专利名称：一种可原位同时检测多种常见小分子药物的酶标芯片法的制作方法
技术领域：
一种可原位同时检测多种常见小分子药物的酶标芯片(Enzyme-link immunosorbentassay array，简称ELISA-array)技术，属于生物芯片技术领域。
背景技术：
兴奋剂(Dope)的原义是一种供赛马使用的鸦片类麻醉混合剂。当今体育界对兴奋剂的定义是能起到增强或辅助增强自身体能或控制能力，达到提高比赛成绩的某些药物或生理物质的总称。对于判定是否使用兴奋剂，国际上的通常惯例是如果在比赛中运动员把违禁药物以任何形式摄入体内，或者以不正常的方法应用了非正常量的生理物质，这种人为的非法提高运动成绩的做法就称为使用兴奋剂。当今世界上滥用兴奋剂的情况非常严重，以至于连前奥委会主席萨马兰奇都认为服用违禁药品是世界性问题，服用禁药者拥有更先进的科技水平，反禁药的斗争最多只能取得局部胜利，永远取得不了全面胜利。
另一方面，毒品滥用情况泛滥全球，吸毒者超过2亿，每年死亡人数20多万，因吸毒丧失劳动能力的1000多万人，全球每年销售总额大于10000亿美元，成为仅次于军火交易的世界第二大贸易。严峻的毒品泛滥对人类的生存和发展构成了严重的威胁，成为世界性公害。近年来，在国际毒潮的影响下，早在建国初期就已绝迹的毒品问题再次殃及我国，已呈蔓延之势，吸毒人群波及社会各阶层，据不完全统计，中国的吸毒人数已达100多万，我国已由毒品过境国转变为毒品过境与毒品消费并存的毒品受害国。毒品泛滥使毒品犯罪日趋严重，不仅发案率逐年上升，毒品数量越来越多，涉及地域越来越广，而且向国际性毒品犯罪发展，严重地危害着我国的社会治安和现代化建设事业的顺利发展。因此研究开发查禁毒品的新技术、新方法，不断增强和提高对毒品犯罪的发现和控制能力是十分必要的。
现有的小分子药物检测(如毒品检测或者兴奋剂检测)一般采用色谱、液谱和质谱联用的方法。药物经过机体的吸收、分布和代谢等过程，残存于生物样品中的药物及其代谢物不仅含量低，而且与多种杂质共存，为微量分析。要进行分析首要的第一个难题就是生物样品的前处理，不仅要选择合理的提取方法，还要经过分离和净化，尽可能地除去杂质后才能进行仪器分析。目前，世界上多采用联用仪器分析技术，就是对多组分有机化合物既要有分离又要有定性、定量鉴别功能，那就是气/质(Gas chromatography/Mass spectrometry，GC/MS)、液/质(Liquid chromatography/Mass spectrometry，Lc/Ms)、气/质/质(Gaschromatography/Mass spectrometry/Mass spectrometry，GC/MS/Ms)等分析法。这些大型分析仪器不仅价格昂贵，操作与维护复杂、难度大，而且一次只能分析一个样品，分析过程长，难以实现高通量并行检测的客观需求。因此，当前国际通行的兴奋剂检测一般并不能检查所有参加比赛的运动员，而不得不采用随机抽检的方式。这种方式显然不能体现公平竞争的运动精神。
生物芯片是于20世纪90年代发展起来的一门新兴技术，它的核心思想和优势就是利用各种手段以实现高通量并行检测的目的。生物芯片种类繁多，其中一个研究方向就是蛋白质芯片。国内外已经有很多生物技术公司和制药公司认识到了蛋白质芯片研究的重要意义和前景，正在从不同角度和方向进行着与此相关的研发工作。
酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)简称酶标法，是根据酶免疫测定原理发展的一种技术，可以用于各种抗原、抗体的检测。酶标方法应该说是一种常规的方法，早在1959年Berson等人就发明了检测胰岛素含量的放射免疫方法，并因此获得了诺贝尔医学奖。1987年有人用放免方法检测了740名运动员的hCG含量，21人超标，此举引起国际奥委会注意并很快将hCG列入禁药名单。2002年，用光刻掩膜真空沉积技术和ELISA法对免疫球蛋白进行分析，研制了适合于快速微量分析的金自组膜免疫芯片。2003年，通过表面等离子体谐振为基础的生物传感器芯片和竞争性ELISA法，用于检测吗啡和海洛因的主要代谢产物吗啡-3-葡萄糖苷酸。一般来说，免疫学反应大体可以分为两个主要类别，即竞争法和夹心法。夹心法具有很大的自身优势如灵敏准确、可多次放大，对所使用的抗体要求不高(不需要太高的亲和力)。但在使用竞争法时要求必须同时拥有两种可识别抗原分子不同免疫位点的抗体，这一要求对蛋白质类抗原来说很容易实现，因为一个蛋白分子常有多达几十个甚至数百个免疫识别位点；而对一些小分子物质，例如我们所研究的兴奋剂分子来说，这一要求往往难以实现。
