基于金属螯合脂质的促凝血剂的制作方法

文档序号:6121506

专利名称::基于金属螯合脂质的促凝血剂的制作方法凝血剂对相关申请的引用本申请要求2005年2月16日提交的名称为"通用的促凝血剂,,的美国临时申请No.60/653,695的权益,通过引用将其全部内容合并在此,除了与本申请不一致之处。联邦政府赞助的研究或开发本申请得到以下研究拨款和合同的部分资助国家卫生研究院(NHLBI)拨款No.ROlHL47104。美国政府在这项发明中可以享有某些权利。背景仅仅列出凝结因子和Ca^的凝结级联的示意图在图15中示出。在该图中,各种凝结因子通过它们的罗马数字来指明(即,因子vn通过vn来指明)。当血液和某些人工表面之间发生接触时,血液凝固的内在途径(也称为接触途径)被启动。在发生引起组织因子(也鉴定为因子III)暴露的血管损伤时,血液凝固的外在途径(也称为组织因子途径)被启动。点线箭头代表在外在和内在途径之间的交叉点。这两个途径在因子X向Xa的活化之处汇合。因子Xa在因子VII到Vila的进一步活化中起到作用。活性的因子Xa水解并活化凝血酶原成为凝血酶。然后凝血酶活化因子XI、VIII和V,促进级联。最终,凝血酶的作用是将纤维蛋白原转化为血纤蛋白,其形成凝块。组织因子是一种细胞表面蛋白,其在正常的止血和各种血栓性的疾病中是触发血液凝固系统的原因[1,2]。组织因子通过紧密地结合以及变构地活化凝结因子VIIa(VIIa)来实现这一点,所述凝结因子VIIa(VIIa)是一种血浆丝氨酸蛋白酶。组织因子和VIIa的1:1复合物(TF:VIIa)是血液凝固的组织因子途径中的第一个酶,Vila作为催化亚单位起作用、组织因子作为调节亚单位起作用。当TF:VIIa经由有限的蛋白水解作用活化两种血浆丝氨酸蛋白酶酶原(凝血因子IX和X)时,凝结级联由此被触发,最终引起由血纤蛋白凝块和活化的血小板组成的止血栓塞的形成。野生型人类组织因子(TF)是261或263个氨基酸的单多肽链,含有四个半胱氨酸残基,其形成两个二硫键。它是一种I型整合膜蛋白,是指它的N-末端位于细胞外侧,它的C-末端在细胞质内。TF具有单个3争膜结构域,其将蛋白质锚定在质膜中。TF的细胞外结构域是结合于并且变构地活化Vila的部分。TF的细胞质结构域对于TF促凝血活性是可有可无的,但是TF的膜锚定对于完整的TF活性是必需的[3]。已经通过重组手段产生了既不具有跨膜结构域也不具有细胞质结构域的截短的、可溶形式的组织因子(sTF)[3-7]。不同于膜锚定TF,sTF是高度水溶性的[5,8]。虽然sTF保持了结合Vila并且变构地活化它的能力(通过小的、肽基-酰胺底物的水解来测量的),sTF具有大大地降低的促凝血活性[4,5,9,10]。已经显示了,sTF在支持酶原因子VII向活性酶形式Vila转化方面是选4奪性缺陷的[9,11]。(促进因子VII向VIIa转变的能力是TF的重要功能之一[12]。这种功能的丧失解释了sTF对正常人类血浆的低促凝血活性[9])。sTF的独特的缺陷已经被利用来创建凝结分析,所述分析定量血浆Vila水平而不受酶原因子VII的干扰[13]。另一方面,sTF促凝血活性中的这种缺陷意味着在标准的凝结分析如凝血酶原时间(PT)分析中它不能替代膜锚定的TF。由于sTF的溶解性质,相比膜锚定的TF,sTF显著地更容易表达、纯化和处理。在用于产生sTF的某些表达系统中,sTF的分泌被靶向Eco//的周质间隙,一种容许形成二硫键的氧化环境[6]。通过渗透休克容易地从Eco/Z的周质间隙释放sTF,此外,sTF不需要任何特殊条件来维持水溶性。利用工程化到sTF的N-末端上的肽表位(HPC4表位),sTF可以通过免疫亲和层析从五.co"释放物中纯化[6]。在存在钙离子的情况下,sTF-HPC4融合蛋白以高亲和性与固定的HPC4抗体结合。在洗涤免疫亲和珠子之后,使用EDTA洗脱纯化的sTF。表达产量是每升Eco//培养物大约20mgsTF。与sTF相比,重组的、膜锚定的组织因子(rTF)在Eco//细胞中以低得多的水平表达,在纯化过程的所有阶段,rTF更难以处理。用于sTF的相同的目标载体被用于rTF的Eco//表达。(它将rTF的细胞外结构域靶向周质间隙,而膜锚定物保持嵌入在Eco"的内膜中。)从Eco"提取rTF需要细菌的完全溶解。还需要使用洗涤剂,用于从所述膜提取rTF,以及保持rTF溶解。rTF的纯化使用与纯化sTF相同的免疫亲和层析方法来实现,不同之处是洗涤剂(一般地,0.1%TritonX-100)被加入到rTF所暴露的所有溶液中。在五.co〃表达系统中rTF的表达产量是每升Eco/!'培养物大约1mg,其比sTF的产量至少低20倍。凝血酶原时间(PT)测试;陂广泛用于监视通过香豆素的口腔抗凝治疗,作为血液凝固系统的一般性筛选测试,并作为特定因子分析的基础。PT测原)、VII和X的血浆水平,并取决于两种非维生素K依赖性蛋白质一一因子V和纤维蛋白原一一的水平。香豆素治疗对抗维生素K羧化酶/还原酶循环,因而抑制谷氨酸残基向Y-羧基谷氨酸的翻译后转变。维生素K依赖性凝结因子在它们的Gla结构域中含有必需的Y-羧基谷氨酸残基。接受香豆素治疗的患者将因而产生具有降低的促凝血活性的低度羧基化的维生素K依赖性凝结因子。这延长了PT时间,主要由于因子II、VII和X的水平的降低。使用香豆素的成功的口腔抗凝治疗需要小心监视患者的PT时间,以实现有效水平的抗凝作用同时最小化出血并发症(由Hirsh等人综述[14])。PT测试是通过将柠檬酸化的血浆样品与凝血活酶试剂混合以及测量形成凝块的时间而进行的。凝血活酶试剂中的活性成分是组织因子。在1990年纯化的TF变为可获得之前,凝血活酶试剂由人类或动物来源的相对粗的组织提取液制成。近年来,已经使用高度纯化的rTF来制备凝血活酶试剂,其完全由限定的成分组成[15,16]。重组凝血活酶试剂潜在地优于组织衍生的试剂,因为它们的组成以及由此的它们的性质更容易由生产厂家来控制。为了制备重组的凝血活酶试剂,将rTF重构到由合适的磷脂混合物组成的单层磷脂泡嚢内。(TF重构到磷脂泡嚢中有时称为"重脂质化(relipidation)"。)为了在血液凝结中有效地起作用,所述泡嚢必须含有具有净负电荷的一些磷脂,丝氨酸磷脂是最有效的带负电磷脂。各种方法可以用于将rTF掺入到磷脂泡嚢中(由Smith和Morrissey讨论[17])。触发血液凝固的第二种途径是内在的或接触途径。当血浆接触某些人工的表面,例如玻璃、硅土或高岭土时,这种非组织因子依赖性途径被活化。当激肽释放酶原、高分子量激肽原和因子XII暴露于带负电的表面时,这种接触途径被启动。这引起起始复合物的形成,所述起始复合物致使因子XII经由有限的蛋白水解作用转变成它的活性酶形式,因子XIIa。然后因子Xlla在4丐依赖性反应中将因子XI转化成XIa,其随后增殖凝结级联,最终引起凝血酶的产生和血纤蛋白的聚合来产生凝块。为了测量患者中所有止血相关的凝结因子的水平,必须进行两种凝结测试。一种是早先提及的PT测试,另一种是活化部分凝血活酶时间(aPTT)测试。由于PT测试使用了组织因子来活化凝结级联,它对于外在途径中的凝结因子是敏感的。aPTT测试使用人工的凝结活化剂(例如高岭土或硅土),因而对于内在途径中的改变是敏感的。没有一种测试对于所有止血相关的凝结因子是敏感的,因而为了确定患者不具有出血体质(例如,在手术之前),必须使用两种测试来评估患者血浆的凝结能力。