专利名称：：尿酸氧化酶的酶活性分析方法
技术领域：
：本发明属生物
技术领域：
，尤其涉及尿酸氧化酶的活性分析方法。
背景技术：
：尿酸是人体内嘌呤类化合物代谢的最终产物，血尿酸水平取决于尿酸产生和排泄之间的动态平衡。尿酸的生成增加或尿酸排泄减少时都可导致血中尿酸盐浓度升高。血浆尿酸饱和度37℃，pH7.4时为380～420μmol/L(6.4～7.1mg/dL)。临床上血尿酸含量升高与以下情况有关(1)白血病及其他恶性肿瘤，由于恶性细胞增殖周期快、核酸分解加强，因此血中尿酸升高。肿瘤化疗后血尿酸升高更明显。子痫病人也可升高。(2)痛风是核蛋白和嘌呤代谢失调所致，其病人血尿酸可明显升高。(3)急慢性肾小球肾炎及肾功能受损，一般伴有血清尿酸增高。(4)有些疾病如牛皮癣、肉瘤可导致血尿酸升高。(5)肝疾病，氯仿、四氯化碳及铅中毒，饮酒等均可使血尿酸水平增高。(6)有些药物如乙胺丁醇、水杨酸盐。高尿酸血症是由于体质的遗传、饮食，尤其是尿酸的根源嘌呤体摄取过多，或者是酗酒、压力等其中两种以上的原因组合而产生的。高尿酸血症如果放任不管时，除了癌症以外，与糖尿病、高血压、肥胖或高胆固醇血症等几乎所有的成人病都有密切的关系。也可能导致肾障碍、动脉硬化、脑中风、心脏病等严重的疾病，因此是非常重大的代谢异常症状。尿酸氧化酶(尿酸氧化还原酶，EC1.7.3.3，UrateOxidase，Uricase)是将尿酸氧化为尿囊素的酶，在自然界普遍存在，是最古老的一种酶。大多数哺乳动物体内，该酶参与嘌呤代谢，氧化尿酸。人类和一些灵长类动物体内缺乏有活性的尿酸氧化酶，因此尿酸是人类和这些动物嘌呤代谢的最终产物。尿酸氧化酶氧化尿酸为溶解度更高的尿囊素，而且作用迅速。研制重组尿酸氧化酶制剂应用于临床，可使适用人群预防和治疗高尿酸血症，同时提高生活质量，可获得良好的社会效益和经济效益。但重组产品发挥治疗作用的关键是酶活性的高低。1992年，Legoux等在《TheJournalofBiologicalChemistry》杂志第267卷第12期发表了题为《CloningandExpressioninEscherichiacolioftheGeneEncodingAspergillusflavusUrateOxidase》的论文，其中采用的酶活性分析方法为分光光度法，通过在酶提取物存在下尿酸溶液292nm的吸收值降低计算酶活性。反应混合物采用pH8.9的TEA缓冲液，加入50μl尿酸氧化酶提取物和0.18μmol尿酸，终体积3ml。酶活性单位定义为在30℃和pH8.9，每分钟将1μmol尿酸转化为尿囊素的酶量。来自法国Sanofi-Synthelabo公司的科研人员AlainBayol等在《DrugDevelopmentandIndustrialPharmacy》杂志2004年第30第8期上发表了一篇题为《StabilizationofRasburicaseandPhysico-ChemicalCharacterizationoftheResultingInjectableFormulation》的文章，关于酶活性分析的方法参考了Legoux等建立的方法，酶活性单位定义为在30℃和pH8.9，每分钟将1μmol尿酸转化为尿囊素的酶量。上述方法采用20％的KOH终止酶反应，随着时间样品吸光度逐渐下降，而且有线性关系。经线性回归，每分钟292nm吸收值降低约0.001个单位，代入酶比活性计算公式引起的酶比活性变化是0.075EAU，对酶活性的分析误差为0.41％，即使分析在10分钟内完成，仅放置时间就使分析误差达到5％。实验动物大多数体内本身具有内源性尿酸氧化酶，给药后外源性酶活性的变化很难了解，而且血清在292nm的吸收值很高，干扰反应后紫外分光光度法的应用。因此，就有必要建立稳定可靠的尿酸氧化酶活性分析方法和适合于外源性尿酸氧化酶体内酶活性的测定方法。
发明内容为了解决实验动物体内本身具有内源性尿酸氧化酶，干扰酶反应后紫外分光光度法的应用，同时解决KOH终止酶反应分析误差大的技术缺陷，本发明的目的是提供一种稳定可靠，适合于外源性的尿酸氧化酶活性分析方法。为了达到上述的目的，本发明采用了以下的技术方案尿酸氧化酶的酶活性分析方法，包括体外酶活性分析和体内酶活性测定，体内酶活性测定是通过给体内不含尿酸氧化酶的动物体内注射尿酸氧化酶后采集血清，然后再进行体外酶活性分析。作为优选，所述的体内不含尿酸氧化酶的动物为高等灵长类、鸟类、两栖类动物。作为优选，体外酶活性分析为采用酶反应，酸终止液终止后紫外分光光度法进行尿酸氧化酶的体外酶活性分析。