专利名称：一种抗微管蛋白的中药活性成分筛选方法
技术领域：
本发明涉及中药活性成分的筛选，具体地说是一种抗微管蛋白的中药 活性成分筛选方法，通过中药指纹图谱，建立一种中药中筛选与微管蛋白 相互作用的活性成分的方法，背景技术癌症严重威胁着人类的生命。据世界卫生组织统计，全世界每年死于癌症的患者约500万，因此癌症的预防与治疗任务十分艰巨。药物治疗是 癌症治疗的三大疗法之一。肿瘤药物治疗的历史由来以久，但用化学药物 治疗肿瘤只是近四十年的事。寻找新抗癌药寻找抗肿瘤药物，自然离不开 筛选，而抗肿瘤药物筛选是整个抗肿瘤药物研究过程中非常重要的一环， 以往应用的筛选系统只适于随机筛选，比较理想的筛选体系应该是针对机 理的筛选系统。以机理为基础的药物筛选包括新近发现的酶靶点，如端粒 酶、法尼基蛋白转移酶、氨肽酶一N等，也包括常见的一些靶点，如DNA 拓扑异构酶。细胞骨架微管蛋白是一种非常重要的靶点，干扰微管蛋白聚 合或解聚的药物具有抗有丝分裂活性，天然产物紫杉醇的问世则重新引起 了人们对微管蛋白靶点的重视。中药是祖国医药学的宝贵遗产，迄今为止己有数千年的临床实践经验， 并形成了系统的独具特色得中医理论体系，在我国有着极其广泛的应用基 础。同时，作为一种天然产物的分子库，从中药中筛选具有药理活性成分 具有目标明确、毒副作用小、原料来源丰富等有利因素。以微管蛋白为耙 点的药物通常具有明显的抗癌作用，因此从天然产物和传统抗癌中药中筛 选出具有抗微管蛋白活性的有效成分，为以中药有效成分为基础的新药设 计提供新的先导化合物具有重大意义。现有的研究这些方法都是研究单一 成分和微管蛋白的作用。中药成分复杂，往往含有大量的化合物，要获得 单一成分不仅提取困难，费时费力。且有很大盲目性。中药指纹图谱指中药材经适当的处理后，采用一定的分析手段，得到 的能够指示该中药特性的共有峰的图谱。其质量标准并不要求图谱中的每 一个组分的化学结构都清楚，也不要求对每一个组分都精确定量，但要求 图谱具有"指纹"特征，即要求专属、稳定、实用。传统上，中药材主要 靠外观或者显微鉴别，随着现代分析化学技术的不断进步，采用指纹图谱 技术，可以部分的体现中医药中多组分，多靶点，多途径的协同或拮抗作 用；可以提供更丰富、更有用的信息，有望显著改善可控性，提高生产现 代化程度，是中医药走向世界的关键技术之一。目前，美国FDA、英国草 药典、印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物协会等均接受指
纹图谱的质控方法。目前，中药指纹图谱研究所采用的方法大致分为色谱 法、光谱法等等。色谱法中的高效液相色谱(HPLC)具有分离效能高、选 择性高、检测灵敏度高等特点。超滤(UF)，超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，液体在一定的压力或者离心力下，溶剂和小分于透过 膜，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，适于将生物大分子 与小分子分离，尤其是蛋白质和酶的浓縮和脱盐。具有成本低，操作方便， 条件温和，能较好的保持生物大分子的活性，回收率高等优点。微透析技术(micordialysis)，微透析取样技术是近年来发展起来的一种 动态微量生化取样的新技术。它利用具有一定分子量截留的微细半透膜探 针在平衡渗透的状态下提取出复杂体系(如生物样品等)中的小分子，具 有活体取样，动态观察，定量分析，采样量小，组织损伤轻等特点。因此 所收集的透析液无需预处理即可出去大分子的干扰；微透析将透析微型化， 探针化，收集具有实时性、快捷、微量、准确的优点，易于自动化，方便 与现代分析仪器联用。在神经科学，医药研究等领域己获得越来越广泛的 应用。