此外,aPTT测试;故广泛地用于监视肝素治疗,并且也是其他临床的凝结分析的基础,例如对于抗磷脂抗体综合症和狼瘠抗凝剂的分析。商业性aPTT试剂的性质因生产厂家的不同而不同,特别是关于使用了哪种人工的凝结活化剂。aPTT分析也被证明难以标准化。寡聚组氨酸标签,一般由掺入到重组蛋白质的N-末端或C-末端的几个连续的组氨酸残基组成,被广泛地用来便于这种蛋白质的纯化[19]。含有这样的寡聚组氨酸标签的重组融合蛋白将以合理地高的亲和性结合过渡金属离子,例如Ni+2。这种性质可以被采用,用于使用金属螯合基团的衍生物例如附着于固相支持物的氮基三乙酸(NTA)的亲和纯化。NTA将螯合镍离子,以一定方式呈现它们,使得结合的Ni"仍然可以与重组蛋白质的寡聚组氨酸标签紧密地相互作用。然后可以使用咪唑特异性地洗脱结合到固定的NTA-Ni"复合物上的重组融合蛋白。镍螯合脂质DOGS-NTA-Ni(l,2-二油酰基-sn-甘油基-3-[(N(5-氨基-l-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰]镍盐)是商业上可获得的。DOGS-NTA-Ni含有附着于二油酰基-甘油酯的结合镍的NTA部分。DOGS-NTA-Ni主要被结构生物学家使用来在人工的膜表面上产生寡聚组氨酸标记的重组蛋白质的二维晶体,以通过电子晶体成像来获得结构信息[20]。概述在第一个方面,本发明是一种凝血活酶试剂,包含(i)活化的sTF,(ii)金属螯合脂质,(iii)选自N产、Cu2+、Co"和其混合物的金属离子,以及(iv)磷脂。在第二个方面,本发明是一种aPTT试剂,包含(i)金属螯合剂,(ii)选自N产、Cu"和其混合物的金属离子,以及(iii)磷脂。在第三个方面,本发明是一种活化的sTF。在第四个方面,本发明是组合PT和aPTT测试试剂盒,包含(l)活化的sTF,(ii)金属螯合脂质,(iii)选自N产、Cu"和其混合物的金属离子,以及(iv)磷脂。在第五个方面,本发明是一种用于促进凝结的组合物,包括(i)金属螯合剂,(ii)选自Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+和其混合物的金属离子,以及(iii)任选地,包含TF的细胞外结构域和具有至少2个组氨酸残基的寡聚组氨酸部分的活化的sTF。定义Ni-NTA-DOGS或DOGS-NTA陽Ni是指1,2-二油酰基墨sn-甘油基-3-[(N(5墨氨基-l-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰](镍盐)。NTA-DOGS或DOGS-NTA是指1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-[(N(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰]。VII或因子VII是指凝结因子VII(酶原)。Vila或因子Vila是指凝结因子VIIa(活性酶)。X或因子X是指凝结因子X(酶原)。Xa或因子Xa是指凝结因子Xa(活性酶)。vm或因子vni是指凝结因子vm(酶原)。IX或因子IX是指凝结因子IX(酶原)。XI或因子XI是指凝结因子XI(酶原)。XIa或因子XIa是指凝结因子XIa(活性酶)。XII或因子XII是指凝结因子XII(酶原)。XIIa或因子XIIa是指凝结因子XIIa(活性酶)。PK是指激肽释放酶原。HK是指高分子量激肽原。PNP是指混合的正常血浆。NTA是指氮基三乙酸或氮基三乙酸部分。rTF是指重组的、膜锚定的组织因子。sTF是指可溶的组织因子,一种既不具有跨膜结构域也不具有细胞质结构域的截短的、可溶形式的组织因子[3-7]。TF:VIIa是指组织因子和因子Vila的复合物。aPTT是一种含有血液凝固的接触途径的活化剂、用于aPTT测试的试剂。金属螯合脂质是一种与金属螯合部分共价结合的脂质部分,例如NTA-脂质(例如,NTA-DOGS)。金属螯合剂含有共价结合的金属螯合部分,例如金属螯合脂质(例如,NTA-DOGS)和NTA珠子。His是指组氨酸部分或残基。寡聚组氨酸是含至少两个组氨酸残基的部分。优选的,所述组氨酸残基是连续的,在这种情况下,寡聚组氨酸也可以表示为(His)n,其中n优选至少是2,更优选是2-10。FVII是指展现了人类因子VII的因子VII凝结活性的任何蛋白质。通过在以下的分析中比较得出与人类因子VII相同的凝结时间所需的蛋白质的数量,来确定蛋白质的因子VII凝结活性50pl柠檬酸化的缺乏因子VII的血浆,与人类因子VII或所述蛋白质一同,在37。C在比色杯中孵育2分钟,此后通过添加100pl预暖的凝血活酶试剂来启动凝结,使用血凝度计,例如ST4血凝度计(DiagnosticaStago,Parsippany,NJ)来测量凝块形成的时间。优选地选择人类因子VII的数量和凝血活酶试剂的种类来得到10-15秒的凝结时间。实现给定凝结时间的人类因子VII的摩尔数量除以得到相同凝结时间的蛋白质的摩尔数量,这得出了所述蛋白质的相对因子VII凝结活性。优选地,FVII具有人类因子VII的至少1%的凝结活性。FVII包括,例如,天然的人类因子VII、天然的人类因子VIIa、重组的人类因子VII[33]和Vila,和其他哺乳动物因子VII和VIIa(例如天然的兔因子VII和天然的兔因子VIIa)。"因子Vila等价量"是指与特定数量的天然人类因子Vila具有相同凝结活性的存在的FVII的数量。例如,"FVII的lOng因子VIIa等价量"是指与10ng天然人类因子Vila具有相同凝结活性的存在的FVII的数量。活化的sTF是指任何肽、蛋白质或多肽,其在C-末端包括金属结合结构域(例如,(His)n,其中n是2-10),在含有pH7.4的50mMTris-HCl緩冲液的100mMNaCl溶液中具有的溶解度是sTF的溶解度的至少10%,以及一种试剂,其含有活化的sTF(l吗/ml)、金属(IO^M)和15%螯合所述金属的金属螯合脂质、5%PS、40%PE和40%PC(到总脂质浓度100pM),用作凝血活酶试剂(预热到37。C的100iil试剂与混合自正常个体的50nl血浆混合)在1分钟内引起凝结。实例包括sTF(His)6、sTF-5AA-(His)6和sTF-2(His)5。金属结合结构域是以下部分,其在含有pH7.4的50mMTris-HCl緩冲液的100mMNaCl溶液中以至少(His)2的亲和性结合金属。实例包括(His)n,其中n是2-10。TF是指任何组织因子蛋白,例如rTF和天然的哺乳动物组织因子。凝血活酶试剂是指任何试剂,其含有TF并且当预热到37。C的100pl所述试剂与混合自正常个体的50|11血浆混合时将在1分钟内引起凝结;当纯净并且加热到37。C时在2分钟内不凝结。附图的简要说明图1是sTF的C-末端以及寡聚组氨酸标记的三种变体的氨基酸序列,和编码这些氨基酸序列的核普酸序列。不同于sTF的序列以下划线表示,组氨酸残基以斜体表示。图2A、2B和2C是显示在使用0.3pg/mlsTF(His)6和100SUV的PT分析中脂质组合物对凝结时间的影响的图表。A:含有5%PS、15%DOGS-NTA-Ni以及变化数量的PE的泡嚢;B:含有15%DOGS-NTA-Ni、40%PE以及变化数量的PS的泡嚢;C:含有5%PS、30%PE以及变化数量的DOGS-NTA-Ni的泡嚢。