专利名称：一种用hplc法分析西多福韦原料及其制剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种高效液相分析方法，尤其是一种用HPLC法分析分离西多福 韦原料及其制剂的方法。
背景技术：
西多福韦是开环核苷酸类似物，能抑制病毒DNA聚合酶，对巨细胞病毒有 强的抑制作用，对单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、人类乳头瘤病毒等也有很强的 抑制作用。被广泛的用于免疫功能低下患者巨细胞病毒感染的预防和治疗。其结 构式为
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其在合成的过程当中有几步中间体(有关物质)需要严格控制，其结构式分
别为
中间体i
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中间体2
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中间体3
对于合成西多福韦中引入的有关物质，不论是在原料药还是制剂中都是需要 进行质量控制的。因此，实现西多福韦及其有关物质的分离在西多福韦的合成和 制剂过程的质量控制方面具有现实意义。
经反复试验发现，用以季铵盐为键合相的强阴离子交换柱(SAX (250 mmx4.6 mm))，釆用甲醇一 (0.01 mol/L磷酸二氢钠，磷酸调pH4.0) =40 : 60 为流动相，可以将西多福韦及其有关物质进行有效分离，从而可以准确控制西多 福韦原料药及制剂的质量。本发明的方法能简便、快速、准确地分析西多福韦的 纯度和含量并能有效的控制其有关物质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分析分离西多福韦及其有关物质的高效液相色 谱方法，从而保证西多福韦的纯度，实现其原料及制剂的质量控制。
本发明所述的用高效液相色谱法分析西多福韦的纯度以及分离其有关物质 的方法，是采用以季铵盐为键合相的强阴离子交换柱(SAX(250mmx4.6mm)), 采用甲醇—(0.01 mol/L磷酸二氢钠，磷酸调pH4.0) =40:60为流动相。
上述所说的离子交换色谱柱选自以季铵盐为键合相的强阴离子交换柱(SAX (250 mmx4.6 mm))。
本发明的流动相中有机相选自下列化合物甲醇、乙醇、乙腈。
本发明的方法，有机相一缓冲液的体积比为50 : 50 20 : 80。 上述所说的流动相中缓冲液的pH=3 4.5。 本发明所述的分析分离方法，可按照以下方法实现
0)取各中间体与西多福韦的混合样品适量，用缓冲液溶解样品，配制成每 1 mL含混合样0.5 mg的样品溶液。
(2) 设置流动相流速为1.0mL/min，检测波长为237nm，柱温为室温。
(3) 取(1)的样品溶液20 uL注入液相色谱仪，完成西多福韦及其有关物质
的分离与分析。 其中
高效液相色谱仪岛津LC-10ATvp， SPD-M10Avp 色谱柱SAX (250mmx4.6mm)
流动相甲醇一(0.01mol/L磷酸二氢钠，磷酸调pH4.0) =40 : 60 流速1.0mL/min 检测波长260 nm 柱温室温
进样体积20 PL
本发明采用强阴离子交换色谱柱SAX (250mmx4.6mm)，能够有效的分离 西多福韦及其有关物质，准确测定西多福韦的纯度；本发明解决了西多福韦及其 有关物质的分离问题，从而确保了西多福韦原料药及其制剂的质量可控。(结果 见附图1)
图1最优选条件的PHLC图，图1中1号峰为中间体3，2号峰为中间体2， 3号峰为西多福韦，4号峰为中间体1，可以看出在该条件下西多福韦主峰可以 和三个中间体完全分离开来，且西多福韦主峰在llmin左右。
图2有机相为乙腈的HPLC图，图2中1号峰为中间体3和中间体2, 2 号峰为西多福韦，3号峰为中间体1。可以看出，西多福韦与中间体2，中间体3 分离良好，且刚好可以和中间体l达到基线分离。
图3甲醇与缓冲液比例为20 : 80时的HPLC图，图3中1号峰为中间体3， 2号峰为中间体2， 3号峰为西多福韦，4号峰为中间体1，可以看出在该条件下 西多福韦主峰可以和三个中间体完全分离开来，且西多福韦主峰在6min左右。