发明内容本发明的目的是通过微透析以及超滤取样技术和高效液相色谱以及质 谱等分析分离方法相结合，利用中药指纹图谱的稳定、重现性好、定量准 确、特征明显的特点，建立一种简便、高效，准确且成本低廉的体外实验 与评价方法，从中药中筛选出能够和微管蛋白发生相互作用的活性化合物， 为以中药有效成分为基础的抗癌药物设计提供新的先导化合物。 为实现上述目的，本发明采用技术方案为-抗微管蛋白的中药活性成分筛选方法，其操作过程如下，1) 将待研究的中药提取液和微管蛋白溶液按照体积比1: 9形成的均 相的混合体系，超滤或微透析取样并收集分子量》18000的液体作为反应 液；所述中药提取液的质量浓度为20-50 mg/ML，微管蛋白溶液的质量浓度 为10mg/ML;2) 在与上述步骤相同的条件下，将待研究的中药提取液和不含微管蛋 白的空白溶液按照体积比1: 9形成的均相的混合体系，超滤或微透析取 样并收集分子量^ 18000的液体作为空白液；所述中药提取液的质量浓度为 20-50 mg/ML;3) 将上述的反应液和空白液分别进行反相高效液相色谱分析，建立反 应获得的中药指纹图谱和空白样品的指纹图谱；4) 将上述分析获得的反应透析液和空白中药指纹谱图进行比较，相对 于空白中药指纹谱图，指纹图谱中面积减小峰为待研究的中药提取液中能 够和微管蛋白分子发生相互作用的活性成分并鉴定。最后运用液相色谱一质谱和/或紫外吸收法，鉴定活性成分与微管蛋白
的作用类型。所述微管蛋白为用高速离心的方法从脑组织中提取微管蛋白；其溶液为MES缓冲液(0.1 MMES (2- (N-吗啡啉)乙磺酸),1 mMEGTA， 0.5 mM MgCl2， lmM GTP pH=6.5 );所述待研究的中药为在临床或药理上有抑制癌细胞生长和有丝分裂的中药或天然产物；所述高效液相色谱分析条件为 250X4.6mm, I.D. (Kromasil ODS填料)反相色谱柱，流速1.0mL/min， 梯度洗脱，检测波长227—350nm;所述中药与微管蛋白相互作用体系为 水溶液或加入助溶剂的均相作用体系；所述助溶剂可以为乙醇，四氢呋喃 或二甲基亚砜，其于溶液中的体积含量应^10。/。。 本发明具有如下优点；1. 目标范围明确，成功率高。本发明提供了一种中药活性成分与微管 蛋白相互作用的研究方法，运用指纹图谱技术，筛选中药中有抗微管蛋白 活性的活性成分。本发明通过紫外吸收和体外微透析实验方法并结合高效 液相色谱技术，以具有抗肿瘤活性的中药来开发新药，具有目标明确、采 用体外试验、无毒副作用小、原料来源多等多种有利因素。2. 筛选靶点和原理明确，结果准确可靠，通过微透析和高效液相色谱 相结合的方法，能够同时研究中药提取物中多种成分与微管蛋白分子相互 作用，并可从中快速分离分析能够和微管蛋白发生结合的成分，为新的抗 癌药物设计提供先导化合物。寻找中药中中药指纹图谱的建立，对于筛选药物来说，有二点优势， 一，系统性优势指指纹图谱中所反映的化学成分包括该中药有效部位所 含的大部分成分的种类，或指标成分的全部，代表着中药的大部分药理活 性，在药物筛选中，指纹图谱的建立，便于寻找与已知的活性成分结构， 药理作用相似的未知成分。二，特征重现性，指指纹图谱中反应的化学成 分信息，是具有高度选择性的，无论是已知还是未知成分，在指纹图谱之 中的顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随着药材品种的不同而不同， 并且有着良好的重现性。通过这些整体信息，可以很好的对来源不同的相 同品种中药进行鉴定和筛选，具有普遍适用的特点。重现性良好的指纹图 谱，直接为活性成分的比较和鉴定提供了有利条件。3. 周期短。本发明中药活性成分与微管蛋白相互作用的研究方法中， 中药提取物溶液和微管蛋白混合后，发生药物和微管蛋白的反应，反应液 是一个复杂的均相体系，含有大分子微管蛋白，几十种乃至上百种中药化 合物小分子，微管蛋白与小分子结合的复合物以及其他杂质。本发明采用 膜分离技术，例如超滤或微透析取样技术，可以从中药提取物和靶蛋白混 合体系中提取出未结合的游离化合物而不影响结合平衡，避免了复杂的预 处理过程，同时，利用高效液相色谱强大的分离能力，可以对中药中多种 成分同时分析而无需特别的提取或纯化。4. 另外，由于来自中药的有效成分源自天然，相对于合成药物(西药)，