小分子药物的分子量大多不足1000，本身仅具有抗原性，而不具有免疫原性(分子量低于10000的物质没有免疫原性)。小分子药物必须与大分子的免疫载体(BSA，KLH)相连接，才能够进行动物免疫。在小分子药物-大分子载体的连接物中，小分子本身位点是否能够有效暴露是一个很大问题，迄今为止尚未得到较好的解决，因此高特异性抗小分子抗体的制备非常困难。早期的竞争法一般以放射性同位素作为标记物，标记待检测分子的标准品。利用待测分子与标记分子竞争结合同一抗体位点的特性，根据放射性强度下降的值来反映被测物浓度。放射性强度越高，则说明体系中的竞争物越少；越低，则说明体系中竞争物越多。当然，人们并不希望过多使用同位素，所以这种方法现在出现了其它一些检测形式，如使用荧光方法、化学发光方法、电致化学发光方法等。但无论使用何种检测形式，为了达到一定的灵敏度要求，所有的竞争方法都共同需要一个高亲和力的特异抗体作为捕获分子，这对抗体的制备提出了较高的要求。
发明内容
1)整体结构一种在96孔酶标板孔底粘贴点样后薄膜进行检测生物分子的新型装置。特征为采用三维高分子多聚物薄膜或无机聚合物膜，将生物探针分子用机械手按照设计点阵进行点样，经切割后粘贴于酶标板孔底，用抗体、配体、配对核酸等进行特异识别，然后用原位显色方法结合图像采集设备判定被测物的浓度。
由于本方法采用通用的96孔酶标板，因此在加样和操作上易于被人接受并广泛推广应用。同时又增加了生物芯片高通量的优势，通过机械手在一个孔中同时点多个样品点，同时检测多种代测物质，使得酶标板的检测通量大大提高。
2)基底材料与DNA芯片不同，蛋白芯片不能直接在原位合成，只能采用点样或喷墨方法制作。制作蛋白芯片最大的难题在于如何将蛋白与基底材料有效结合的同时，仍能保持其原有的生物活性(免疫原性、抗体特异性)不变。可用于蛋白质芯片的基底材料有很多种，其选择的基本要求为①靶标蛋白以共价键形式与基底表面连接；②其它蛋白、配体或小分子物质能够特异性地与所固定的蛋白发生反应；③非特异性吸附低；④稳定性好，有较长的保存期。而且蛋白又很容易被自然降解或被细菌吞噬从而导致失活、变性，因此选择一个好的固定基底材料在制作蛋白芯片过程中就显得尤为重要。目前常用的基底材料有聚丙烯酰胺凝胶、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、硝酸纤维素膜(NC膜)、聚四氟乙烯、聚苯乙烯塑料、纳米陶瓷、琼脂糖凝胶、载玻片等。
以载玻片为基底的特点①无渗透性，不同抗体可以在玻片不同区域发生特异反应；②低浓度下即可发生相互作用，目前最低可达100pg/ml；③干燥保存不影响原有免疫活性。
以聚丙烯酰胺为基底也有诸多优势①分离范围广，最大可用于400Kd；②电泳过程可有效提高抗原和抗体的反应速度；③稳定性好，可多次使用。
以聚苯乙烯为基底的反应在96孔板底部点4*36方阵，外覆聚四氟乙烯(Teflon)，然后用电荷耦联装置(Charge-Coulpled Device，CCD)检测。该类芯片在反应形式上类似高通量的酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)，可一次检测大量样本。
一般认为，以固体为基底材料只能检测固相与液相间的反应，但少数情况下也可用来研究固相与气相间的反应。如用来检测乙醇、酯类、硫类等物质的气体形式。
3)检测形式将小分子药物和大分子载体蛋白进行偶连，制备成为可用于点样的溶液。点样采用机械手进行，样品点直径可以介于75微米到300微米之间，每个酶标孔可以容纳的样品点为1-81个。这种芯片既可以用于单一被测物的检测，如检测海洛因；也可以在复杂情况下同时检测多种被测物。目前以各种基底材料为基础的蛋白芯片分辨率多在ng/mL水平，已能基本满足临床检测的实际需要。
