专利名称：：一种分离富集磷酸化肽的方法
技术领域：
：本发明涉及磷酸化肽的分离富集，具体地说是一种磷酸化肽的高选择性、特异性的富集和纯化方法，该方法应用于蛋白质磷酸化的分析及使用于该方法的磷酸酯锆修饰的载体的构建方法。
背景技术：
：翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组中研究的热点课题。蛋白质磷酸化是最常见，最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节者生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，神经活动，肌肉收縮，新陈代谢，肿瘤发生等，蛋白质磷酸化还是目前所知道的信号的主要传递方式。蛋白质磷酸化分析的传统方法如放射性同位素标记，Edman降解以及薄层层析等方法。这些方法操作繁琐，需要高超的实验技巧和较多的蛋白质，而且存在潜在的放射性危险。质谱技术已经发展成为鉴定磷酸化蛋白的重要工具之一。质谱在鉴定磷酸化蛋白现在仍然是一个巨大的挑战，其具体体现在第一，磷酸化蛋白在细胞内所有蛋白的低丰度；第二，磷酸化肽的负电性使其在质谱检测中难以质子化；第三，酶解产物中存在的大量的非磷酸化肽的质谱信号通常会淹没磷酸化肽的离子信号。因此，直接用质谱分析复杂蛋白酶解产物中的磷酸化肽是非常困难的，一般要求将磷酸化肽分离纯化后再用质谱分析。磷酸化肽的富集使用最多的是固定化金属螯合亲和色谱(Immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)。在这禾中技术中，——般采用将螯合剂亚氨基二乙酸键合在色谱基质上，然后利用螯合作用将Fe3+、G^+等金属离子固定在色谱基质上。由于磷酸化肽中的磷酸基团与固定化的F^+等金属离子有较强的相互作用而保留在色谱基质上获得分离。这种方法的缺点是特异性不强，一些酸性肽也会被富集起来，从而干扰对磷酸化肽的检测。为了提高分离富集磷酸化肽的特异性，近来Ti02和Zr02微柱，Al(OH)3，Fe304/Ti02壳孔纳米颗粒等也被用来纯化和富集磷酸肽。但是利用磷酸酯锆与磷酸肽之间的相互作用来富集和纯化磷酸化肽未见报道。文献l(文献1.Katz.H.E等，"Quaterthiophenediphosphonic(QDP):ARigid,Electron-RichBuildingBlockforZirconium-BasedMultilayers",《ChemistryofMaterials》P699-703(1991年))中记载利用锆与磷酸酯基团之间的相互作用构建磷酸酯锆多层结构的方法；而文献2(文献2,GuillaumeNonglation等，"NewapproachtoOligonucleotideMicroarraysUsingZirconiumPhosphonate誦ModifledSurfaces",《JournalofAmericanChemicalSociety〉〉，P1497-1502(2004年))中记载了利用磷酸酯锆与磷酸基团之间的强相互作用，将磷酸酯锆固载在芯片表面后用于DNA的微阵列的制备。而磷酸酯锆用于磷酸化肽的富集和纯化，文献中未作任何记载，也未作任何启示。
发明内容本发明的目的在于提供一种基于磷酸酯锆与磷酸化肽相互作用的高选择性、高特异性的分离和富集磷酸肽的新方法。为实现上述目的，申请人仔细研究了磷酸酯锆作为配位化合物对磷酸化肽的相互作用，发现金属锆离子能够强烈的与磷酸化肽进行配位作用。基于这种独特的极强的配位作用，磷酸化肽能够特异的保留在磷酸酯锆修饰的表面上。因此，本发明采用的技术方案为一种分离富集磷酸化肽的方法，将磷酸酯锆固载于载体表面用于磷酸化肽的富集和纯化。其中磷酸酯锆固载于载体表面的过程可按本领域常规方法操作。