专利名称：使用溶胶-凝胶基体的农药残留物快速活体鉴定的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种包埋乙醯胆碱胸(Ache)的方法，步骤包括在水中从一 氧化硅溶液中形成硅溶胶，调节所述乙醯胆碱胸(Ache)的酸碱度至低于7 度以稳定所述硅溶胶，从而形成一种含有乙醯胆碱鹰(Ache)的硅溶胶基体。 本发明提供一种生物吸收介体的技术，其中的酵若储存在一个温度4aC、 用完即弃、以异丁烯酸制成的比色杯内，可长期保持稳定性及活性。该技 术提供一种在异丁烯酸的用完即弃比色杯中制备一用完即弃形的酵鉴定。 所述包埋的酵证实可以与常用于蔬菜类对抗害虫的农药如有机磷酸盐、氨 基甲酸盐类等作出反应。此溶胶一凝胶中的相互作用的作用方式为抑制活 动；底物(ACTI)及硝基苯甲斷DTNB)与所述酵的显色反应结果呈黄色，该 颜色证明为在溶胶基体中形成，即在溶胶腔内形成，若轻微摇动含溶胶一 凝胶的比色杯，所述颜色便释放到颜色肉眼可见的自由溶液，但若要准确 量度抑制活动，则需要用量热分光测光仪量度形成颜色的吸光度，测试的 计算基础为与一对照溶液，即一不含农药的溶液，作颜色转变百分差的比 较。抑制百分率的限界值被设至最低，以决定样本中农药成分的可接受程 度。
背景技术：
本发明涉及一种用于包埋乙醯胆碱嗨(Ache)的溶胶一凝胶方法，用于 生物鉴定研究。改善生物鉴定效能的新物质近年不断发展，在这方面最具 挑战性的发展之一是生物载体基体固定和集合生物分子于主基体内，以及 保留所述生物分子的功能性。近年来，各种技术不断发展，如聚合物和无 机基体的吸附、共价连接、封锁及包埋，以取得可再生及发达的固定技术 来保存活体分子的活动。由溶胶一凝胶法制成的硅主基体已出现并成为一个可靠的平台，来包 埋生物分子如酵、抗体及细胞。硅主基体的包埋为酵提供一个较稳定的环 境，因为聚合物架构在生物分子附近生长，形成一个隔离罩，从而防止酵 的聚集和伸展。这些溶胶一凝胶基体属化学惰性、热稳定的、吸水及透明 的，容许分光监察封锁的样本。溶胶一凝胶基体细孔里的微包埋不会降低
生物分子的仿射性及活动，因为酵并不是真的附在基体上。本发明的目的 是发展一种包埋溶胶一凝胶的家蝇乙醯胆碱胸，作为一种生物感应物质， 可用于探测蔬菜里的农药残留物的活体鉴定。 发明内容本发明的主要目的在于提供一种制造有细孔、透明、含有一包埋生物 物质的溶胶一凝胶基体的方法。本发明的另一目的在于提供一种用作定量或定性探测一种测试物质的 方法，所述测试物质与一活性生物物质反应，或其反应由一活性生物物质 催化，其特征在于所述生物物质包埋于一溶胶一凝胶基体内，并所述溶 胶 一 凝胶基体由非酒精方法制备。本发明的再一目的在于提供一种储存一生物物质于一个有细孔的透明 溶胶一凝胶基体内的方法，其特征在于即使暴露于不利环境，所述物质 的生物活性保持于约80%至少6个月。为达致本发明的上述及其它目的，本发明提供-一种制造有细孔、透明、含有一包埋生物物质的溶胶一凝胶基体的方 法，包括以下步骤(i) 在一含有水和一酸性催化剂的非酒精介体中混合一金属垸氧化合 物，并搅拌混合物直至取得清液，以形成一单相溶胶；(ii) 加入一缓冲剂来提升步骤(i)所取得的混合物的酸碱度至5至7度；(iii) 加入一生物物质至步骤(ii)所得的缓冲溶胶中；(iv) 形成一溶胶一凝胶，并容许所述溶胶一凝胶时效成形；(v) 容许所述溶胶一凝胶中一部分水蒸发，令步骤(iv)的形成物的体积减少，并所述生物物质包埋在所述体积减少的溶胶一凝胶单块内。 一种用作定量或定性探测一种测试物质的方法，所述测试物质与一活性生物物质反应，或其反应由一活性生物物质催化，其特征在于所述生 物物质包埋于一溶胶一凝胶基体内，并所述溶胶一凝胶基体由非酒精方法 制备。所述定量或定性探测方法包括以下步骤(i) 制备所述溶胶一凝胶基体，其包括包埋于一有细孔、透明并由非 酒精溶胶一凝胶方法制备的基体的所述活性生物物质；(ii) 令含溶胶一凝胶基体的所述生物物质与含有所测试物质的一气体 或水溶液接触；
