专利名称：同时测定鱼肉中复方磺胺甲噁唑及代谢物的液相色谱法的制作方法
技术领域：
本发明涉及磺胺类抗菌药的测定方法；具体的说是采用高效液相色谱法同时测定鱼肉中磺胺甲噁唑(SMZ)、乙酰化代谢产物(乙酰化磺胺甲噁唑，NSMZ)和甲氧苄啶(TMP)的方法。
背景技术：
磺胺甲噁唑(又称新诺明)是水产养殖病害防治上广泛使用的药物，通常与磺胺增效剂甲氧苄啶配伍使用；磺胺甲噁唑在鱼体内的代谢除了原形药物磺胺甲噁唑以外，乙酰化磺胺甲噁唑是其主要代谢产物，在体内残留时间较长。因此，研究磺胺类药物在水产品中残留时，检测其乙酰化代谢产物和增效剂的含量是非常必要的。目前，有关磺胺甲噁唑等磺胺类药物的检测多使用高效液相色谱法，相关报道如下(1)、制药行业的相关报道袁枚等(2005、广州惠华动物保健品有限公司)报道用反相高效液相色谱法同时测定复方新诺明水溶性粉中的磺胺甲噁唑和甲氧苄啶；池玉梅等(2001、南京中医药大学)报道高效液相色谱法同时测定复方新诺明注射液中磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的含量。以上方法样品前处理较简单，不涉及从组织中提取药物的样品前处理过程，方法不适合药物在水产品中的含量检测。
(2)、医学和兽医领域的相关报道崔艳莉等(2003、广西兽药监察所)报道高效液相色谱法同时测定猪血浆中的磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑和甲氧苄啶；丁晨光等(1997、解放军大连医学高等专科学校)报道高效液相色谱法测定人血浆中的磺胺甲噁唑和甲氧苄啶。水产动物不同于哺乳动物，在蛋白组分和脂肪含量上存在较大差异，样品基质不同会影响分析方法的回收率和干扰检测。
(3)、水产领域的相关报道徐维海等(2004、中国科学院海洋研究所)报道了水产品中包括磺胺甲噁唑在内的14种磺胺类药物残留的高效液相色谱法；郭根和等(2005、福建省农业科学院)报道高效液相色谱法测定对虾中五种磺胺类药物残留；林海丹等(2003、广州出入境检验检疫局)报道动物源性食品中磺胺类药物残留的固相萃取高效液相色谱测定法；郑宗林等(2005、上海水产大学)报道中华绒螯蟹血淋巴内磺胺甲噁唑的测定；刘长征等(2004、中国水产科学研究院长江水产研究所)报道水产品中磺胺甲噁唑和甲氧苄啶含量的高效液相色谱法测定。这些相关的报道大多仅涉及磺胺类药物本身的检测，没有涉及增效剂甲氧苄啶和乙酰化代谢产物三者的同时检测，所采用的样品前处理方法也与本发明不同。
发明内容
本发明提供了一种同时测定鱼肉中磺胺甲噁唑、乙酰化磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的高效液相色谱方法，具有灵敏、准确、可靠的特点。
实现本发明的技术方案如下它的技术方法包括样品制备、样品前处理、标准溶液的配制、流动相配制及色谱条件A、样品制备采集鱼的肌肉组织样品，用剪刀初步剪碎，用高速均质器均质，冷冻保存。
B、样品前处理样品解冻后，准确称取鱼肉组织，加入0.3mol/L盐酸，静置1小时，加入无水硫酸钠，后加入二氯甲烷/丙酮混合液(3∶1比例)，4℃冰箱静置8-12小时后，用高速均质器均质，再用二氯甲烷-丙酮混合液清洗均质器的刀头(均质)，合并2次的提取液，充分振荡，离心(4000-6000r/min离心5-10min)，取出全部上清液，剩余残渣再加入二氯甲烷/丙酮提取，充分振荡，离心(4000-6000r/min离心5-10min)，取上清液与第一次提取液合并，提取液在33-35℃下用氮气吹干，残渣用流动相溶解，加入正己烷充分震荡，静置一段时间，弃去正己烷，下层液用微孔滤膜(0.22μm或0.45μm)过滤后进高效液相色谱仪测定。