所述载体为芯片或多孔硅晶片，磷酸酯锆固载于芯片或多孔硅晶片表面进行磷酸化肽的富集和纯化；以芯片为载体时，以直接磷酸化肽被富集在芯片表面，所捕获的磷酸化肽可利用MALDI-TOF质谱实现原位检测，从而避免了样品的损失，适合对微量的磷酸化肽的分析。所述载体为色谱基质或硅胶，磷酸酯锆固载于色谱基质或硅胶表面作为固定相用于磷酸化肽的富集和纯化；以色谱基质为载体时，磷酸酯锆修饰的色谱基质能够作为色谱填料，用于磷酸化肽的富集和纯化，实现大规模的磷酸化肽的分离提纯。本发明磷酸化肽分离富集方法基于磷酸酯锆与磷酸化肽的相互作用；所述的方法有很高的特异性，可用于生物样品中低丰度磷酸化肽段的纯化和富集。图1为磷酸酯锆修饰的多孔硅的方法以及用于磷酸化肽富集、纯化和检测的示意图2为磷酸酯锆修饰的多孔硅对磷酸化蛋白a-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的富集和纯化的MALDI质谱图；磷酸化肽的序列见表1;图3为磷酸酯锆修饰的多孔硅对磷酸化蛋白P-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的富集和纯化的MALDI质谱图；磷酸化肽的序列见表2;图4为磷酸酯锆修饰的多孔硅晶片与IMAC粒子对磷酸化肽的富集和纯化效果的比较(a)未经处理直接分析，(b)经磷酸酯锆修饰的多孔硅晶片处理，(c)经IMAC粒子处理。样品为P-酪蛋白酶和牛血清酶解产物的混合物，二者之间的比例为l:10;磷酸化肽的序列见表2;图5为磷酸酯锆修饰的硅胶对磷酸化蛋白a-casein酶解产物中磷酸化肽的富集和纯化的MALDI-TOF质谱；图6为磷酸酯锆修饰的多孔硅对磷酸化蛋白p-casdn酶解产物中磷酸化肽的富集和纯化的MALDI-TOF质谱。具体实施例方式本发明方法的最大特征在于利用磷酸酯锆与磷酸化肽的相互作用实现磷酸化肽的特异性富集和纯化。在实施方式上，可以分成两类一类是芯片模式，一类是色谱基质模式。在芯片模式中，磷酸酯锆固载在芯片表面，磷酸化肽被吸附在芯片表面而获得分离；在色谱基质模式中，磷酸酯锆固载在色谱基质上，磷酸化肽被保留而获得分离。以下分两类具体介绍具体实施方式。1、基于磷酸酯锆修饰的芯片用于磷酸化肽的富集芯片经过磷酸酯锆修饰后用于磷酸化肽的富集。以下以磷酸酯锆修饰的多孔硅晶片为例说明本发明的磷酸化肽富集的方法，捕获的磷酸化肽用MALDI-TOF质谱检测。附图1给出了磷酸酯锆修饰的多孔硅的方法以及用于磷酸肽富集、纯化和检测的示意图。本例以硅晶片为芯片，但是所述芯片材料并不限于硅晶片，其它材料如聚合物、石英、玻璃、金属都可以使用；本例以MALDI-TOF质谱为检测手段，但检测手段不局限于MALDI-TOF质谱，其它检测技术如荧光检测、电化学也可以使用；本例为单点芯片，该发明同样可以适用于阵列芯片。实施例1-1利用磷酸酯锆改性的多孔硅晶片实现磷酸化肽的富集磷酸酯锆修饰的多孔硅的制备低电阻的多孔硅晶片剪裁成lcmx1cm大小的硅片，在自制的聚四氟乙烯的反应池中加入乙醇/49%氟化氢(2:3，v/v)的溶液反应100秒，铂丝作为阴极，硅片作为阳极，在250W冷光源的照射下，电流强度为4mA/cm2。反应之后的多孔硅进一步在含有30%的双氧水中继续氧化1分钟，然后再在5%氟化氢的乙醇溶液中二次刻蚀1分钟。电化学制备的多孔硅放入50mL20%HN03溶液中氧化反应2小时，然后用超纯水清洗。所制备的多孔硅晶片在60mL20%HCl溶液中进行酸化，在轻微的搅拌下反应6小时，温度控制在80°C。所获得的多孔硅晶片放置在有干燥剂五氧化二磷的真空干燥箱中进行干燥过夜，温度控制在110°C。经过干燥过的多孔硅晶片放入装有经过钠丝干燥过的60mL甲苯溶液中，加入6mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，N2保护下反应12小时。获得的多孔硅晶片分别用甲苯，丙酮清洗。