图3是在采用0.3吗/mlsTF(His)6和变化浓度的12.5。/。Ni-脂质的PT分析中凝结时间对总脂质浓度的依赖性的图表。图(三角形)的PT分析中TF活性的图表。x-轴上标出的TF浓度是在稀释的试剂中的浓度。图5是在存在15。/。Ni-脂质的情况下VIIa与sTF(His)6相互作用的结合等温线的图表。图6是sTF(His)6/15%Ni-脂质PT试剂与商业上可获得的PT试剂的比较结果的柱形图。使用混合的正常血浆(PNP)或各种缺乏因子的血浆测量凝结时间。图7A、7B和7C是显示在使用100SUV的aPTT分析中脂质组合物对凝结时间的影响的图表。A:含有5。/。PS、15%DOGS-NTA-Ni以及变化数量的PE的泡嚢;B:含有15%DOGS-NTA-Ni、40。/。PE以及变化数量的PS的泡嚢;C:含有5%PS、40%PE以及变化数量的DOGS-NTA-Ni的泡嚢。图8是在aPTT分析中凝结时间对总磷脂浓度(15%Ni-脂质)的依赖性的图表。图9是在使用15。/。Ni-脂质与混合的正常血浆的aPTT分析中变化的预孵育时间(在添加钙离子之前)对凝结时间的影响的图表。图10是在aPTT分析中对于正常的混合血浆(圆圈)对比缺乏VIII的血浆(三角形)的15%Ni-脂质的凝结活性的图表。图11是15%Ni-脂质aPTT试剂与商业上可获得的aPTT试剂的比较结果的柱形图。使用混合的正常血浆(PNP)或各种缺乏因子的血浆在aPTT分析中测量凝结时间。图12A和12B是使用含有变化浓度的NiS04(圆圈)、CuS04(菱形)、CoCl2(三角形)或ZnCl2(空心倒三角形)的改变的凝血活酶试剂进行的PT分析的凝结时间的图表。在x-轴上标出的金属离子浓度是在改变的试剂中采用的浓度。A和B是相同数据、在不同的金属离子浓度范围上的曲线。图12C是使用含有变化浓度的NiS04(圓圈)、CuS04(菱形)、CoCl2(三角形)或ZnCb(空心倒三角形)的改变的试剂进行的aPTT分析的凝结时间的图表。在x-轴上显示的金属离子浓度是在改变的试剂中采用的浓度。图13是在PT分析中sTF(His)6(正方形)、sTF-2(His)5(菱形)和sTF-5AA-(His)6(倒三角形)的凝结时间的图表。每种类型的TF与含有提高比例的DOGS-NTA-Ni的SUV孵育。图14是在存在15%Ni-脂质的情况下VIIa与不同类型的TF的相互作用的结合等温线的图表,其中所述TF的类型如下sTF(His)6(正方形)、sTF-2(His)5(菱形)和sTF-5AA-(His)6(倒三角形)。图15是凝结级联的示意图。图16(a)和16(b)是显示关于sTF-5AA-(His)6提高Vila活化X的速率的能力的ECso的图表。变化浓度的纯化sTF或sTF-5AA-(His)6在96孔平板中孵育,所述平板预先用10%DOGS-NTA-Ni、20%PS、70。/。PC的混合物(实心符号)或20%PS、80%PC的混合物(空心符号)包被;使用40nMX测量Xa产生的初始速率,表示为用1nMsTF-5AA-(His)6在包被含有DOGS-NTA-Ni的脂质混合物的孑L中观察到的活性的百分比。(a)sTF-5AA-(His)6(圆圈)或sTF(正方形)提高Vila活化X的速率的能力的浓度依赖性。(b)画面(a)的sTF-5AA-(His)6数据是用从0延伸到50nM的x-轴标绘的。图17是在聚苯乙烯血凝度计比色杯的孔中干燥的sTF-5AA-(His)6连同脂质混合物的凝结活性的图表。每个孔的干燥的脂质数量在x-轴上给出。每个孔还容纳50^等分量的20nMsTF-5AA-(His)6。使用混合的正常人血浆测定凝结时间。脂质混合物是NiPCPSPE(实心圓圏);PCPS(空心倒三角形);PCPSPE(空心正方形)和MPCPS^空心菱形)。图18是在每个孔包被有200nmolNiPCPSPE的血凝度计比色杯中sTF-5AA-(His)6的凝结活性的图表。在添加血浆和钙离子来启动凝结之前,用反应孔孵育浓度增加的sTF-5AA-(His)6(实心圓圈)或单一浓度的sTF(4800nM;空心倒三角形)。在x-轴上标出的浓度是指添加到每个孔中的50(il等分量中sTF或sTF-5AA-(His)6的浓度。详细说明一般地,重组TF必须含有跨膜结构域或等效的膜锚定结构域以表达完全的促凝血活性并因而适合于在重组凝血活酶试剂中使用。然而,与sTF相比,rTF以低得多的水平表达,更加难以纯化并且更难以处理rTF。此外,rTF重构到磷脂泡嚢中是费劳力的。因此我们设法开发一种重组TF形式,其具有STF的所有期望的表达、处理和溶解度特征,但是其将在血浆凝结测试中展现与重新脂质化的rTF可比较的促凝血活性。将金属结合结构域,例如寡聚组氨酸标签连接到sTF的C-末端容许蛋白质结合含有金属螯合脂质的磷脂泡囊。由于野生型TF的细胞外结构域的C-末端部分经由短肽序列连接到跨膜结构域[18],因此将寡聚组氨酸标签连接到sTF的C-末端(任选地,具有间隔基,例如其他氨基酸残基)容许当经由与金属螯合脂质螯合的金属结合到磷脂表面时被适当地定向。与金属螯合脂质例如DOGS-NTA-Ni螯合的金属可以容易地掺入到磷脂双分子层中,容许金属结合重组蛋白质例如活化的sTF的金属结合结构域。此外,还发现的是按这种方式与泡嚢结合的活化的sTF基本上表现出类似膜锚定的rTF的性质,并且具有与rTF可比较的促凝血活性。还发现的是已经固定在固相支持物上的含有镍螯合脂质的膜双分子层可以有效地从粗混合物捕获活化的sTF,在一个筒单的步骤中同时纯化蛋白质并将它锚定在膜上。此外,将活化的sTF的高度活性制备物结合到含有金属螯合脂质的固定的磷脂双分子层上的能力可以用于制备护理时的临床凝结分析,其中凝结的活化剂附着于芯片表面。高活性的PT试剂(凝血活酶试剂)可以在存在磷脂泡嚢(例如,含有10%DOGS-NTA-Ni、5%PS、30%PE和55%PC)的情况下使用活化的sTF例如sTF(His)6或sTF-5AA-(His)6制备。除了产生有效的凝血活酶试剂之外,还发现的是即使在不存在任何组织因子的情况下,在磷脂泡嚢中具有N产或Cu"的金属螯合脂质例如DOGS-NTA-Ni也是血液凝固的接触途径的非常强的活化剂。这些磷脂泡嚢可以用作诊断和治疗试剂。它们可以充当化学上定义的aPTT试剂中的活性成分。它们也可以用于治疗患者中的出血事件。PT试剂(凝血活酶试剂)可以在存在金属螯合脂质的情况下从活化的sTF制备,所述金属螯合脂质结合了金属离子,优选过渡金属离子,例如Ni2+、Cu2+、ZnlCo2+,其中N产和C是最有效的。高度活性的aPTT试剂可以从金属螯合剂制备,所述金属螯合剂结合了金属离子,优选过渡金属离子,例如N产、Cu2+、Zn2lCo2+,其中N产是最有效的。金属螯合剂包括NTA珠子和金属螯合脂质。金属螯合脂质的实例包括l-棕榈酰基-2-[8-[(E,E)-2',4'-己二烯酰基氧基]辛酰基]-sn-甘油基-3-N-[ll-[N',N'-二[羧曱基]亚氨基]-3,6,9-三氧杂十一烷酰基]磷脂酰乙醇胺(其通过亚氨二乙酸(IDA)部分螯合例如Cu)[35]、脂质二硬脂酰亚氨基-二乙酸盐(DSIDA)(其螯合例如Cu)[36],和1,2-二油酰-sn-甘油基-3-[(N-(5-氨基-l-羧基戊基)亚氨基二乙酸)丁二酰基](铵盐)(DOGS-NTA)(其螯合例如Ni)。