图4缓冲液浓度为0.02 mol/L时的HPLC图，图4中1号峰为中间体3， 2 号峰为中间体2， 3号峰为西多福韦，4号峰为中间体1，可以看出在该条件下西 多福韦主峰可以和三个中间体完全分离开来，且西多福韦主峰在6min左右。
图5 pH为3时的HPLC图，图5中1号峰为中间体3， 2号峰为中间体2， 3号峰为西多福韦，4号峰为中间体1，可以看出在该条件下西多福韦主峰可以 和三个中间体完全分离开来，且西多福韦主峰在6min左右。
图6 pH为4.5时的HPLC图，图6中1号峰为中间体3和中间体2， 2号 峰为西多福韦，3号峰为中间体1。可以看出，西多福韦与中间体2，中间体3分离良好，且刚好可以和中间体1达到基线分离。
具体实施方式
-实施例1
仪器与条件
高效液相色谱仪曰本岛津LC-10Avp， SPD-10Avp; 色谱柱SAX (250mmx4.6mm)强阴离子交换柱；
流动相乙腈一 (0.01 mol/L磷酸二氢钠缓冲液，稀磷酸调pH至4) =40
:60;
流速1.0mL/min; 检测波长260 nm;
柱温室温； 进样体积20 UL。 实验步骤
分别称取3个中间体与西多福韦各5mg，置于25mL容量瓶中，加流动相 溶解并稀释置刻度，摇匀，作为混合样品溶液。并分别称取单一中间体及西多福 韦各5mg，分别置于4个25mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释置刻度，摇匀， 作为定性对照溶液。
分别取各对照溶液和混合样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记 录色谱图。结果见附图2，图中1号峰为中间体3和中间体2, 2号峰为西多福 韦，3号峰为中间体1。可以看出，西多福韦与中间体2，中间体3分离良好， 且刚好可以和中间体1达到基线分离。
实施例2
仪器与条件
高效液相色谱仪日本岛津LC-10Avp， SPD-10Avp; 色谱柱SAX (250mmx4.6mm)强阴离子交换柱；
流动相甲醇—(0.01 mol/L磷酸二氢钠缓冲液，稀磷酸调pH至4) =20
:80;
流速1.0mL/min; 检测波长260 nm;
柱温室温； 进样体积20 UL。
实验步骤
分别称取3个中间体与西多福韦各5 mg，置于25 mL容量瓶中，加流动相 溶解并稀释置刻度，摇匀，作为混合样品溶液。并分别称取单一中间体及西多福 韦各5mg，分别置于4个25mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释置刻度，摇匀， 作为定性对照溶液。
分别取各对照溶液和混合样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记 录色谱图。结果见附图3，图中1号峰为中间体3， 2号峰为中间体2， 3号峰为 西多福韦，4号峰为中间体1，可以看出在该条件下西多福韦主峰可以和三个中 间体完全分离开来，且西多福韦主峰在6 min左右。
实施例3
仪器与条件
高效液相色谱仪日本岛津LC-10A甲，SPD-10Al^;
色谱柱SAX (250mmx4.6mm)强阴离子交换柱；
流动相甲醇一 (0.02 mol/L磷酸二氢钠缓冲液，稀磷酸调pH至4) =40
:60;
流速l.OmL/tnin; 检测波长260 nm; 柱温室温；
进样体积20 UL。
实验步骤
分别称取3个中间体与西多福韦各5 mg，置于25 mL容量瓶中，加流动相 溶解并稀释置刻度，摇匀，作为混合样品溶液。并分别称取单一中间体及西多福 韦各5mg，分别置于4个25mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释置刻度，摇匀， 作为定性对照溶液。
分别取各对照溶液和混合样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记 录色谱图。结果见附图4，图中1号峰为中间体3， 2号峰为中间体2， 3号峰为 西多福韦，4号峰为中间体1，可以看出在该条件下西多福韦主峰可以和三个中 间体完全分离开来，且西多福韦主峰在6min左右。
实施例4
仪器与条件
高效液相色谱仪R本岛津LC-10Avp， SPD-10Avp; 色谱柱SAX (250mmx4.6mm)强阴离子交换柱；
流动相甲醇一 (0.01 mol/L磷酸二氢钠缓冲液，稀磷酸调pH至3) =40