C、标准溶液的配制分别准确称取200mg磺胺甲噁唑、200mg乙酰化磺胺甲噁唑和200mg甲氧苄啶标准品一起溶于100mL流动相中，配成同时含有三种药物的母液(200μg/mL)，于冰箱中4℃保存，临用前再依次稀释成系列梯度的标准溶液。
D、流动相配制及色谱条件取乙腈、重蒸水、冰醋酸按20∶80∶0.5(v/v/v)的比例配制流动相，超声波脱气30min后备用。
所用色谱条件a、色谱柱选用规格为4.6mm×250mm C18ODS柱；b、柱温25-30℃；c、流速0.8-1.0mL/min；进样量10-20μL；d、紫外检测波长272nm；e、流动相为水∶乙腈∶冰醋酸＝80∶20∶0.5。
本发明具有以下优点1、本发明方法能够同时检测鱼肉中的磺胺甲噁唑、乙酰化磺胺甲噁唑和甲氧苄啶，可节省大量的人力、物力和时间，降低了检测成本。
2、加入盐酸有助于药物从鱼肌肉组织蛋白上解离，提高回收率；二氯甲烷-丙酮作为提取液，对三种药物均有较好的提取效果，同时浸出杂质少且易排除基质干扰；浓缩温度低于35℃，满足磺胺类药物耐热性差的特点；加入二氯甲烷/丙酮后冰箱放置8-12小时不仅能够充分提取肌肉组织中的药物，而且使蛋白质变性充分，减少提取过程的损失，提取效果理想。
3、本方法中，磺胺甲噁唑、甲氧苄啶及乙酰化磺胺甲噁唑药物峰与杂峰能较好分离，最低检测限可达0.005、0.01、0.005mg/kg，准确度和精密度高。
图1鱼肉空白样品的液相色谱2加入磺胺甲噁唑、乙酰化磺胺甲噁唑和甲氧苄啶标样的鱼肉空白样品的液相色谱图1-甲氧苄啶；2-磺胺甲噁唑；3-乙酰化磺胺甲噁唑具体实施方式
下面通过实施例结合附图详细叙述本发明的技术内容它的技术方法包括样品制备、样品前处理、标准溶液的配制、流动相配制及色谱条件
A、样品制备采集鱼的肌肉组织样品，用剪刀初步剪碎，用高速均质器均质，放入塑料离心管中，密封冷冻保存。
B、样品前处理取15支15ml塑料离心管，分别加入解冻后的空白肌肉组织1g，放入塑料离心管中，加入不同浓度的标准液(0.5、2.0、10.0、50.0、200.0μg/mL)各0.1mL，每个浓度设3个平行，使三种药物在1g肌肉组织中的浓度分别达到0.05、0.20、1.00、5.00、20.00μg/g，充分混合，静置4小时，加入0.3mol/L盐酸0.2mL，静置1小时，加入0.5g无水硫酸钠，加入3mL二氯甲烷/丙酮(3∶1比例)混合液，密封离心管，4℃冰箱静置8小时后，用高速均质器均质10s(16000r/min)，再用3mL二氯甲烷/丙酮提取液清洗均质器刀头，合并2次的提取液，振荡1min，静置5min后，5000r/min离心10min，取出全部上清液，放入15mL玻璃离心管中，剩余残渣加入4mL二氯甲烷/丙酮再次提取，振荡1min，静置5min后，5000r/min离心10min，取上清液与第一次提取液合并，在35℃下氮气吹干，残渣用1mL流动相溶解，加入1mL的正己烷，漩涡混合1min，静置10min，弃去正己烷，下层液用0.22μm微孔滤膜过滤后进高效液相色谱仪测定。
C、标准溶液的配制分别准确称取200mg磺胺甲噁唑、200mg乙酰化磺胺甲噁唑和200mg甲氧苄啶标准品一起溶于100mL流动相中，配成同时含有三种药物的母液(200μg/mL)，于冰箱中4℃保存，临用前依次稀释成50.00、20.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01μg/mL的标准溶液。
D、流动相配制及色谱条件取乙腈、重蒸水、冰醋酸按20∶80∶0.5(v/v/v)的比例配制流动相，超声波脱气30min。
色谱条件4.6mm×250mm C18ODS柱；柱温25℃；流速1.0mL/min；进样量20μL；紫外检测波长272nm；流动相为水∶乙腈∶冰醋酸＝80∶20∶0.5。