活化的sTF优选包括TF的细胞外结构域和具有至少2个组氨酸残基、更优选具有2-10个组氨酸残基的寡聚组氨酸部分。优选地,所述组氨酸残基是连续的。更优选的,活化的sTF包括(His)n,其中n是2-10,更优选4_6。活化的sTF的实例包括sTF(His)6、sTF-5AA-(His)6和sTF-2(His)5。PT测试试剂盒包括凝血活酶试剂。aPTT测试试剂盒包括aPTT试剂。任选地,含有Ca"的试剂、緩沖液和/或防腐剂可以被包括在任一试剂盒中。类似地,用于PT测试和aPTT测试的组合试剂盒将包括以下试剂,其可以形成aPTT试剂的凝血活酶试剂,例如N产和/或Cu"以及金属螯合脂质,其中单独封装活化的sTF。用于外在途径(PT)或内在途径(aPTT)的凝结分析的实例包括PT分析可以含有寡聚组氨酸标记的sTF以及与NTA-脂质组合的N产或Cu2+;aPTT分析可以含有与NTA-脂质组合的Ni2+。同时有力地活化外在和内在凝结途径的制剂的实例(例如,作为治疗剂)可以使用寡聚组氨酸标记的sTF与N产或Cu"以及NTA-脂质组合来制备。用于组合PT测试和aPTT测试的试剂盒的实例包括三个试剂瓶,以下列为试剂A、B和C,在每种情况下,之后是它们的内含物的列表。所述瓶子可以含有这些成分作为已经制成的溶液,或者它们可以被冻干。在后一的情况中,通过添加适当体积的水来产生标明的组分终浓度,可以复原(reconstitute)i式齐寸。试剂A(a)100iiMNi-脂质(b)任选的适合的緩冲液(例如,25mMTris-HCl緩冲液,pH7.4)(c)任选的防腐剂(例如,0.1%w/vNaN3)试剂B(d)l到100nM活化的sTF(e)任选的25mMCaCl2(f)任选的适合的緩冲液(例如,25mMTris-HCl緩冲液,pH7.4)(g)任选的稳定剂(例如,0.1%w/v牛血清白蛋白)(h)任选的防腐剂(例如,0.1%w/vNaN3)试剂C(任选的)(i)水中的25mMCaCl2(j)任选的防腐剂(例如,0.1%w/vNaN3)PT分析(半自动化的)1.将等体积的试剂A和B混合在一起来制成凝血活酶试剂。2.吸取50^柠檬酸化的血浆到血凝度计比色杯中。3.孵育120秒以确保血浆达到37°C。4.添加100ial凝血活酶试剂,混合,并测量从添加凝血活酶试剂的时间点至凝结形成的时间。可选择的PT分析(完全自动化的)。1.吸取50nl柠檬酸化的血浆到血凝度计比色杯中。2.脬育120秒以确保血浆达到37°C。3.添加50|il试剂A,随后立即添加50|il试剂B。混合。测量从添加试剂B的时间点至凝结形成的时间。这个版本的分析可以适合于自动化的血凝度计,其中在步骤3中添加试剂A和B之间的延滞应当尽可能短。aPTT分析1.吸取50|il柠檬酸化的血浆到血凝度计比色杯中。2.添加50pi试剂A。混合。3.在37。C孵育180秒。4.添加50^试剂C,混合,测量从添加试剂C的时间点至凝结形成的时间。可以形成治疗组合物,从而通过用所述组合物接触来自伤口的血液或接触伤口来停止伤口的出血。所述组合物可以含有启动内在途径、外在途径或两者所需的组分。所述组分可以与在凝血活酶试剂、aPTT试剂或两者中使用的那些相同。取决于伤口的位置,所述治疗剂组合物可以是各种形式局部用组合物、鼻部喷雾、栓剂、嗽口水、可注射组合物、绷带和伤口敷料。治疗组合物优选是无菌的,并且可以含有防腐剂。治疗组合物可以以包括单位剂型的各种形式施用,并且可以与各种的药学上可接受的载体组合。这些载体包括固体稀释剂或填充物,无菌的含水介质以及各种无毒的有机溶剂。此外,口腔组合物(包括嗽口水、灌有治疗组合物的衬垫或药签)可以适当地加甜和/或调味。绷带和伤口敷料可以含有湿润或干燥(冻干)形式的组合物。鼻部喷雾可以含有湿润或干燥粉末形式的组合物,以及其他常规的添加剂和/或载体,例如在美国专利No.6,815,424中描述的那些。嗽口水含有湿润形式的组合物,任选含有嗽口水常用的其他成分。实例包括在美国专利No.5,945,087和美国专利No.5,338,538中描述的那些。可注射形式可以包括药学上可接受的载体。可注射组合物可以被注射到任何体腔中,但一般不是静脉注射。局部用组合物可以是湿润或干燥粉末形式,并且可以包括局部可接受的载体。这种表面可接受的载体的实例可以在2000年10月26日公开的国际专利公开WO00/62742;美国专利Nos.5,691,380;5,968,528;4,139,619和4,684,635中找到。适合的局部可接受的载体以及其他药学载体也在Remington'sPharmaceuticalSciences,17thed.,MackPublishingCompany,Easton,Pa.(19卯)中描述了,这是本领域中的标准参考书。优选地,所述凝血活酶试剂含有Ca2+,或者Ca^可以仅在使用所述试剂之前添加。Ca^可以在试剂盒中与凝血活酶试剂一起提供,每个部分单独地封装,任选每种试剂是干燥的形式。Ca^优选作为CaCl2添加。Ca^的数量优选是1-100mM,更优选5-75mM,进一步优选15-50mM,包括20mM、25mM、30mM、35mM、40mM和45mM。离子强度可以通过添加盐来调节,例如碱金属和碱土金属盐,包括卣化物、硫酸盐、硝酸盐和醋酸盐,例如NaCl和KCl。优选,所述盐以0-200mM、10-150mM、15-125mM,更优选25-100mM的数量存在。优选地,所述凝血活酶试剂不含有因子II、因子X、肌动蛋白、己糖激酶和碱性磷酸酶中的一种或多种。缺乏肌动蛋白、己糖激酶和碱性磷酸酶表明所述凝血活酶试剂不含有组织提取物(虽然组织因子本身可以是从凝血活酶试剂含有重脂质化为磷脂的TF,例如磷脂酰胆碱(PC)、丝氨酸磷脂(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)。所述磷脂的至少一部分是带有净负电荷的磷脂,例如PS、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)。优选地,PS的数量是总磷脂含量的5-50%,更优选为10-40%,包括15%、20%、25%、30%和35%。PE的数量优选是总磷脂含量的0-50%,更优选为5-40%,包括10%、15%、20%、25%、30%和35%。优选地,磷脂含量的其余部分由中性的磷脂例如PC组成,例如,其占总磷脂含量的0-95%,更优选为40-90%,包括45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%和85%。凝血活酶试剂的国际灵敏度指数(ISI)值优选是0.6到2,更优选为0.8到1.5,进一步优选为0.8到1.2,最优选为0.9到1.1。做为选择,优选地,凝血活酶试剂的ISI值最多是1.5或最多是1.2。凝血活酶试剂的ISI值应当通过WHO批准的方法来确定[34]。通过冻干、喷雾干燥或其他适合的蛋白质干燥方法,可以以干燥的形式提供凝血活酶试剂。所述试剂可以在长条或其他固相支持物上干燥,可以作为试剂盒来提供,其具有单独封装而提供的组分、或封装到2个或多个包装内的组分的集合。一些或所有的组分可以以干燥形式来提供,其他组分在盐水或生理学的緩冲液中提供。