作为再优选，紫外分光光度法测定采用检测波长为280～300nm。作为优选，终止液是硫酸、盐酸、硝酸、醋酸、磷酸、三氯乙酸、三氟乙酸中的一种或多种混合物，酸的浓度为0.1～10mol/L。作为最优选，终止液为3.5mol/L的硫酸。作为优选，酶反应的温度为25～37℃，pH为6.0～10.0，尿酸浓度为10～200μmol/L，酶量为0.01～5μg/mL，反应时间1～30min。作为优选，酶反应温度30℃，pH8.9，尿酸浓度为60μmol/L，酶量为0.2μg/mL，反应时间5min，检测波长292nm。上述的尿酸氧化酶氨基酸序列可以是来源于细菌、真菌、酵母、植物、动物的尿酸氧化酶。作为优选，所述的尿酸氧化酶氨基酸序列是来源于枯草杆菌、黄曲霉、假丝酵母、果蝇、鼠。动物体内给予外源性尿酸氧化酶后，不同时间取血清进行酶活性分析。动物采用高等灵长类动物如猴子、类人猿、鸟类、两栖类等体内不含尿酸氧化酶的动物体，可排除动物体内内源性尿酸氧化酶的影响。解决了由于血清成分十分复杂，蛋白质浓度比较高，还含有色素等，5mL酶反应液中即使加入0.1mL血清，酶反应结束有用20％KOH终止反应，292nm的吸收值就达到1.5，大大超过了分光光度法的测定范围的技术缺陷。本发明的实验动物体内不含尿酸氧化酶，适合于了解外源性制剂的酶活性在动物体内的变化情况。酶反应结束后用酸终止反应，产物吸收值在分光光度法的测定范围内，大大减小了误差。图1为实施例1鸡给药后体内酶比活性变化情况示意图。具体实施例方式实施例11.测定的基本原理尿酸氧化酶能够在体外一定的条件下特异性地将尿酸氧化为尿囊素，尿酸在尿酸氧化酶的氧化分解作用下浓度的降低反映了酶活性的高低。本法依据尿酸氧化酶氧化尿酸为尿囊素，尿酸的最大吸收波长292nm，氧化产物尿囊素的最大吸收波长224nm，两者最大吸收波长不同，在一定范围内尿酸292nm吸收值与其浓度成正比，可用分光光度法进行尿酸的定量的测定。选择合适的酶和底物尿酸浓度，pH8.9，30℃反应一定时间，以不同浓度的尿酸标准品对292nm的吸收值制定标准曲线，根据反应体系292nm吸收值的降低以标准曲线计算反应氧化分解的尿酸量，再计算出单位时间单位质量的尿酸氧化酶氧化分解的尿酸量，即为该条件下酶的比活性。建立尿酸氧化酶的酶活性分析方法，反应总体积为5ml，反应起始尿酸0.4μmol，反应温度30℃，pH8.9，时间5min，反应结束后用分光光度法测定292nm吸收值，通过吸收值的降低计算转化的尿酸，再计算酶活性。动物体内给予尿酸氧化酶后不同时间采集血样，并收集血清进行酶活性分析。酶活性的变化反应了尿酸氧化酶在动物体内代谢情况。2.实验材料及设备A、测活缓冲液7.5g三乙醇胺、0.38gEDTA溶于900ml去离子水，用6mol/L的盐酸调pH8.9后定容至1000ml。B、尿酸标准液33.6mg尿酸用1000ml测活缓冲液溶解配制成200μmol/L贮液。C、反应终止液3.5mol/L硫酸。E、紫外分光光度计。F、供试品含尿酸氧化酶的动物血清。G、其他试管、移液管、恒温水浴锅、秒表。3.测定方法A、鸡静脉注射尿酸氧化酶，给药剂量分别为0.2mg/kg和0.4mg/kg，给药后0.5h、1h、3h、5h、10h、20h分别取血收集血清。B、取测活缓冲液2.5ml，加入尿酸贮液2ml，混匀后置30℃水浴平衡5min。C、向上述反应液中加入0.1ml动物血清，混合均匀后于30℃反应5min。D、反应结束后加入0.5ml反应终止液终止反应。E、按紫外-可见分光光度计操作说明在波长292nm处测定吸收度。F、取测活缓冲液2.5ml，加入尿酸贮液2ml和0.5ml反应终止液，再加入0.1ml血清样品，混合均匀后于30℃反应5min后做为反应管尿酸起始值，取测活缓冲液4.5ml和0.5ml反应终止液，再加入0.1ml供试品，混合均匀后做为样品空白。G、取尿酸标准液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml分别置于试管中，分别加测活缓冲液4.0ml、3.5ml、3.0ml、2.5ml、2.0ml使终体积为4.5ml。混匀后置30℃水浴平衡5min。加入0.5ml反应终止液和0.1ml未给药动物血清，吸收度测定方法同步骤“D”。H、确量取4.5ml测活缓冲液，30℃水浴平衡5min，加入0.5ml反应终止液和0.1ml未给药动物血清作为空白对照。I、标准曲线尿酸浓度对应其吸收度，求直线回归方程，将测得供试品反应管吸收度代入直线回归方程，即得供试品反应管尿酸的浓度。根据注射的酶量计算比活性。4.