(iii)定量或定性探测、观察或量度包埋于所述溶胶一凝胶基体的所述 生物物质的一个或多于一个特征的转变。一种储存一生物物质于一个有细孔的透明溶胶一凝胶基体内的方法， 其特征在于即使暴露于不利环境，所述物质的生物活性保持于约80%至少6个月，包括以下步骤(i) 在一含有水和一酸性催化剂的非酒精介体中混合一金属烷氧化合物，并搅拌混合物直至取得清液，以形成一单相溶胶；(ii) 加入一缓冲剂来提升步骤(i)所取得的混合物的酸碱度至5至7度；(iii) 加入一生物物质至步骤(ii)所得的缓冲溶胶中；(iV)形成一溶胶一凝胶，并容许所述溶胶一凝胶时效成形；(v) 容许所述溶胶一凝胶中一部分水蒸发，令步骤(iv)的形成物的体积减少，并所述生物物质包埋在所述体积减少的溶胶一凝胶单块内；(vi) 储存步骤(v)形成的凝胶及包埋于内的所述生物物质。
具体实施方式
本发明以上述的情况为前题。本发明的目的是提供一种快速生物鉴定 方法，以测试样本如蔬菜水果里的农药残留物。为达致上述目的，发明人 进行了深入的研究，并取得基于酵和农药处于不同缓冲浓度及酸碱度时的 相互作用的结果。实验中深入研究了溶胶一凝胶和缓冲剂的混合比例，并 取得最佳的混合物，发展了一种以利用酵的溶胶一凝胶包埋法为基础、用 以快速测试农药残留物的新型生物感应物质。本发明采用三种毒性不同的 有机磷酸盐，即敌敌畏(第一类一高毒性及危险复合物)、杀虫剂毒死蜱及 杀螟松(第二类一轻微毒性复合物)，以研究所述溶胶一凝胶固定过程的效用。酵抑制活动显示所述生物感应物质对这些有机磷酸盐农药的反应为高度可再生。观察所得，掺入酵的溶胶一凝胶单块储存于温度4。C能保持稳 定达3个月。此外，所述凝胶能大量生产，从而令其成本低达至可用完即弃的程度。不同分光测光仪测试所得的比较数据得出与掺有农药样本的数据的趋势相近。本发明物质，即包埋乙醯胆碱腺(Ache)的溶胶一凝胶，可 用作一种快速测试有机磷酸盐农药的生物试剂。本发明生物鉴定能使用这生物感应物质为一生物辩认元素。所述包埋 过程在室温下进行，并利用磷酸缓冲剂以减低酵的变性作用。本发明采用 三种毒性不同的有机磷酸盐，即敌敌畏(第一类一高毒性及危险复合物)、 杀虫剂毒死蜱及杀螟松(第二类—轻微毒性复合物)，得出动态量程分别界乎百万分之0.1及1.0、百万分之20及100，以及百万分之100及1000的敌敌畏、杀虫剂毒死蜱及杀螟松连的校准标绘。观察所得，当半数所述有机磷酸盐农药的最大抑制作用(15。)与不同浓度的底物碘化乙酰硫代胆碱(ATCI)反应时，便出现竞争性抑制。酵抑制活动显示所述生物感应物质对 这些有机磷酸盐的反应为高度可再生。较低的酵淋溶率(20。/。)显示微包埋 过程可把酵保持于所述溶胶一凝胶基体内。掺入酵的溶胶一凝胶单块储存 于温度4。C能保持稳定达3个月。此外，所述凝胶能大量生产，从而令其 成本低以达至可用完即弃。再生数据由苋菜红或中国苋菜(皱果苋)及空心 菜(蕹菜)中的敌敌畏采集所得，平均相对标准偏差为2.44%的掺有农药样 本得出的再生的百分率为约80%，显示本发明的生物感应物质能被采用为 一种用作生物感应装置的生物试剂。 溶胶—凝胶的制备溶胶一凝胶的制备根据Ellerby et al.[3]所描述的方法进行，为一包括 两个步骤的方法。以Kumar[4]的方法为基础，但改变初始物，在一个管形 玻璃瓶内混合4.5毫升的硅酸甲酯(TMOS)、 1.4毫升的水和0.1毫升，以制备经酸催化的硅胶，然后搅拌混合物至取得清液，再密封所述管形瓶并 发酵24小时，以取得一种合适的硅发酵凝胶。 化学品及试剂来自家蝇(HFAChE)的乙醯胆碱胸(Ache) (1.25Umg—"由台湾农业研究 中心(Taiwan Agricultural Research lnstitute)购得。碘化乙酰硫代胆碱 (ATCI)和5，5'二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5,5' -dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) 画DTNB)由Sigma Chemical Co.