本发明的凝血活酶试剂可以含有添加的FVII。向凝血活酶试剂中添加微小数量的因子VIIa可以用于最小化对因子VII的敏感性,以及进一步操纵对其他因子的响应。在2004年8月31日提交的Morrissey等人的名称为"THROMBOPLASTINREAGENTS"的美国专利申请No.10/931,282中更完整地解释了这一点。可以使用任何FVII,包括任何哺乳动物因子VII或VIIa(例如人类、兔、大鼠、牛,等等)。优选地,所述凝血活酶试剂含有添加的因子VIIa,更优选人类因子VIIa。FVII可以重组地制备[33]。优选地,存在的FVII的数量低于在正常个体的血浆中存在的因子VII或因子Vila的数量,包括在缺乏因子II和因子X的血浆中存在的因子VII或Vila的数量。存在的FVII的数量优选是0.1到10纳克/毫升(ng/ml)因子VIIa当量、1到6ng/ml因子Vila当量,或2.5到5ng/ml因子Vila当量,更优选是至少1ng/ml或至少2.5ng/ml因子Vila当量。做为选择,FVII的数量可以以皮摩尔(pM)数量来表示;例如1-1000pM因子Vila当量、50-400pM因子Vila当量,优选是至少150pM因子Vila当量或至少200pM因子Vila当量。凝血活酶试剂可以用来监测任何抗凝血药物治疗。以下的表A列出了多种这样的药物。表A:可以使用凝血活酶试剂监测的抗凝血药物<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>1:FDA批准在人类中使用2:在临床试验中评估但尚未批准3:仍在开发中(仅进行动物研究)实施例除非另有说明,以下研究使用sTF(His)6进行,并且采用由Bio-Bead法制备的suv。用于改变的凝血活酶试剂的磷脂sTF(His)6的促凝血性质首先通过测定在PT分析中产生最短凝结时间的磷脂组成来研究。系统地改变SUV中的PE、PS、PC和DOGS-NTA-Ni的比例,测试它们在支持正常混合的血浆的凝结方面的有效性。使用SUV(100nM脂质)和0.3吗/mlsTF(His)6的混合物来形成用于PT凝结分析的改变的凝血活酶试剂。当SUV含有12。/。Ni-脂质(40。/c)PE、5%PS、12%DOGS-NTA-Ni和43%PC)时,使用这些试剂获得了最短的凝结时间(图2)。还研究了产生最短凝结时间的SUV浓度。使用PT分析和0.3昭/mlsTF(His)6,改变含有12.5%DOGS-NTA-Ni的总磷脂的浓度。随着SUV浓度提高,凝结时间变得更短,在大约100pM磷脂处到达平台期(图3)。寡聚组氨酸标记的sTF的性质在存在含有10%DOGS-NTA-Ni、5%PS、30%PE和55%PC的磷脂泡嚢(称为10。/。Ni-脂质)时,将sTF(His)6和sTF-5AA-(His)6的凝结活性与存在PCPS泡嚢和重脂质化到PCPS泡嚢中的rTF的情况下sTF的活性相比较。制备含有TF和磷脂的凝血活酶试剂,并稀释至TF的各种浓度。稀释的凝血活酶试剂然后用于PT分析(图4)。四种改变的凝血活酶试剂如下制备1.重脂质化到PCPS泡嚢(30pM)中的100ng/mlrTF,2.1000ng/mlsTF(His)6加10%Ni-脂质(IOOjiM),3.1000ng/mlsTF-5AA-(His)6加10%Ni-脂质(IOO|iM),和4.10,000ng/mlsTF加PCPS泡嚢(IOOpM)。凝血活酶试剂在TA(pH7.5的50mMTris-HCl緩冲液、0.1。/。牛血清白蛋白、0.1%NaN3)中稀释来改变TF的浓度。产生50秒凝结时间的TF浓度被用于比较不同的凝血活酶制备物的活性(表1)。sTF(His)6和sTF-5AA-(His)6的促凝血活性显著地高于sTF。sTF-5AA-(His)6是更具活性的变体,具有rTF的活性的IO倍之内的促凝血活性。将sTF(His)6变构地活化Vila的能力与sTF和rTF/PCPS相比较。sTF(His)6也能够完全地变构活化VIIa(数据未显示)。表1:在PT分析中多种形式的重组组织因子的凝结活性<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>**凝结数据来自图1研究sTF-(His)6与Vila结合得有多么牢固。膜锚定的rTF和sTF在它们对VIIa的结合亲和性方面显著不同。VIIa极其紧密地结合已经重脂质化到PCPS泡嚢中的rTF,iQ值低于50pM[4]。另一方面,Vila明显更弱地结合sTF,IQ值是大约2到5nM[4]。对于Vila与rTF/PCPS的结合,在存在PCPS泡嚢的情况下与sTF的结合,以及在存在Ni-脂质的情况下与sTF(His)6的结合,测定KJ直(表2;对于在存在Ni-脂质的情况下Vila与sTF(His)6的结合的典型结合等温线,参见图5。)表2.Vila与多种形式的重组人类组织因子的结合的离解常数<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*具有15mol%Ni-NTA-DOGS的SUV与文献值相一致,对于Vila与rTF/PCPS结合获得的Kj直为40pM,对于Vila与sTF结合获得的IQ值为7nM。这确认了早先的报道,Vila结合rTF/PCPS的亲和性比其结合sTF的亲和性高大约100倍。有趣地,发现在存在Ni-脂质的情况下Vila以非常高的亲和性结合sTF(His)6。使用通过Bio-Bead法制备的磷脂泡嚢进行在这项研究中到此为止提及的实验。使用通过超声处理或挤出制备的泡嚢进行类似的凝结实验,得到类似的结果(数据未显示)。因而,所有三种类型的泡嚢都支持了sTF(His)6的凝结活性。与挤出或超声化的泡嚢相比,通过Bio-Bead法制备的泡嚢支持了最高的活性(最短的凝结时间)。寡聚组氨酸标记的sTF和Ni-脂质作为PT试剂主要的目标是产生可以在PT分析中作为凝血活酶试剂的可溶形式的TF。为了测试这一点,产生改变的凝血活酶试剂,含有以下的最终浓度3)ig/mlsTF(His)6和100)iM15。/。Ni-脂质。然后在PT分析中比较这种试剂和商业上可获得的凝血活酶试剂STA-NeoplastineClPlus(DiagnosticaStago)。使用混合的正常血浆以及许多缺乏因子的血浆来比较使用这两种试剂时的凝结时间(图6)。(所述缺乏因子的血浆是缺乏因子V、VII、VIII、IX、X、XI、XII、激肽释放酶原(PK)或高分子量激肽原(HK)的)。如PT分析所预料的,使用缺乏因子V、VII或X的血浆时,两种试剂都展现了延长的凝结时间,然而对于内在途径的凝结因子(因子VIII、IX、XI、XII、PK或HK)的缺乏不敏感。用于aPTT分析的磷脂发现在某些情况下Ni-脂质本身是促凝血的,甚至在缺乏sTF(His)6的情况下。进一步的研究表明,Ni-脂质是血液凝固的接触途径的强力活化剂,特别是当在添加钙离子之前在37。C与血浆预孵育2到4分钟时(参见图9)。(在以上呈现的PT测试数据中,Ni-脂质不与血浆预孵育,因而血液凝固的接触途径未被活化到任何显著的程度。)在以下的系列实验中探索了Ni-脂质活化接触途径的能力。在第一个实验中,通过改变PS、PE、PC和DOGS-NTA-Ni的含量,在aPTT分析中考察了Ni-脂质促凝血活性的磷脂依赖性(图7)。