质的构象及其催化功能，说明琼脂糖水凝胶中含水空腔在保持蛋白质构象和活性诸方面起了重要的作用。
本发明的修饰电极还包括以下应用(1)在水溶液中，血红素蛋白质-琼脂糖修饰电极催化还原H2O2、NO和NO2-，能用于这些物质的定量检测；(2)在乙醇/水的混合溶液中，血红素蛋白质-琼脂糖修饰电极催化还原NO、有机过氧化物和氯代乙烷，能用于这些物质的定量检测。
(3)在水溶液中和乙醇/水的混合溶液中，血红素蛋白质-琼脂糖修饰电极能催化还原氧气，能作为生物燃料电池的正极。
权利要求
1.一种琼脂糖水凝胶固定化酶电极，其特征在于将琼脂糖溶解于沸水中配制成琼脂糖水凝胶；将琼脂糖水凝胶与有机溶剂混合后，再与酶溶液混合制得混合溶液；将此混合溶液滴涂在电极基底表面，室温干燥，得到琼脂糖固定化酶电极。
2.根据权利要求1所述的琼脂糖水凝胶固定化酶电极，其特征在于所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甘油、吡啶或环己烷。
3.根据权利要求1所述的琼脂糖水凝胶固定化酶电极，其特征在于所述酶是血红蛋白、肌红蛋白、过氧化物酶、过氧化氢酶、酪氨酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶或乙醇脱氢酶。
4.根据权利要求1所述的琼脂糖水凝胶固定化酶电极，其特征在于在所述有机溶剂，为含媒介体的有机溶剂，所述媒介体为二茂铁及其衍生物；锇、钌有机配合物；醌类或有机染料。
5.一种权利要求1所述的琼脂糖水凝胶固定化酶电极的制备方法，其特征在于将琼脂糖0.4～0.8克溶解于100mL沸水中，然后室温冷却，配制成琼脂糖水凝胶；将有机溶剂与上述琼脂糖水凝胶按1∶3～1∶6体积比混合后，再与酶溶液等体积均匀混合；将此混合溶液滴涂在电极表面，室温干燥，得到琼脂糖固定化酶电极。
6.根据权利要求5所述的琼脂糖水凝胶固定化酶电极的制备方法，其特征在于在所述有机溶剂中加入媒介体得含有媒介体有机溶剂，将含有浓度为0.01mol·L-1媒介体的有机溶剂，与琼脂糖水凝胶按1∶3～1∶6体积比混合后，再与酶溶液等体积均匀混合；将此混合溶液滴涂在电极表面，室温干燥，得到含媒介体的琼脂糖固定化酶电极。
7.一种权利要求1所述的琼脂糖水凝胶固定化酶电极在水溶液中催化还原H2O2、NO和NO2-，及其定量检测这些物质中的应用。
8.一种权利要求1所述的琼脂糖水凝胶固定化酶电极在乙醇/水的混合溶液中催化还原NO、有机过氧化物和氯代乙烷，及其定量检测这些物质中的应用。
9.一种权利要求1所述的琼脂糖水凝胶固定化酶电极在水溶液中和乙醇/水的混合溶液中，催化还原氧气，作为生物燃料电池的正极的应用。
全文摘要
本发明提供一种琼脂糖水凝胶固定化酶电极及其制备方法和应用。将琼脂糖0.4～0.8克溶解于100mL沸水中配制成琼脂糖水凝胶，将琼脂糖水凝胶与有机溶剂混合后，再与酶溶液混合制得混合溶液，将此混合溶液滴涂在电极基底表面，室温干燥，得到琼脂糖固定化酶电极。本发明利用琼脂糖的特性和良好的生物亲和性，制备琼脂糖固定化酶电极。本发明制备的酶电极使用范围广，在水相、含水有机相和有机相中均能使用且均具有生物催化活性。该酶电极响应快，稳定性和重现性好，使用寿命长，准确度高，精密度好，测量范围宽。
文档编号G01N27/327GK1869674SQ200610019470
公开日2006年11月29日 申请日期2006年6月25日 优先权日2006年6月25日
发明者刘慧宏 申请人:襄樊学院