购得。有机磷酸盐农药，即敌敌畏(99%) 和杀虫剂毒死蜱(99。/。)由德国的Riedel de Haen (Seelze)购得。标准浓度 为100kigml"的物质在甲醇里制备，并储存于4。C。硅酸甲酯(TMOS)自 东京Kasei， TCI (等级99%)购入。甲醇、盐酸及其它化学品自Merck购 入。另需制备一种酸碱度为8和0.1M的磷酸缓冲剂。所述用完即弃的异 丁烯酸比色杯由Dispolab-Kartell购入，需1.5毫升。在溶胶一凝胶基体中保存酵把一个含有70|jl的缓冲剂、20|jl家蝇(HFAChE)(0.5 U m。和30pl溶胶的混合物放入一个用完即弃的比色杯内，溶胶一 凝胶数秒内便固化。
所述酵完全包埋于所述滋长中的网络内。所述比色杯用交叉胶片密封，以防止时效成形期间凝胶快速蒸发引致破裂。整个胶化作用需时约15分钟， 然后把所述溶胶存于4°C等待时效成形。 淋溶测试两个不同的比色杯被分别用作加入20 pl家蝇(HFAChE)及20 ijI溶肢。 第三个比色杯用作加入30 |J|溶胶、70 yl缓冲剂及20 pl乙醯胆碱腾 (Ache)，量度在一分钟后进行，以让所述物质进行固定。每个比色杯加入 1毫升缓冲剂，然后用分光测光仪于280nm波长量度蛋白质的光密度。再生测试蔬菜(苋菜)样本切成细块， 一个子样本(50克)量重后放入混合瓶，其 与50 |jl的百万分之一的敌敌畏均匀混合1小时，培育后，加入分量为50 毫升的甲醇，混合物再混合5分钟，然后利用滤纸过滤抽取物以取得过滤 液。至于对照实验，除均匀混合敌敌畏的步骤外，步骤如上所述。分析酵 抑制活动的步骤与Salmahetal. [5]的研究中所述相似。 一分量为50 pl的 过滤液在一个含有己掺入乙醯胆碱腌(Ache)溶胶一凝胶的比色杯内培育 10分钟。加入底物5分钟后，即以分光方法量度吸光度。掺入酵的溶胶—凝胶单块的特征由硅酸甲酯(TMOS)衍生的溶胶一凝胶单块为光透明及有细孔，因而适 合乙醯胆碱嗨(Ache)的包埋。本发明使用先前的结果显示的最佳作业环境， 例如缓冲剂及酵与溶胶的比例为3:1、酵的分量为0.5U，以及作业底物浓 度为5.0x10'SM，来达至所述生物感应物质的特征[6。淋溶测试于所述 特征研究之先已成功施行，其所述掺入酵的溶胶—凝胶单块的淋溶率见表 1.0。蛋白的光密度(280nm)显示80。/。的所述包埋乙醯胆碱鹰(Ache)在1 分钟的胶化作用时间里保留在所述溶胶一凝胶基体中。根据Bhatia and Brinker [1]，掺入酵的硅基体的细孔应为细小得可以防止包埋的大分子淋 溶，但大得足以让缓冲离子、底物分子及分析物无限制的运行。样本 平均光密度(280nm) 淋溶率％自由酵乙醯胆碱胸(Ache) 0.515 0%
溶胶溶液 0.015 0%掺入乙醯胆碱嗨(Ache)溶胶 10.102 19.8一凝胶单块表1.0参考资料1) Bhatia， R.B.， Brinker， C丄，Gupta A.K. & Singh， A.K. (2000). Aqueous sol-gel process for protein encapsulation. Chem-Mater. 12(8): 2434-24".2) Diaz， A.N. & Peinado， M.C.R. (1997). Sol-gel cholinesterase biosensor for organophosphorus pesticide fluorimetric analysis-Sensors and Actuators B. 38-39: 426-431.3) Ellerby, LM., Nishida, C.R.' Yamanaka, SA， Dunn， B.