获得的氨基化终止的多孔硅晶片置于包含40mMP0C13，40mM2,4,6-三甲基吡啶的20mL无水乙腈中反应12小时，加入到40mL的三乙胺中获得磷酸终止的多孔硅晶片，所获得的多孔硅晶片置于20mM的ZrOCl2水溶液中反应12小时，得到磷酸酯锆修饰的多孔硅晶片。所获得的多孔硅晶片用二次水清洗，保存于4。C冰箱中备用。样品溶液的制备lmg的a-酪蛋白和(3-酪蛋白的分别溶解在lmL，50mM的碳酸氢胺溶液中(pH8.2)，按照与胰蛋白酶的质量比40:1的比例加入胰蛋白酶迸行酶解反应，反应时间为16h,酶解温度控制在37t:。获得的蛋白酶解溶液置于-3(TC冰箱中保存备用。磷酸化肽的富集及MALDI分析磷酸酯锆修饰的多孔硅晶片首先用5pL，200mM的NaCl溶液清洗，消除多孔硅表面的静电吸附，上述磷酸化蛋白a-酪蛋白和P-酪蛋白的酶解液分别溶解在50%ACN，0.1%TFA，100mMNaCl溶液中(pH2-3)，然后取2pL的样品溶液沉积在磷酸酯锆修饰的多孔硅晶片表面，作用15min，然后依次用含1mL50%ACN,100mMNaCl，0.1%TFA的溶液和1mL50%ACN的溶液清洗5min,然后2pL含有1%H3P04的DHB(25mg/mL)溶液加入到多孔硅晶片表面，使其与捕获的磷酸化肽形成共结晶，待干燥之后，所获得的多孔硅晶片用导电胶贴在MALDI靶上进行质谱分析。所有的MALDI-TOF质谱分析在布鲁克Autoflex飞行时间质谱仪上(Bruker,Bremen,Germany)完成，质谱仪上装有延时离子萃取装置，脉冲激光的波长为337nm。实验中得到的质谱数据都在线性正离子检测模式中进行。质谱分子量的较正采用外标法.，从标准物血管紧縮素n和胰岛素链B的例子信号对质谱校正。实验中，每个质谱是30个激光点的累加。分析结果由图2和图3可见，来自于磷酸化蛋白ct-酪蛋白和P-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽被磷酸酯锆修饰的多孔硅晶片所捕获，而非磷酸化肽被洗脱，说明磷酸酯锆修饰的表面能特异的富集和纯化磷酸化肽。比较例1-1与固定化金属离子亲和色谱(IMAC)填料的比较磷酸化肽的富集及MALDI分析固定化金属离子亲和色谱(IMAC，购于PerSeptiveBiosystems(Framingham，MA,USA)仍然是最常用的磷酸化肽段的富集方式。IMAC填料用于选择性富集磷酸化肽段从磷酸化蛋白P-酪蛋白酶解溶液中添加干扰物非磷酸化蛋白牛血清白蛋白的酶解混合物中。10pL活化过的IMAC(30mg/mL)粒子加入10pL混合蛋白酶解液，室温平衡30min,然后用100含有20%ACN,1%aceticacid的水溶液清洗，再加入10)iLNH40H(pH10.5)洗脱结合的磷酸肽，冷冻干燥。2jiL含有1%H3P04的DHB(25mg/mL)溶液加入到冷冻的干燥管中，取0.5pL溶液沉积在MALDI靶上，待自然干燥后进行质谱分析。用磷酸酯锆修饰的多孔硅晶片富集和纯化磷酸化肽的过程如实施例1-1。样品为卩-酪蛋白酶和牛血清白蛋白酶解产物的混合物，二者之间的比例为1:10。分析结果所获得的MALDI-TOF质谱图见图4。样品中存在大量的非磷酸化肽，很明显IMAC用于磷酸化肽段的富集时特异性不高，很多非磷酸化肽也获得了富集；而磷酸酯锆修饰的多孔硅晶片则显示了更好的抗干扰性，基本上只有磷酸化肽被富集，说明磷酸酯锆修饰的表面即使在大量非磷酸化肽的存在下也能高特异性的富集磷酸化肽。2、基于磷酸酯锆改性的色谱基质用于磷酸化肽的富集色谱基质经过磷酸酯锆改性后用于磷酸化肽的分离富集。本例以磷酸酯锆改性的多孔硅胶为例来说明磷酸化肽的富集，但色谱基质并不仅局限于硅胶，其它色谱基质如琼脂糖颗粒、有机聚合物颗粒、无机物颗粒以及无机和有机聚合物整体柱基质也可以使用；洗脱下来的磷酸化肽可以直接用质谱等检测器检测，也可以经过进一步分离后检测。