使用由15%D0GS-NTA-Ni、5%PS、40%PE和40%PC组成的SUV(称为15%Ni-脂质)获得了最短的凝结时间。然后,使用15。/。Ni-脂质在aPTT分析中考察了磷脂浓度对凝结时间的影响(图8)。在100|iM或高于100的磷脂浓度处获得了最短的凝结时间。Ni-脂质与血浆的预孵育时间(添加钙离子之前)对于aPTT分析的性能是重要的(图9)。在缺乏预孵育时,凝结时间是非常长的(>100秒)。Ni-脂质与血浆的最佳预孵育持续时间是2到4分钟,此后凝结时间变得更长。这种特性是aPTT试剂的典型特性,与商业上可获得的aPTT分析是可比较的。为了确定Ni-脂质的促凝血活性是由于接触途径的活化而导致的,使用正常的和缺乏因子VIII的血浆重复基于Ni-脂质的aPTT分析(图10)。使用提高的15。/。Ni-脂质浓度,正常血浆的凝结时间显著地缩短,而在测试的所有泡嚢浓度下在这些分析中缺乏因子VIII的血浆的凝结时间显著地延长。这表明,Ni-脂质的促凝血活性取决于血液凝固的内在途径。Ni-脂质作为aPTT试剂使用正常混合的血浆和缺乏各种单个的凝结因子的血浆在aPTT分析中测试Ni-脂质的促凝血活性,与商业上可获得的aPTT试剂相比较(图11)。对于Ni-脂质试剂,使用含有15%DOGS-NTA-Ni、5%PS、40%PE和40%PC的50iiM磷脂泡嚢。商业上可获得的aPTT试剂是STA-PTT-Automate5(DiagnosticaStago)。选择50Ni-脂质浓度,因为它产生了正常的混合血浆的基线aPTT凝结,这类似于市售aPTT试剂与正常的混合血浆的凝结时间。通过在37。C孵育50(ilaPTT试剂与50|il血浆3分钟,然后通过添加50^预暖的25mMCaCl2启动凝结,来进行aPTT分析(图11)。如所预料的,两种试剂的凝结时间对于因子VII的缺乏不敏感,因子VII对于血液凝固的外在途径而言是特异性的。还如预料的是,当血浆缺乏任何以下凝结因子时,使用这两种试剂的凝结时间延长因子V、VIII、IX、X、XI、XII、激肽释放酶原或高分子量激肽原。这证实了Ni-脂质通过血液凝固的接触途径活化凝结级联。这些结果还表明,基于Ni-脂质的aPTT试剂具有与商业上可获得的aPTT试剂的性质高度可比较的性质。Ni-脂质作为接触活化剂的金属离子特异性在这个系列实验中,测试了当与NTA-DOGS结合时其他多种过渡金属支持新的PT和aPTT分析的能力。通过制备含有以下mol。/。脂质15%NTA-DOGS、50/0PS、40%PE、40%PC的混合的磷脂泡嚢(使用Bio-Bead法)来进行这些实验。这些混合的磷脂泡嚢(在此称为NTA-脂质)然后用于aPTT和PT分析中。改变的凝血活酶试剂含有变化浓度的指定金属盐、NTA-脂质(IOO|iM脂质)、30ng/mlsTF-5AA-(His)6、0.004。/。(w/v)牛血清白蛋白、0.08%(w/v)叠氮化钠和pH7.4的16mMHepes緩冲液。改变的aPTT试剂含有变化浓度的指定金属盐、NTA-脂质(IOOpM脂质)、0.08。/。(w/v)叠氮化钠和pH7.4的16mMHepes缓冲液。使用含有30ng/mlsTF-5AA-(His)6和变化浓度的NiS04、CoCl2、CuS04、ZnCl2、FeS04、CdCl2、CrCl2、AgN03或MnCl2的改变的凝血活酶试剂在存在NTA-脂质的情况下进行PT分析(图12)。(对于这组实验选择低浓度的sTF-5AA-(His)6(30ng/ml),从而在金属离子浓度变化时可以获得易于观察的凝结时间范围。在更典型的PT分析中,应当使用更高浓度的sTF-5AA-(His)6,产生的正常的混合血浆的凝结时间在10到15秒的范围内。)当包括在改变的凝血活酶试剂中时,在这项PT分析中,某些测试的金属离子(Fe2+、Cd2+、Cr2+、Ag+和Mn2+)在从0到90nM的浓度范围展现了延长的凝结时间(>200秒)(数据未显示)。Zi^+显示了一些活性(参见图12)。相比之下,当添加到改变的凝血活酶试剂中时,Ni2+、Cu"和Co"都以浓度依赖性的方式显著地缩短了凝结时间(图12)。使用10CuS04或NiS04获得了最短的凝结时间(<30秒),表明Cu"和N产在这个分析系统中具有可比较的活性。然而,在低于10nM的金属离子浓度下,相比012+,N产支持了更短的凝结时间(图12B)。当添加到改变的凝血活酶试剂中时,0)2+在所测试的其他金属是唯一能够将PT凝结时间缩短到低于IOO秒的金属。然而,所测试的Co"浓度都不支持如使用Cu"或N产的最佳浓度所观察到的那么短的凝结时间。使用含有变化浓度的NiS04、CoCl2、CuS04、ZnCl2、FeS04、CdCl2、CrCl2、AgN03或MnCl2的改变的aPTT试剂在存在NTA-脂质的情况下进行aPTT分析(图12C)。当以0到90的浓度范围添加到改变的aPTT试剂中时,几种测试的金属离子(Fe2+、Cd2+、Cr2+、Ag+和Mn2+)都展现了延长的凝结时间(>200秒)(数据未显示)。Co"和Zn"显示了一些活性(参见图12C)。相比之下,在存在NTA-脂质的情况下,N产和Cu"都以浓度依赖性方式显著缩短了凝结时间(图12C)。与Cu"相比,在这个分析中N产实质上表现得更好。当以10到25jaM的浓度掺入到改变的aPTT试剂中时,N产展现了最大的活性(最短的凝结时间)。与其他固定的支持物结合的N产通过活化血液凝固的接触途径展现了促凝血;舌'l"生。通过寸吏用NiSepharose6FastFlowJ朱子(AmershamBiosciences)测试了这一点,其含有螯合到共价附着于交联的琼脂糖珠子上的NTA部分的N产离子(Ni-NTA珠子)。使用96-孔平板读数器测试Ni-NTA珠子的促凝血活性,因为琼脂糖珠子干扰ST4血凝度计中的球承载检测系统。作为比较物,在这个相同的测试系统中测试了15。/。Ni-脂质的能力。含有15。/。Ni-脂质的样品几乎立即凝结(太快而不能通过微平板读数器测量),表明它们作为接触途径活化剂的优势(数据未显示)。不存在活化剂时血浆的凝结时间是311秒(表3)。Ni-NTA珠子将血浆的凝结时间缩短到126秒,虽然显著缩短了,但是它比使用15。/。Ni-脂质时所观察到的凝结时间实质上更长。这表明Ni-NTA珠子具有可测量的促凝血活性,但这也表明它们不如Ni-脂质。作为对照物来确定琼脂糖珠子本身不是促凝血性的,通过暴露于EDTA来对等分量的珠子剥离掉结合的镍离子(随后通过大量洗涤来除去EDTA)。这些剥离的NTA珠子展现了可忽略的促凝血活性。表3.在存在活化凝结的多种形式的Ni-NTA的情况下混合的正常血浆的凝结时间<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>Ni-NTA珠子可以用于耗尽血浆的接触因子由于Ni-脂质活化接触途径,接触途径中的至少一种因子必须是Ni2+-结合蛋白。进行初步研究来确定正常的混合血浆是否可以通过吸附于Ni-NTA珠子上来耗尽接触途径中的因子。在环境温度下将血浆与Ni-NTA珠子孵育30分钟,然后通过过滤从血浆中除去珠子(耗尽的血浆)。使用改变的PT分析(用rTF/PCPS作为凝血活酶试剂)和aPTT分析(使用DiagnosticaStagoaPTT试剂)测量了耗尽的血浆的凝结时间。