中药具有毒副作用较小，疗效独特的特点，因此更加具有进行结构改造和 研究应用的价值，进来人们越来越把目光投向传统中药，希望从中筛选出 具有药理活性的物质。本发明对中药应用于药物筛选提供了有益的选择。总之，本发明的新颖性和创造性在于建立比较中药指纹图谱的方法在体 外研究中药和微管蛋白分子相互作用，寻找抗微管活性的中药活性成分，不 仅操作需要的微管蛋白和中药提取液的样品用量少，操作简单，而且中药指 纹图谱手段具有简便，稳定，精密度高以及重现性好，普遍适用的特点，由 于本发明针对中药某一部位的提取物进行相互作用与检测，可以部分的体现 中医药中多组分，多途径的协同或拮抗作用，可以提供更丰富、更有用的信 息，便于在药物筛选中进一步阐明其他组分在相互作用中的地位和作用，从 大量成分中快速筛选出具有与微管蛋白结合能力的化合物，得出与微管蛋白 的结合率，而且可以得到与微管蛋白相互作用的类型。本方法操作目标范围 明确，成功率高，简便快速易行，样品用量少，结果直观准确，前景广阔。
图1为比较反应透析液和空白透析液所得的红豆杉提取物指纹图谱，A: Taxol(紫杉醇)，B: 7-epi-10-DAT(7-表-10去乙酰基巴卡亭)，C: Cephalomannine (三尖杉宁碱)，D: Baccatin III (巴卡亭III) ,E: 10-DAB(10-去乙酰基巴卡亭);图2为图1的局部放大图；图3为比较反应透析液和空白透析液所得的长春花提取物指纹图谱，A: Catharanthine (长春质碱)，B: Vincristine (长春新碱)，C: Vinblastine(长春碱);图4为比较反应透析液和空白透析液所得的山慈姑根茎提取物指纹图 谱，A: Colchicine (秋水仙碱)。
具体实施方式
本发明中药活性成分与微管蛋白相互作用的研究方法中，具体包含如下步骤——用高速离心的方法从脑组织中提取微管蛋白。 ——提取中药活性成分。——将少量该中药提取物溶液与一定量的缓冲液相混合孵育，采用微透 析或超滤进行取样，收集游离于溶液中的药物分子。再将收集含有药物小 分子的样品液用液相色谱进行分离分析，得到未与靶分子微管蛋白相互作 用的对照指纹图谱。——将少量该中药提取物溶液与一定浓度微管蛋白溶液混合孵育，采 用微透析或超滤进行取样，收集游离于溶液中的药物分子。再将收集含有 药物小分子的样品液用液相色谱进行分离分析，得到与靶分子微管蛋白相 互作用的指纹图谱。——精密吸取对照品溶液，用高效液相色谱测定，之后将上述反应液 和空白液在相同的条件下分别进行高效液相色谱测定；以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算相对保留时间和相对峰面积，即得到中药 成分标准指纹图谱。—一将对照的指纹图谱与和微管蛋白相互作用之后得到的指纹图谱相比较，可以发现某些化合物的吸收峰因为具有抑制微管蛋白的活性而结合 在微管蛋白之上而未进入透析膜，因而造成吸收下降。相对于空白透析液 液相色谱图，峰面积减小的为待研究的中药提取液中能够和微管蛋白分子 发生相互作用的活性成分，峰面积没有发生变化的为不能够和微管蛋白分 子结合进而发生相互作用的成分，在比较指纹图谱时将之忽略。 ——运用质谱，紫外吸收，等方法鉴定该成分。 ——运用紫外吸收法，鉴定该成分与微管蛋白的作用类型。 实施例1从新鲜猪脑中称重后，4°C条件下制成匀浆，加入MES缓冲液(0.1M MES (2- (N-吗啡啉)乙磺酸)，1 mM EGTA, 0.5 mM MgCl2， lmM GTP pH=6.5 ) 105000 g， 4 °C条件下高速离心1 h，取上清，在37 。