专利名称：香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一个植物病原真菌的检 测引物及其检测方法。
背景技术：
香蕉镰刀菌枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病，是由镰刀菌 侵染引起维管束坏死的土传性病害，病原菌为尖镰孢霉古巴专化 型[Fwfln謡0，/ or腿 f. cw6mse (E.F.Smith) Snyder et Hansen] (FOC)。病原菌从受伤的根茎侵入，通过寄主维管束 向茎上发展，并进一步向假叶部蔓延。当植株枯死后，病原菌随 残体遗留在土壤中，随着水流或带菌的农具在蕉园内再进行自然 传播，其厚垣孢子可在土壤中存活8 — 10年。由于该菌存活期长， 传播迅速，尚未有防止该病的特效药物，因此一旦在香蕉产地发 病，很可能大面积爆发将造成重大损失。
尖镰刀菌古巴专化型有4个生理小种，l号小种(racel)感 染香蕉的栽培种"大蜜哈"[Grosmichel (AAA)]及龙牙蕉 (MusaAAB)，矮蕉[Dwarfcavendish (AAA)]较抗病，该小种 呈世界分布，在中国大陆已有记录；2号小种(race2)在中美 洲，仅感染三倍体杂种梭香蕉[Bluggoe (AAB)]，不侵染"大蜜
哈"；3号小种(race3)感染野生的羯尾蕉属(Heliconia); 4号 小种(race4)能感染几乎所有的香蕉种类，如Cevendish、"大 蜜哈"、矮香蕉、野蕉(BB)和梭指蕉，毁灭性最大，在全世界 范围内尚末找到有效的抵抗4号小种的香蕉品种。
香蕉枯萎病对目前世界香蕉生产已造成重大威胁，因而，如 何控制该病原菌的进一步蔓延成为目前防控香蕉枯萎病的关键。
发明内容
本发明的目的是针对现有防控香蕉枯萎病的不足，提供一种 香蕉枯萎病菌4号生理小种快速检测引物。
本发明的另一个目的是提供利用上述引物检测香蕉枯萎病 菌4号生理小种的方法。
本发明的香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物RF4，其核 苷酸序列如下所示
RF4國1: 5'曙TGCGGGTCCTATTAGTAC-3' RF4-2: 5' -GGTCCTCACACTCCAATC-3'。 利用上述检测引物RF4检测香蕉枯萎病菌4号生理小种的 方法，包括如下步骤设计引物RF4浓度、模板DNA、 dNTPs、 TaqDNA聚合酶及PCR退火温度梯度，然后进行PCR反应，反 应结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
上述检测方法所述PCR反应各组分和最佳用量为
模板DNA 1体积
10 XPCR Buffer 2.5体积
Mg2+ 25mmol/l 2.5体积
Taq酶 5U/|iL 灭菌ddH20
DNTPs 25mM
引物RF4-1 引物RF4-2
2体积 1体积 l体积
0.2体积
14.8体积;
所述PCR反应程序为94。C4min; 94。C30s， 52。C30s， 72 。C45s，重复35个循环；72°C10min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明采用特
异引物RF4并优化反应条件，建立了香蕉枯萎病菌4号生理小 种的PCR检测方法，该方法能够特异、灵敏、有效的检测香蕉 枯萎病菌4号生理小种。利用该方法能够检测到相当于O.ljig的 菌丝，并且从香蕉的根和茎中均能够检测到病原物。
图1为引物RF4扩增的FOC4的核酸序列(R1-F4)图2为PCR检测的灵敏度结果图3为PCR检测纯病菌结果图4为PCR检测香蕉不同组织结果图5为PCR检测采集于番禺的样品结果图6为PCR检测采集于中山的样品结果图7为PCR检测采集于江门、高州的样品结果图8为PCR检测采集于番禺、中山和江门的吸芽结果其中，图1中划线部分为引物RF4的序列。图2中，M-DL2000; 1^7:香蕉枯萎病菌4号小种FOC4总DNA稀释梯度
(10U—IO力)；8:清水对照。图3中，M: DL2000; 1—15:香 蕉枯萎病菌4号小种FOC4; 16:香蕉枯萎病菌1号小种FOCI; 17.番茄枯萎病菌FOL; 18.西瓜枯萎病菌FOM; 19.苦瓜枯萎病
菌；20.菜豆枯萎病菌；21.棉花枯萎病菌；22.小麦赤霉病菌；23.