将耗尽的血浆的凝结时间与使用正常的混合血浆(未用Ni-NTA珠子处理)的凝结时间相比较(表4)。在PT分析中,耗尽的血浆的凝结时间比正常血浆短。在aPTT分析中,耗尽血浆的凝结时间实质上长于正常的混合血浆。这个结果表明,通过吸附到Ni-珠子上,血浆中的关键的接触因子可以被耗尽。表4.使用PT和aPTT分析比较耗尽的血浆和混合的正常血浆的凝结时间PT(秒)aPTT(秒)混合的正常血浆16.2±0.235.2±1.5耗尽的血浆16.2士0.283.7±17.6其他的寡聚组氨酸标记的sTF变体还使用了两种新的寡聚组氨酸标记的sTF变体sTF-2(His)5和sTF-5AA-(His)6(氨基酸序列参见图l)进行了研究。使用由变化数量的DOGS-NTA-Ni组成的50SUV(5%PS、30%PE,且余量由PC组成),用所有三种形式的寡聚组氨酸标记的sTF(0.15吗/ml)进行了PT分析(图13)。这些研究显示,sTF-2(His)s构建体相对于sTF(His)6具有降低的促凝血活性,而sTF-5AA-(His)6构建体相对于sTF(His)6具有提高的促凝血活性。使用早期用于测量sTF(His)6的&值的相同条件,也测量了每种变体对Vila的结合亲和性(对于结合等温线参见图14,KJ直参见表5)。这些研究表明,sTF-2(His)5构建体比sTF(His)6构建体更微弱地结合因子VIIa。相比之下,sTF-5AA-(His)6构建体比sTF(His)6构建体明显更紧密地结合因子VIIa。这些结果表明sTF-5AA-(His)6构建体优于sTF(His)6构建体。表5.Vila与组氨酸标记的sTF变体的结合的离解常数TFA(pM)sTF(His)6169sTF-2(His)5440sTF-5AA-(His)631当Vila与TF结合时,它的X活化速率显著地提高了,因此这可以用于方便地显示TF:VIIa复合物的形成。使用这种方法,发现VIIa以极其高的亲和性与sTF-5AA-(His)6加NiPCPS(含有15%DOGS-NTA-Ni、65%PC、20%PS的磷脂泡嚢)的组合相结合,&为10.8pM(表6)。这基本上相等于它对PCPS脂质体中重组膜结合组织因子(membTF)的亲和性(ig=10.0pM)。因而,当分离的TF外结构域经由与金属螯合脂质的相互作用附着于膜表面时,它的VIIa结合能力与跨越脂质双分子层的membTF是不可区分的。TF:VIIa功能的严格测试是关于它支持它的天然蛋白质底物X的活化的能力。这需要将TF掺入到合适的磷脂膜(即,含有带负电的磷脂的膜)中。另一方面,即使在存在PCPS脂质体的情况下,分离的TF外结构域支持了比membTF低几个数量级的X活化速率,因为sTF没有锚定在膜中[4,9]。在相同浓度的酶(500pMVIIa)、辅助因子(4pMTF)和脂质体(50总脂质)的情况下,比较了各种形式的TF支持X的活化的能力。sTF-5AA-(His)6和NiPCPS的组合支持了Vila的X活化速率,所述X活化速率与4吏用PCPS脂质体中的membTF所获得的X活化速率是可比较的。两种形式的TF:VIIa复合物的kcat值是相似的,而结合到sTF-5AA-(His)6加NiPCPS的VIIa对X的Km实际上低于PCPS中的membTF,产生了稍微高的总体催化效率(kcat/Km)。结合于sTF-5AA-(His)6的Vila的高酶活性取决于镍螯合脂质和sTF上的寡聚组氨酸标签,因为混合sTF-5AA-(His)6与PCPS脂质体或者混合sTF与NiPCPS脂质体支持了可忽略的Vila活化X的速率。TF的其他功能是促进反应中VII的自动活化,这取决于TF的表面密度[25,50]。相比之下,sTF不能支持这个反应[ll]。在相同的TF表面密度的条件下,PCPS中的membTF和sTF-5AA-(His)6加NiPCPS都以可比较的速率常数支持了VII自动活化(表6)。结合在一起,这些发现显示,TF外结构域共价附着于膜锚定物来实现TF活性的野生型水平不是必需的;sTF经由金属螯合脂质对膜表面的可逆性附着与常规的膜锚定在功能上是等效的。表6:TF:VIIa复合物的结合和动力学常数<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>sTF-5AA-(His)6aNiPCPS脂质体10.&±4.238±3.83.3±0.4387.1±12.32.9(土0.37)x107STF-5AA-(His)6b固定的10%DOGS-NTA-风20%PS,70%PCn.dc66±6.44.1±1.463,1±22.3n.dc纯化的蛋白质。b从粗的培养物上清液捕获的。e没有测定。如上所述的实验使用了纯化的sTF-5AA-(His)6。据推理,含有DOGS-NTA-Ni的固定的脂质双分子层应当能够从粗的混合物捕获sTF-5AA-(His)6,在一个快速的步骤中同时分离和膜锚定这种蛋白质。虽然在我们的co//表达系统中sTF-5AA-(His)6的表达是靶向周质间隙的,但是显著的数量在过夜培养物的培养基中积累一般是通过ELISA测量的55(ig/ml(2.0|iM)sTF-5AA-(His)6。因而,粗培养物上清液用缓冲液稀释十倍,并在聚苯乙烯96孔平板的反应孔中孵育,所述反应孔预先用含有DOGS-NTA-Ni、PS和PC的脂质混合物包被。在洗去未结合的蛋白质之后,反应孔用VIIa处理,并且测量X活化速率。由于在缺乏TF和合适的磷脂膜的情况下Vila是X的不良活化剂,这种分析是对固定的脂质捕获sTF-5AA-(His)6的能力、以及产生的TF:VIIa:膜复合物的功能状态的严格的测试。发现的是,当按这种方式从培养物上清液捕获sTF-5AA-(His)6时,sTF-5AA-(His)6有力地支持了VIIa对X的活化,其表观Km和U直与PCPS脂质体中的membTF的Km和k^值是可比较的(表6)。在这些分析条件之下,支持X活化的半最大速率所需的纯化的sTF-5AA-(His)6的浓度(EC5Q)是6.2士4.1nM(图16),比我们的E.coli培养物上清液中的sTF-5AA-(His)6浓度低两个数量级以上。sTF上的寡聚組氨酸标签和镍螯合脂质的存在都是所需的,因为sTF-5AA-(His)6与固定的PCPS的组合或者sTF与固定的镍螯合脂质混合物的组合都不产生可检测水平的X活化,甚至在sTF浓度高达1nM时(图16)。DOGS-NTA-Ni和磷脂的混合物在聚苯乙烯血凝度计比色杯的反应孔中干燥下来,洗涤比色杯来除去任何未固定的脂质,然后向反应孔添加sTF-5AA-(His)6。随后通过向反应孔添加钙离子和血浆来进行凝结测试。发现的是,在每个孔已经容纳了200到800nmolNiPCPSPE(包含10%DOGS-NTA隱Ni、47.5%PC、12.5%PS、30%PE的磷脂泡嚢)的比色杯中使用20nMsTF-5AA-(His)6可实现低于25秒的凝结时间(图17)。使用其他脂质组合物来进行对照实验,将它们都以每个反应孔单一数量的脂质(200nmol)干燥在比色杯反应孔上。当脂质缺乏DOGS-NTA-Ni(PCPS或PCPSPE;图17)时观察到明显更长的凝结时间。含有DOGS-NTA-Ni但是缺少PE的脂质混合物具有适度延长的凝结时间(NiPCPS"图17)。这个实验表明,固定的NiPCPSPE和sTF-5AA-(His)6的组合起到了强力的凝血活酶试剂的作用。