:60;
流速1.0mL/min; 检测波长260 nm; 柱温室温； 进样体积20 WL。 实验步骤
分别称取3个中间体与西多福韦各5 mg，置于25 mL容量瓶中，加流动相 溶解并稀释置刻度，摇匀，作为混合样品溶液。并分别称取单一中间体及西多福 韦各5mg，分别置于4个25mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释置刻度，摇匀， 作为定性对照溶液。
分别取各对照溶液和混合样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记 录色谱图。结果见附图5，图中1号峰为中间体3， 2号峰为中间体2， 3号峰为 西多福韦，4号峰为中间体1，可以看出在该条件下西多福韦主峰可以和三个中 间体完全分离开来，且西多福韦主峰在6 min左右。
实施例5
仪器与条件
高效液相色谱仪日本岛津LC-10A甲，SPD-10Avp;
色谱柱SAX (250mmx4.6mm)强阴离子交换柱；
流动相甲醇—(0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液，稀磷酸调pH至4.5) =40
60;
流速1.0mL/min; 检测波长260 nm; 柱温室温； 进样体积20 liL。实验步骤
分别称取3个中间体与西多福韦各5mg，置于25mL容量瓶中，加流动相 溶解并稀释置刻度，摇匀，作为混合样品溶液。并分别称取单一中间体及西多福 韦各5mg，分别置于4个25mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释置刻度，摇匀，
作为定性对照溶液。
分别取各对照溶液和混合样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记 录色谱图。结果见附图6，图中1号峰为中间体3和中间体2， 2号峰为西多福 韦，3号峰为中间体1。可以看出，西多福韦与中间体2，中间体3分离良好， 且刚好可以和中间体1达到基线分离。
权利要求
1. 一种高效液相色谱法分析分离西多福韦及其合成中引入的有关物质的方法，其特征在于采用阴离子交换柱，有机相-不同pH和不同离子浓度的缓冲液为流动相。
2. 根据权利要求1所述的分析分离方法，选择以季铵盐为键合相的强阴离子交 换柱(SAX (250mmx4.6mm))进行分析分离。
3. 根据权利要求1所述的分析分离方法，所述的有机相选自甲醇、乙醇或乙腈。
4. 根据权利要求3所述的分析分离方法，所述的有机相选自甲醇。
5. 根据权利要求1所述的分析分离方法，所述的流动相中有机相与缓冲液的体 积比为60 : 40 10 :卯，优选50 : 50 20 : 80，最优选40 : 60。
6. 根据权利要求1所述的分析分离方法，所述的流动相中的缓冲液为磷酸二氢 钠缓冲液。
7. 根据权利要求6所述的分析分离方法，所述的磷酸二氢钠缓冲液的浓度为 0.01 mol/L 0.04 mol/L，优选0.01 mol/L 0.02 mol/L，最优选0.01 mol/L。
8. 根据权利要求l所述的分析分离方法,流动相中缓冲液的pH选则范围为2.5 6，优选pH3 4.5，最优选pH4。
9. 根据权利要求1所述的分析分离方法，其特征在于所述的方法包括以下几个 步骤(1) 取各中间体与西多福韦的混合样品适量，用流动相溶解样品，配制成每 i mL含雷尼酸锶及其中间体0.05 1 mg的样品溶液；(2) 设置流动相流速为0.8 1.2 mL/min，检测波长为260 nm;(3) 取(1)的样品溶液2-50 "L注入液相色谱仪，记录色谱图。
10. 根据权利要求9所述的分析分离方法，其特征在于流动相的流速优选为1.0 mL/min。
全文摘要
本发明公开了一种用HPLC法分析西多福韦原料及其制剂的方法，采用此方法可以很好的将西多福韦及其合成过程中引入的有关物质进行有效分离，从而控制西多福韦的质量，准确测定西多福韦原料药及其制剂的含量，指示西多福韦及其制剂的稳定性。本发明所建立的方法专属性强，准确度高，操作简便。
文档编号G01N30/00GK101206209SQ200610165389
公开日2008年6月25日 申请日期2006年12月19日 优先权日2006年12月19日
发明者杨 胡 申请人:北京德众万全药物技术开发有限公司