C水浴条 件下，聚合30min ，然后在105000 g， 26 。C条件下高速离心1 h，收集微 管蛋白，经测定浓度为10mg/ML。称取2 g南方红豆杉粉末置于烧瓶中，用90%乙醇浸泡过夜，蒸干后 的药材残渣用水和二氯甲烷萃取4次，有机相蒸干后，药材残渣用20 mL 环己烷提取，环己垸部分弃去，药材残渣并溶于DMSO (二甲基亚砜)， 用水逐级稀释，用微孔滤膜过滤后得到含10%DMSO的红豆杉提取物溶液, 其中质量百分比为50mg/ML。10 mg/ml微管蛋白溶液900 pL与红豆杉提取液100 pL充分混合，并 置于37 。C恒温水浴中，混合30min，开始微透析取样，透析膜截留分子量 为18000，灌流液流速为l )iL/min,取样时间40 min，收集透析液，另外相 同条件下收集不含微管蛋白的空白红豆杉提取物的空白透析液。室温下进行高效液相色谱分析，建立中药指纹图谱。色谱条件如下仪器Waters 515液相色谱泵，Waters 2487双通道紫外检测器，250 X4.6mm，I.D. (Kromasil ODS填料)WDL-95色谱工作站。流动相A相乙腈B相水线性洗脱条件Omin—5min 10%A， 5 min—20 min 10%A_25%A， 20 min—70 min25%A—90%A。 流速l.OmL/min 检测波长227 nm比较反应透析液和空白透析液所得的中药指纹图谱(附图1， 2)，发 现大部分化合物峰面积没有变化，其中5个化合物峰面积有所减小，经定 性，有紫杉醇，三尖杉宁碱，7-表-10去乙酰基紫杉醇，巴卡亭III和lO-去 乙酰基巴卡亭。结合率分别为57%， 12.8%， 16.2%， 12.1%和10.8%。
用紫外吸收法，利用参照品对微管蛋白聚合作用的影响，在微管蛋白 溶液中加入一定量参照品，在350 nm检测波长下，分别检测处于4 'C和 37 。C条件下微管蛋白与参照品的混合溶液，按照时间顺序记录微管蛋白的 聚合作用受到影响发生变化的紫外吸收值，判断5种化合物对微管蛋白活 性的影响在于促进微管蛋白聚合，抑制微管蛋白解聚。实施例2制备微管蛋白，与实施例l相同，称取长春花粉末2 g，加入10 mL异丙醇，振荡15 min，过滤之后， 将有机相干燥，干燥残渣溶于2mL0.01M醋酸溶液，用5mL环己烷提取 三次，无机相干燥后，重新溶于1 mL0.01M醋酸，并用微孔滤膜过滤，得 到35mg/ML，含长春花提取物的水溶液。取样同实施例l相同。仪器同实施例1。流动相A:乙腈B:乙腈一2 mM 二乙胺溶液(10 : 90) 梯度洗脱条件0 min—5 min 10 % A ， 5 min~45 min 10 % A—95 % A 45 min~~60 min 95%A。 流速l.OmL/min 检测波长220 nm。比较反应透析液和空白透析液所得的中药指纹图谱(附图3)，其中三 个化合物峰面积有所减小，经定性，有长春质碱、长春新碱和长春碱。结 合率分别为22%， 34%和15%。运用紫外吸收法，利用参照品对微管蛋白聚合作用的影响，判断3种 化合物对微管蛋白活性的影响在于抑制微管蛋白聚合。用紫外吸收法，利用参照品对微管蛋白聚合作用的影响，在微管蛋白 溶液中加入一定量参照品，在350 nm检测波长下，分别检测处于4 "C和 37 x:条件下微管蛋白与参照品的混合溶液，按照时间顺序记录微管蛋白的 聚合作用受到影响发生变化的紫外吸收值，判断3种化合物对微管蛋白活 性的影响在于抑制微管蛋白聚合，促进微管蛋白解聚。实施例3称取丽江山慈姑根茎粉末0.5 g，用石油醚振荡1小时提取两次，固体 残渣干燥后，用10 mL 二氯甲烷溶解在室温下提取30分钟，0.5 mL 10%的 氨水加入后振荡10 min,混合物静置30 min之后过滤，有机相蒸发干燥， 重新溶解于水，浓度为20mg/ML过滤备用。取样同实施例l相同。仪器同实施例l。