实施例2-l利用磷酸酯锆改性的多孔硅胶实现磷酸化肽的富集磷酸酯锆改性的硅胶的制备称取硅胶，加入50mL20。/。HCl溶液，110°C加热回流4小时。过滤，用去离子水洗涤到pH7.0。然后将处理过的硅胶放入真空干燥室，110。C放置过夜。将此干燥过的硅胶加到50mL经钠丝干燥的甲苯中，搅拌，在N2保护下，升温到12(TC。加入3mL3-氨丙基三乙氧基硅垸，加热回流12小时。过滤，分别用甲苯、丙酮洗涤多次后，放入真空干燥室中，60"C放置过夜。将此合成好的氨丙基硅胶放入干燥器内备用。将2g合成的氨丙基硅胶加到到50mL干燥乙腈中，加入0.21mL三甲基吡啶和0.15mLPOCl3，室温下搅拌12h。反应完成后，过滤，分别用乙腈、去离子水洗涤5次，将反应后的硅胶放入干燥箱中。将硅胶从真空干燥箱中取出，加至40mL0.2mol/L的ZrOCl2溶液中，搅拌12h，过滤，去离子水洗涤5次，60。C真空过夜。称取10mg磷酸酯锆改性的硅胶填充于0.5mm内径的固相萃取柱中备用。样品的制备与分析:ct-酪蛋白和(3-酪蛋白的酶解液(10—6M)分别用1%HAC稀释100倍，取100pL酶解液分别通过磷酸酯锆修饰的硅胶固相萃取柱，然后依次分别用300pL的500mMNaCl，1%HAC溶液；300pL的75%ACN，1%HAC溶液；300的1%HAC溶液淋洗吸附了磷酸化肽的磷酸酯锆的硅胶填充的固相萃取柱，最后用300pL"/c)NH4OH洗脱负载的磷酸化肽，冷冻干燥，2nL含有1%H3P04的DHB(25mg/mL)溶液加入到干燥过的离心管中，取0.5nL溶液沉积于MALDI靶上，形成共结晶，进行MALDI-TOF质谱分析。分析结果由图5和图6可见，来自于磷酸化蛋白(i-酪蛋白和P-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽被磷酸酯锆改性的硅胶所保留，而非磷酸化肽被洗脱，说明以磷酸酯锆为固定相的色谱填料能特异的富集和纯化磷酸化肽。表l.在(X-酪蛋白酶解液中检测到的磷酸化肽<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2.在3-酪蛋白酶解液中检测到的磷酸化肽<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage9</image>釘-i、2I0>3《211、U、212〉<221>(，I.I(T<222>(l)..(ll)<22:1〉IhrV"lAspM('l(;hiTlirVnll'licThrl,ysIr'10、210〉1<2I1>l()<22i>(曹i,i(:r、222>(O..(l())<H2:i〉。100''I(;hi'llir(;hi(;lu/\siiSet.l,vsLysir)io、211、II<2i:!>'iflS乐A<22()>"!22>(l)..(ll)<m(i,、r'圾l'lTl"-ValAspM(，l(;luThr(;liiVail'heTin'UsI5")<2I1>l:!<2l:!>'i酷虽A<22()><221>CONFLICT<222>(I)..(13)<223><化(>>(''Vil(U"Lc".(;lullnVail，roAsnAiaGliiAi.gI510<2I(>>7《212>l'KT<22()>"2l>CONFLICT《222>(l).."'l)<'l()()>7Tyi'Leu(;lyTyrLeulieValProAsnAlaGluGliiArg1510<21()>H<21l>15<212><22l>aiN卜'l,l(:T"22〉U)..(l!i)<'")()>8Asplie(;'yGliiSwT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