胶孢炭疽病菌；24.清水对照。图4中，
M: DL2000; 1—2:病根；3—4:病茎；5—6:病叶；7:清水 对照；8:健康植株对照。图5中，M: DL2000; 1—30:样品 扩增效果；31:清水对照；32:健康植株对照。图6中，M: DL2000; 1一16:样品扩增效果；17:清水对照；18:健康植株对照。图 7中，M: DL2000; 1—4:江门的样；5—6:高州的样；31:清 水对照；32:健康植株对照。图8中，M: DL2000; 1 — 15:番 禺的样；16 — 23:中山的样；24—25:江门的样；26:清水对照； 27:健康植株对照。
具体实施方式
实施例1
1、 PCR体系的建立
设计引物浓度、模板、dNTPs、 TaqDNA聚合酶及PCR退 火温度梯度，用以检测各反应条件对扩增效果的影响，具体如
下
模板DNA lul
10 XPCR Buffer 2.5ul Mg2+ (25mrno1/1) 2.5ul
dNTPs (25mM) 2ul
引物RF4-1 lul
引物RF4-2 lul
Taq酶(5U/pL) 0.2ul
灭菌ddH20 14.8ul
总体积 25ul
在冰上配制好反应体系，混合均匀后，按如下PCR程序进 行扩增94°C4min; 94°C30s， 52°C30s， 72°C45s，重复35个循 环；72。C10min。 4。C保存。
PCR反应结束后，取5^1PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检 测，再将特异性片段回收、克隆、测序，得到香蕉枯萎病菌4 号生理小种的特异性片段的核酸序列如图1。图1中划线部分为 引物RF4的序列。
利用DNAStar分析软件(Demonstration system DNASTAR. V5.0 )进行序列处理、分析，然后在NCBI (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)上用BLAST程序进行核酸序 列同源性比较。结果未找到与此序列有同源性的片段。
2、 PCR检测的灵敏度
取50mg新鲜菌丝抽提总DNA溶于50|al TE中，抽提液用 双蒸水以IO倍梯度稀释后进行PCR扩增，电泳结果(图2)表 明DNA抽提液在稀释104倍后仍能扩增出903bp的特异条带， 即引物RF4能够检测出相当于O.lpg的菌丝。
3、 引物的特异性
利用引物FR4对香蕉枯萎病菌4号和1号小种及其近似菌株 进行扩增后电泳检测结果(图3)表明引物RF4能扩增FOC4得 到903bp的特异性目的片段，而其它菌株及清水对照未出现条带， 由此说明引物具有较高的特异性。
4、 PCR检测香蕉组织
用引物RF4对带菌的香蕉的不同组织进行扩增时，发现引物 RF4能有效的对香蕉的根和茎进行检测，得到特异的扩增产物。 而叶片、清水对照和健康的香蕉组织未得到目的片段。(图4)
5、 PCR检测方法的应用
用所建立的PCR鉴定体系，对采自广东省番禺、中山、江 门和高州的具枯萎病典型症状的香蕉的根、茎及吸芽进行检测， 电泳结果表明在番禺采集的30个样中，有26个样扩增出目的 片段(图5);中山的16个样中，有14个样扩增出目的片段(图 6);江门的4个样中有3个扩增出目的片段以及高州的2个样检 测都为阳性(图7);从这几个地方采集的25个芽中，有11个 扩增出目的片段(图8)。这说明所建立的PCR检测方法可以有 效的检测出FOC4，同时也说明在这些地区存在该病害的危害。
SEQUENCE LISTING
<110>华南农业大学
<120>香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物及其检测方法 <130>
<160> 2
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211>
<212> DNA <213>人工引物
<400> 1
RF4-1: 5' -TGCGGGTCCTATTAGTAC-3'
RF4-2: 5' -GGTCCTCACACTCCAATC-3'
<210> 2 <211>903 <212> DNA <213>人工序列 <400>2