， Valentine, 丄S. & Zink，丄l. (1992). Encapsultion of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255:11134-1118.4) Kumar, A.， Malhotra, R.， Malhotra, B.D. & Grover, S.K. (2000). Co-immobilization of cholesterol oxidase and horseradish peroxidase in a sol-gel film. Anal. Chim Acta. 414: 43-50.5) Salmah A.A,， Musa A., Othman., Abu Bakar S. and Zamri I. (2002). Kestabilan Bio-Molekul Terpegun Di dalam Sol-Gel Bagi Menghasilkan Penderia optik Kolinesteres Untuk Penyaringan Awal Racun Makhluk Perosak 5th. Proc. Joint Chemistry Seminar UKM-ITB.6) Salmah AA， Musa A., Othman O.， Abu Bakar S. and Zamri I. (2002). Spectrophotometric Determination of Organophosphorus pesticides using Sol-Gel Encapsulated Housefly Acetylcholinestesrase. Paper submitted to丄Non-Cryst. Solids. 7) Ellman G丄,，Courtney D.K., Anders V. and Featherstone R. M.， (1961). A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 8: 88.8) Ware G. W. (1978) Pesticides: theory and application. San Francisco: Freeman & Company.上述实施例为本发明的优选方式，为阐明本发明特别披露了本发明的 一些例子，但本发明的实施方式并不为上述实施例所限定，其它的任何未 背离本发明的精神下所作的实质或原理上的改变、修饰、替代、组合、简 化，均应为等效的置换或替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种制造一有细孔、透明、含有一包埋生物物质的溶胶-凝胶基体的方法，包括以下步骤(i)在一含有水和一酸性催化剂的非酒精介体中混合一金属烷氧化合物，并搅拌混合物直至取得清液，以形成一单相溶胶；(ii)加入一缓冲剂来提升步骤(i)所取得的混合物的酸碱度至5至7度；(iii)加入一生物物质至步骤(ii)所得的缓冲溶胶中；(iv)形成一溶胶-凝胶，并容许所述溶胶-凝胶时效成形；(v)容许所述溶胶-凝胶中一部分水蒸发，令步骤(iv)的形成物的体积减少，并所述生物物质包埋在所述体积减少的溶胶-凝胶单块内。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述金属烷氧化合物为硅酸甲酯(TMOS)、正硅酸乙酯(TEOS)，或任何其它合适材料。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述酸性催化剂为盐 酸(HCI)或任何其它合适催化剂。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述缓冲剂及酵与所述溶胶一凝胶的比例最佳为3:1 。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述溶胶粒子的大小以所述溶胶一凝胶被弄干时可产生的细孔的大小为基础，即等同所述包埋 生物物质的生物物质的粒子的大小。