梯度洗脱条件0 min—3 min 10% A， 3 min—12 min 10%A—60%A 12 min—13 min 60%A—10%A 13 min—20 min 10%A。 流速l.OmL/min 检测波长220 nm。比较反应透析液和空白透析液所得的中药指纹图谱(附图4)，其中化 合物峰面积有所减小，经定性，为秋水仙碱。结合率分别为33.7%。运用紫外吸收法，利用参照品对微管蛋白聚合作用的影响，判断此化 合物对微管蛋白活性的影响在于抑制微管蛋白聚合。用紫外吸收法，利用参照品对微管蛋白聚合作用的影响，在微管蛋白 溶液中加入一定量参照品，在350 nm检测波长下，分别检测处于4 "C和 37 。C条件下微管蛋白与参照品的混合溶液，按照时间顺序记录微管蛋白的 聚合作用受到影响发生变化的紫外吸收值，判断3种化合物对微管蛋白活 性的影响在于抑制微管蛋白聚合，促进微管蛋白解聚。
权利要求
1. 一种抗微管蛋白的中药活性成分筛选方法，其特征在于其操作过程如下，1)将待研究的中药提取液和微管蛋白溶液按照体积比1∶9形成的均相的混合体系，超滤或微透析取样并收集分子量≥18000的液体作为反应液；所述中药提取液的质量浓度为20-50mg/ML，微管蛋白溶液的质量浓度为10mg/ML；2)在与上述步骤相同的条件下，将待研究的中药提取液和不含微管蛋白的空白溶液按照体积比1∶9形成的均相的混合体系，超滤或微透析取样并收集分子量≥18000的液体作为空白液；所述中药提取液的质量浓度为20-50mg/ML；3)将上述的反应液和空白液分别进行反相高效液相色谱分析，建立反应获得的中药指纹图谱和空白样品的指纹图谱；4)将上述分析获得的反应透析液和空白中药指纹谱图进行比较，相对于空白中药指纹谱图，指纹图谱中面积减小峰为待研究的中药提取液中能够和微管蛋白分子发生相互作用的活性成分并鉴定。
2. 根据权利要求书l所述的抗微管蛋白的中药活性成分筛选方法，其 特征在于所述微管蛋白为用高速离心的方法从脑组织中提取微管蛋白； 其溶液为MES缓冲液。
3. 根据权利要求书l所述的抗微管蛋白的中药活性成分筛选方法，其 特征在于最后运用液相色谱一质谱和/或紫外吸收法，鉴定活性成分与微管蛋白的作用类型。
4. 根据权利要求书l所述的抗微管蛋白的中药活性成分筛选方法，其 特征在于所述待研究的中药为在临床或药理上有抑制癌细胞生长和有丝分裂的中药或天然产物。
5. 根据权利要求书l所述的抗微管蛋白的中药活性成分筛选方法，其 特征在于所述高效液相色谱分析条件为250X4.6mm，I.D.反相色谱柱，流 速1.0mL/min，梯度洗脱，检测波长227—350 nm。
6. 根据权利要求书l所述的抗微管蛋白的中药活性成分筛选方法，其特征在于所述中药与微管蛋白相互作用体系为水溶液或加入助溶剂的均 相作用体系；所述助溶剂可以为乙醇，四氢呋喃或二甲基亚砜，其于溶液 中的体积含量应^10%。
全文摘要
本发明涉及中药活性成分的筛选，具体地说是一种抗微管蛋白的中药活性成分筛选方法，1)将待研究的中药提取液和微管蛋白溶液形成的均相的混合体系，超滤或微透析取样作为反应液；2)在与上述步骤相同的条件下，将待研究的中药提取液和不含微管蛋白的空白溶液形成的均相的混合体系，超滤或微透析取样并收集液体作为空白液；3)将上述的反应液和空白液分别进行反相高效液相色谱分析，建立反应获得的中药指纹图谱和空白样品的指纹图谱；4)将上述分析获得的反应透析液和空白中药指纹谱图进行比较，相对于空白中药指纹谱图，指纹图谱中面积减小峰为待研究的中药提取液中能够和微管蛋白分子发生相互作用的活性成分并鉴定。
文档编号G01N30/89GK101210914SQ200610135120
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月27日 优先权日2006年12月27日
发明者亮 孔, 苏兴业, 邹汉法, 雷小元 申请人:中国科学院大连化学物理研究所