4)芯片切割在点样后的高分子薄膜上进行机械切割，制得与酶标孔直径吻合的均匀的圆形芯片，使用粘贴方式将圆形芯片粘贴于酶标板底部，制成酶标芯片。
5)显色本检测方法为原位显色。加入被检测样本，然后通过特异抗小分子药物抗体和辣根过氧化物酶(HRP)等的标记二抗或者是标记核酸，利用直接法或竞争抑制法进行检测。采用可以原位呈色反应的底物，如二胺基联苯胺(DAB)等，使阳性点出现有颜色的斑点(直接法)或使阳性点出现无颜色的斑点(竞争抑制法)。
6)检测设备本方法所使用的图像采集设备包括数码相机、CCD等，根据灰度值和配套软件，判定检测样品中含有代测生物分子的浓度。
7)普适性本方法可以适合多种检测领域，如毒品、自身免疫原、肿瘤标志物的检测等。
具体实施例通过海洛因吸毒致死者头发样本的检测，验证本方法的实际检测效果。
我们对数十例海洛因中毒致死者的头发进行了初步实验，一方面我们优化出了提取、分离条件，摸索了GC/MS的检测条件；另一方面我们通过选择高分子膜、油性胶、优化抗原点样浓度等，已经用酶标芯片技术检测出了中毒致死者的头发、血及尿中海洛因的代谢物吗啡，基本掌握了本方法的关键技术。在此工作基础上顺延，不断增加检测品种，选择合适的抗体配对、降低交叉反应，即有可能研制出可以同时检测多种常见小分子药物的全新方法。酶标芯片技术既具有样品前处理简便、灵敏快速、又具有高通量的特点，可用于多人、多种常见毒品的定性、定量测定，以满足毒品案件鉴别、禁毒和防毒的需要，同时也力争为2008年北京奥运会增添一项新的兴奋剂检测技术。
权利要求
1.一种在96孔酶标板孔底粘贴点样后薄膜进行检测生物分子的新型装置。特征为采用三维高分子多聚物薄膜或无机聚合物膜，将生物探针分子用机械手按照设计点阵进行点样，经切割后粘贴于酶标板孔底，用抗体、配体、配对核酸等进行特异识别，然后用原位显色方法结合图像采集设备判定被测物的浓度。
2.根据权利要求1所述的薄膜包括聚丙烯酰胺凝胶、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、硝酸纤维素膜(NC膜)、聚四氟乙烯、聚苯乙烯塑料、纳米陶瓷、琼脂糖凝胶等。
3.根据权利要求1所述的点样采用机械手进行，样品点直径可以介于75微米到300微米之间，每个酶标孔可以容纳的样品点为1-81个。
4.根据权利要求1所述的薄膜经过点样后进行机械切割，制得与酶标孔直径吻合的均匀的圆形芯片，使用粘贴方式将圆形芯片粘贴于酶标板底部，制成酶标芯片。
5.根据权利要求1所述的检测方法为原位显色。加入被检测样本，然后通过特异抗小分子药物抗体和辣根过氧化物酶(HRP)等的标记二抗或者是标记核酸，利用直接法或竞争抑制法进行检测。采用可以原位呈色反应的底物，如二胺基联苯胺(DAB)等，使阳性点出现有颜色的斑点(直接法)或使阳性点出现无颜色的斑点(竞争抑制法)。
6.根据权利要求1所述的图像采集设备包括数码相机、CCD等，根据灰度值和配套软件，判定检测样品中含有代测生物分子的浓度。
7.根据权利要求1所述的方法采用通用的96孔酶标板，因此在加样和操作上易于被人接受并广泛推广应用。同时又增加了生物芯片高通量的优势，通过机械手在一个孔中同时点多个样品点，同时检测多种代测物质，使得酶标板的检测通量大大提高。
8.根据权利要求1所述的方法可以适合多种检测领域，如常见毒品、自身免疫原、肿瘤标志物、细胞因子系列的检测等。
全文摘要
一种可原位同时检测多种常见小分子药物的酶标芯片技术属于生物芯片技术领域。本研究巧妙结合生物芯片技术和酶联免疫分析方法各自的优势，开发一种全新的酶标芯片技术，可高通量多人份同时对血、尿等中的多种常见毒品进行检测，以满足毒品案件鉴别、禁毒和防毒的需要，同时也力争为2008年北京奥运会增添一项新的兴奋剂检测技术。本研究使用高分子多聚物薄膜为基质材料，通过机械手进行点样，制得酶标芯片。然后通过特异二抗和酶促反应，根据阳性点灰度值判定检测样品中毒品的种类和浓度。本研究的检测结果可用气－质、液－质联用等方法进行比对和验证。
文档编号G01N33/547GK101078730SQ200610145038
公开日2007年11月28日 申请日期2006年11月30日 优先权日2006年5月22日
发明者杜宏武, 魏玉芝, 李绍旭 申请人:杜宏武, 魏玉芝, 李绍旭