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述生物物质是在包含核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、活性蛋白、脱氧核糖核酸(DNA)、 核糖核酸(RNA)或蛋白的活性碎片，以及细胞或组织的组别中挑选的。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述生物物质为任何 活性蛋白或其活性碎片。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述蛋白或其活性碎 片为一种从乙醯胆碱嗨或任何酵或活性复合物组别中挑选的酵或活性复 合物。
9. 一种用作定量或定性探测一种测试物质的方法，所述测试物质与一活性生物物质反应，或其反应由一活性生物物质催化，其特征在于所述生物物质包埋于一溶胶一凝胶基体内，并所述溶胶一凝胶基体由非酒精 方法制备，所述定量或定性探测方法包括以下步骤-(i) 制备所述溶胶一凝胶基体，其包括包埋于一有细孔、透明并由非酒精溶胶一凝胶方法制备的基体的所述活性生物物质；(ii) 令含溶胶一凝胶基体的所述生物物质与含有所测试物质的一气体 或水溶液接触；(iii) 定量或定性探测、观察或量度包埋于所述溶胶一凝胶基体的所述 生物物质的一个或多于一个特征的转变。
10. 根据上述任一权利要求中所述一种定量或定性探测农药的方法。
11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述农药为一种从一 个包括敌敌畏、杀虫剂毒死蜱及杀螟松组别中挑选的有机磷酸盐或其它有 机磷酸盐。
12. —种储存一生物物质于一个有细孔的透明溶胶一凝胶基体内的方法，其特征在于即使暴露于不利环境，所述物质的生物活性保持于约80% 至少6个月，包括以下步骤(i) 在一含有水和一酸性催化剂的非酒精介体中混合一金属垸氧化合物，并搅拌混合物直至取得清液，以形成一单相溶胶；(ii) 加入一缓冲剂来提升步骤(i)所取得的混合物的酸碱度至5至7度；(iii) 加入一生物物质至步骤(ii)所得的缓冲溶胶中；(iv) 形成一溶胶一凝胶，并容许所述溶胶一凝胶时效成形；(v) 容许所述溶胶一凝胶中一部分水蒸发，令步骤(iv)的形成物的体积 减少，并所述生物物质包埋在所述体积减少的溶胶一凝胶单块内；(vi) 储存步骤(v)形成的凝胶及包埋于内的所述生物物质。
13. 根据权利要求12所述的储存一生物物质于一个有细孔的透明溶胶一凝胶基体内的方法，其特征在于所述生物物质为一活性蛋白或活性蛋白碎片，并所述金属烷氧化合物包括硅酸甲酯(TMOS)、正硅酸乙酯 (TEOS)，或任何其它合适材料，并即使暴露于不利环境，所述蛋白或蛋白 碎片的生物活性保持于约80%至少6个月。
14. 根据权利要求12或13所述储存了至少6个月的活性生物物质， 然而其特征在于所述物质的生物活性保持约80%。
15. 根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于所述生物物质、 活性蛋白或活性蛋白碎片为乙醯胆碱嗨或任何其他酵或活性复合物。
全文摘要
本发明涉及一种快速活体鉴定，用来测试一样本中的农药残留物，特别是一种以利用酵的溶胶—凝胶包埋法为基础、用以测试农药残留物的新型生物感应物质；酵抑制活动显示生物感应物质对农药残留物的反应为可再生的，并掺入酵的溶胶—凝胶单块储存于温度4℃能保持稳定，以及具经济效益。
文档编号G01N21/77GK101131388SQ200610111319
公开日2008年2月27日 申请日期2006年8月21日 优先权日2006年8月21日
发明者幕沙·阿马得, 曽里·依沙可, 舍麦·阿布敦·阿塞, 阿布·巴卡尔·沙雷 申请人:马来西亚农业发展研究所;马来西亚博特拉大学;马来西亚国民大学