结果计算A、标准曲线以5ml反应管中尿酸微摩尔数m为横坐标，A292nm吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归A292＝Km。B、酶活性计算酶活性(EAU)单位定义30℃，pH8.9，每分钟将1μmol尿酸氧化为尿囊素所需的酶量。酶比活性(SA，SpecificActivity)每毫克蛋白质所含的酶活性单位数。SA=100*(A0-As)K*C*V]]>式中C为酶浓度mg/mL；V为给药体积；A0为起始吸收值As为反应后的平均吸收值；K为标准曲线的线性回归系数；C、鸡给药后体内酶比活性变化情况见图1。实施例2酶反应体积5ml，缓冲液TEA(7.5g三乙醇胺；0.38gEDTA)，pH8.9，尿酸60μmol/L，30℃保温，反应时间5min，分别用20％KOH和3.5mol/L硫酸终止反应，检测波长292nm。具体测定方法如实施例1。不同时间测定，结果见表一。表一不同终止方法吸收值变化实施例3酶反应体积5ml，缓冲液TEA(7.5g三乙醇胺；0.38gEDTA)，pH10，尿酸180μmol/L，35℃保温，反应时间25min，用9mol/L硫酸终止反应，检测波长292nm。具体测定方法如实施例1。权利要求1.尿酸氧化酶的酶活性分析方法，包括体外酶活性分析和体内酶活性测定，其特征在于体内酶活性测定是通过给体内不含尿酸氧化酶的动物体内注射尿酸氧化酶后采集血清，然后再进行体外酶活性分析。2.如权利要求1所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于所述的体内不含尿酸氧化酶的动物为高等灵长类、鸟类、两栖类动物。3.如权利要求1或2所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于体外酶活性分析为采用酶反应，酸终止液终止后紫外分光光度法进行尿酸氧化酶的体外酶活性分析。4.如权利要求3所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于紫外分光光度法测定采用检测波长为280～300nm。5.如权利要求3所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于终止液是硫酸、盐酸、硝酸、醋酸、磷酸、三氯乙酸、三氟乙酸中的一种或多种混合物，酸的浓度为0.1～10mol/L。6.如权利要求5所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于终止液为3.5mol/L的硫酸。7.如权利要求3所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于酶反应的温度为25～37℃，pH为6.0～10.0，尿酸浓度为10～200μmol/L，酶量为0.01～5μg/mL，反应时间1～30min。8.如权利要求7所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于酶反应温度30℃，pH8.9，尿酸浓度为60μmol/L，酶量为0.2μg/mL，反应时间5min，检测波长292nm。9.如权利要求1或2所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于所述的尿酸氧化酶氨基酸序列是来源于细菌、真菌、酵母、植物、动物的尿酸氧化酶。10.如权利要求9所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于所述的尿酸氧化酶氨基酸序列是来源于枯草杆菌、黄曲霉、假丝酵母、果蝇、鼠。全文摘要本发明属生物
技术领域：
，尤其涉及尿酸氧化酶的活性分析方法。尿酸氧化酶的酶活性分析方法，包括体外酶活性分析和体内酶活性测定，体内酶活性测定是通过给体内不含尿酸氧化酶的动物体内注射尿酸氧化酶后采集血清。体外酶活性分析为采用酶反应，酸终止液终止后紫外分光光度法进行尿酸氧化酶的体外酶活性分析。本发明的实验动物体内不含尿酸氧化酶，可排除动物体内内源性尿酸氧化酶的影响。适合于了解外源性制剂的酶活性在动物体内的变化情况。酶反应结束后用酸终止反应，产物吸收值在分光光度法的测定范围内，大大减小了误差。文档编号G01N33/96GK1840689SQ200610049079公开日2006年10月4日申请日期2006年1月16日优先权日2006年1月16日发明者刘国安,刘沐荣,康经武申请人:杭州北斗生物技术有限公司