tgcgggtcct attagtacag aatcaagagg agctcacccc ttgacaacaa ctgagaagcc 60 tgaaagcaat gggccaagtg ccgggccaca gtacatagcg cctgaccatg ccgctagact 120 gtatgggacg tagatgacgg aaaactgttg ggcaggcagt tagtggctag acaatatggt180
gaaactagag aaaaccttgt attaccatgt cagtaaggct cgcagcgcca gtggcgaggc 240
atgggcttcc gaagaagcct tgcaggaaac gaatgatgag gaatccagca aagctctctg 300
tcaatgccgc tccgacgcag aggagattga agatggcgaa ggtaataatg tagatcgggt 360
tacgtccgat gtagggaatt tcgctgagcg gagagaaaag tagcggccca aatccatctg 420
tagattctca tcagcctcta tcgaaagtcg tgaccgtaat tgagaaagcc cacatccgag 480
aacgtaaagg gcgagaccta acgatgctgc tgtttctgtg acgctgaact cttgcatgac 540
ctgtctatac actgatttag tgtgcatcgt cctcatgtct aagaaagctt tgacgtaccc 600
gacgcttgga acgtaaatcg acgacccgca atagatggta aaagtgtaca agctgtttaa 660
aaagaggttt ggtttcagca aggttcaggc ggtgatgggg atgcgtcaaa cgagttacca "0
gattagggcg gccacggcgg tcttcctcat cgtagaccaa ttgtgaggat tttcagcatc 780
atcgtgcgat ttcctgcgct tgccgtgaga aaaaagaaac aaagactaat agcgtaacac 840
ttgtcactca ccatccaaca agtatgcaat catcctctag ctgaagattg gagtgtgagg 900
acc 90权利要求
1、香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物RF4，其核苷酸序列如下所示RF4-15’-TGCGGGTCCTATTAGTAC-3’RF4-25’-GGTCCTCACACTCCAATC-3’。
2、 利用权利要求1所述检测引物RF4检测香蕉枯萎病菌4 号生理小种的方法，包括如下步骤设计引物RF4浓度、模板 DNA、 dNTPs、 TaqDNA聚合酶及PCR退火温度梯度，然后进 行PCR反应，反应结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检 测。
3、 如权利要求2所述的方法，其特征在于PCR反应各组分和用量为-模板DNA 1体积10 X PCR Buffer 2.5体积Mg2+ 25mmol/l 2.5体积DNTPs 25mM 2体积引物RF4-1 l体积引物RF4-2 l体积Taq酶 5U/|iL 0.2体积灭菌ddH20 14.8体积;所述PCR反应程序为94。C4min; 94°C30s， 52°C30s， 72 。C45s，重复35个循环；72。C10min。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一个植物病原真菌的检测引物及其检测方法。本发明采用特异引物RF4并优化反应条件，建立了香蕉枯萎病菌4号生理小种的PCR检测方法，该方法能够特异、灵敏、有效的检测香蕉枯萎病菌4号生理小种。利用该方法能够检测到相当于0.1μg的菌丝，并且从香蕉的根和茎中均能够检测到病原物。
文档编号G01N27/26GK101113467SQ200610036319
公开日2008年1月30日 申请日期2006年7月3日 优先权日2006年7月3日
发明者廖林凤, 王振中 申请人:华南农业大学