本发明方法对鱼的肌肉组织在0.05、0.20、1.00、5.00、20.00μg/mL5个浓度梯度的回收率试验。结果表明，经过本试验的前处理步骤，空白样品和添加药物样品的色谱图均未出现明显的杂质峰(图1-2)，样品分离良好，肌肉中SMZ、TMP、NSMZ 5个浓度水平的添加回收率范围在82.12-90.87％、79.64-88.67％、78.21-86.08％(表1)。以上5个浓度的样品于1d内分别重复进样5次和分5d测定，以此衡量定量方法的精密度(表2)，试验中三种药物在5个不同浓度水平下平行样品的相对标准偏差范围在1.44-3.13％、2.01-4.23％、1.09-4.56％，符合磺胺甲噁唑、甲氧苄啶及乙酰化磺胺甲噁唑残留分析的要求。
表1SMZ、TMP及NSMZ在鱼肌肉组织中的回收率
表2SMZ、TMP及NSMZ在鱼肌肉组织中的日内及日间精密度
本方法在0.01-20mg/kg浓度范围内，SMZ、TMP、NSMZ在鱼肌肉组织中线性关系良好，相关系数均可达0.9999；该方法以引起2-3倍信噪比(S/N)定义为最低检测限，SMZ、TMP、NSMZ的最低检测限分别为0.005、0.01、0.005mg/kg，完全符合磺胺甲噁唑、甲氧苄啶及乙酰化磺胺甲噁唑残留分析的要求。
权利要求
1.一种同时测定鱼肉中复方磺胺甲噁唑及代谢物的液相色谱法，其特征在于它的技术方法，包括样品制备、样品前处理、标准溶液的配制、流动相配制及测定所用色谱条件；A、样品制备采集鱼的肌肉组织样品，用剪刀初步剪碎，用高速均质器均质，冷冻保存；B、样品前处理称取解冻鱼肉组织，加入盐酸，静置，加入无水硫酸钠后，加入二氯甲烷/丙酮混合液，4℃条件下静置一段时间后，用高速均质器均质，用二氯甲烷/丙酮混合液清洗均质器的刀头，提取液经充分振荡后离心，残渣用二氯甲烷/丙酮提取液再次提取，合并2次提取液并用氮气吹干，残渣用流动相溶解，加入正己烷去脂肪，下层液用微孔滤膜过滤后进高效液相色谱仪测定；所述的样品前处理，加入盐酸的浓度为0.3mol/L；加入盐酸的比例为0.2mL/g肌肉；加入盐酸后的静置时间为1小时；加入的提取液为3∶1比例混合的二氯甲烷/丙酮混合液；4℃冰箱静置的时间为8-12小时后；C、标准溶液的配制分别准确称取200mg磺胺甲噁唑、200mg乙酰化磺胺甲噁唑和200mg甲氧苄啶标准品一起溶于100mL流动相中，配成同时含有浓度为200μg/mL三种药物的母液，于冰箱中4℃保存，临用前再依次稀释成系列梯度的标准溶液；D、流动相配制取乙腈、重蒸水、冰醋酸按20∶80∶0.5的比例配制流动相，超声波脱气30min后备用；E、测定所用色谱条件色谱柱选用规格为4.6mm×250mm C18ODS柱；柱温25-30℃；流速0.8-1.0mL/min；进样量10-20μL；紫外检测波长272nm；流动相为水∶乙腈∶冰醋酸＝80∶20∶0.5。
全文摘要
一种同时测定鱼肉中复方磺胺甲噁唑及代谢物的液相色谱法。以盐酸、3∶1比例的二氯甲烷/丙酮混合液作为提取剂，可将残留在鱼肉组织中的磺胺甲噁唑、乙酰化磺胺甲噁唑和甲氧苄啶充分提取出，提取的杂质少，可省略净化的过程；加入提取液后，在4℃冰箱静置一段时间，能够使蛋白质变性充分，从而减少提取时因蛋白黏附在高速均质器上所造成的损失，提高了回收率；将提取的有机溶剂用氮气吹干、过滤后即可进高效液相色谱仪测定。本发明方法操作简便、快速、检测成本低、灵敏度高，可用在科研单位和进出口商品检测部门进行鱼肉中复方磺胺甲噁唑及代谢物含量的测定。
文档编号G01N30/06GK1908654SQ20061006852
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月18日 优先权日2006年8月18日
发明者王群, 李健, 刘淇, 何玉英 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所