这些实验还表明,DOGS-NTA-Ni是sTF-5AA-(His)6有效地用作促凝血试剂所需的,以及PE增强了sTF-5AA-(His)6的促凝血活性但不是绝对必需的。研究了凝结时间对sTF-5AA-(His)6浓度的依赖性。使用每孔200nmol的干燥NiPCPSPE,我们发现,使用从4.8到4800nM的sTF-5AA-(His)6浓度范围获得了低于20秒的凝结时间(图18)。使用48nMsTF-5AA-(His)6在这个实验中获得了最短的凝结时间(16.3秒)。相比之下,没有寡聚组氨酸标签的sTF展现了长得多的凝结时间,即使在非常高的浓度使用时(4800nM;图18)。这表明,sTF-5AA-(His)6的寡聚组氨酸标签是它在存在固定的NiPCPSPE的情况下用作有效的凝血活酶试剂所需的。才才津牛禾p方法——混合的正常人类血浆和缺乏各个因子的血浆(缺乏因子V、VII、VIII、IX、X、XI、XII或激肽释放酶原)购自GeorgeKingBio-Medical。缺乏激肽原(HK)的血浆购自AffinityBiologicals。鸡蛋磷脂酰胆碱(PC)、猪脑丝氨酸磷脂(PS)、牛肝脏磷脂酰乙醇胺(PE)和DOGS-NTA-Ni购自AvantiPolarLipids,Inc.。所提供的脂质溶于氯仿中,在氮气中在-20°C保存直到需要时。Chromozymt-PA(N-曱磺酰-0-1^-017-八巧-4-苯基重氮酸乙酸盐(1^^11化(16acetate))购自RocheAppliedScience。S-2222购自DiaPharma。Bio-BeadsSM-2吸附剂购自BioRadLaboratories,八乙二醇单十二烷基醚((:12£8)购自Fluka。重组人类Vila购自AmericanDiagnostica,血浆书亍生的因子X来自EnzymeResearchLaboratories。商业的PT试剂(STA-NeoplastineCIPlus)和aPTT试剂(STA-PTT-Automate5)购自DiagnosticaStago。NiSepharose6FastFlow珠子购自AmershamBiosciences,如先前描述的,重组人类rTF和sTF在E.coli细胞中表达并纯化[6,21]。牛血清白蛋白(BSA)来自Calbiochem(LaJolla,CA)。ST4血凝度计比色杯和STart4血凝度计来自DiagnosticaStago(Parsippany,NJ)。SpectrozymeXa底物(曱氧羰基-D-环己基甘氨酰-Gly-Arg-4-硝基苯胺乙酸盐(nitroanilideacetate))和重组人类Vila来自AmericanDiagnostica,Inc.(Stamford,CT)。纯化的血浆衍生的VII、X和因子Xa(Xa)来自EnzymeResearchLaboratories(SouthBend,IN)。防沫剂C来自Sigma(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。,果逸我^标记》"7F的斜务——通过突变含有sTF的序列的载体来产生三种不同形式的寡聚组氨酸标记的sTF。用于在£.co//中产生变体的表达载体是质粒pET26b(+)(Novagen)的变化形式。所有三种形式编码以下的氨基酸序列(从N-末端到C-末端列出)1.细菌前导肽(pelB),用于将重组蛋白质靶向Eco"的周质间隙。在蛋白质的合成期间通过E.coli细胞除去pe旧前导肽。2.短肽表位(AEDQVDPRLIDGKS),位于在成熟的重组sTF的N-末端,用于使用固定的HPC4抗体的亲和纯化。许多实验已经显示,这个存在于sTF的N-末端的短肽对于它的功能是没有影响的问。3.人类TF的细胞外结构域,由成熟的人类TF序列的氨基酸1-217或1-219组成(根据MorrisseyWa/.来编号[22])。所述三种变体的sTF的C-末端的序列是不同的(图1)。sTF(His)6用六个组氨酸残基替换了sTF的最后两个氨基酸。sTF-2(His)5类似于sTF(His)6,不同之处是sTF-2(His)5含有五个组氨酸残基、八个氨基酸长度的间隔基和另外五个组氨酸残基。sTF-5AA-(His)6保留了sTF的最后两个氨基酸,然后含有5个氨基酸长度的间隔基,随后是六个组氨酸残基。所有三种变体都在Eco/ZBL21(DE3)细胞中表达,并使用HPC4免疫亲和柱来纯化,如先前对sTF所描述的[6],有以下的微小改变。如先前在Rezaie,W中描述的通过离心获得细菌团粒。>使用细胞洗涤緩冲液(10mMTris-HCl,pH7.5,30mMNaCl,0.5mMEDTA,pH8.0)洗涤团粒,如先前描述的离心,洗涤并离心第二次。再次将洗涤的团粒悬浮在原生质球緩冲液(100mMTris-HCl,pH8.0,0.5mMEDTA,pH8.0,1mMMgCl2,500mM蔗糖)加0.2mMPMSF中。通过离心收集团粒并在环境温度孵育10分钟。再次将团粒悬浮在冷的H20中,并在水上孵育5分钟。将MgCl2以1mM的最终浓度添加到悬浮液中,再次离心悬浮液。如先前描述的收集上清液并层析[6]。遂#辨务--h的单层磷脂泡嚢(SUV)通过三种不同的方法制备。在所有三种方法中,在干燥氮气流中干燥总共2.6mmol的期望的脂质混合物,随后在高真空下额外干燥1小时以除去任何痕量的氯仿。除非另作说明,采用Bio-Bead法来制备磷脂泡嚢[17]。在这种情况下,再次将干燥的脂质混合物悬浮在1mlHBS(20mMHEPES-NaOH缓冲液pH7.4,100mMNaCl,0.1。/。NaN3)加6mMC12E8f,在室温下保持40分钟。然后通过在室温下孵育溶液与400mgBio-Beads1.5小时来除去CI2E8[17]。制备泡嚢的另外两种方法是超声处理和挤出。对于这两种方法中的任一种,再次将干燥的脂质混合物悬浮在1mlHBS中,得到2.6mM的最终脂质浓度。然后在缸式超声波仪(bathsonicator)中超声处理混浊的脂质悬浮液直到它们在视觉上变得澄清从而产生SUV,或者使用AvestinLiposoFast泡嚢挤出机重复地通过100nm聚碳酸酯过滤器挤出。在所有情况下,脂质混合物由变化数量的PS、DOGS-NTA-Ni、PE和产生等于2.6mmol总脂质含量的足量PC组成。由20mol%PS和80mol%PC组成的SUV称为PCPS。除非另作说明,含有5%PS、40%PE和变化数量的DOGS-NTA-Ni和PC的SUV被称为Ni-脂质,并通过它们的DOGS-NTA-Ni含量来指明。因而,15。/。Ni-脂质是指含有5%PS、40%PE、15%DOGS-NTA-Ni和40%PC的SUV。凝j&活凝试浙——为了制备常规的凝血活酶试剂,如所描述的,以磷脂比rTF为8700:1的摩尔比将rTF重脂质化到由20mol%PS、80mol%PC组成的磷脂泡囊中(rTF/PCPS)[17,23]。然后将rTF/PCPS制备物在TBSA(50mMTris-HCl緩冲液,pH7.5,100mMNaCl,0.1%牛血清白蛋白,0.1%NaN3)中稀释到期望的最终rTF浓度。为了制备改变的凝血活酶试剂,将SUV与sTF或寡聚组氨酸标记的sTF变体之一在TA(50mMTris-HCl缓冲液,pH7.5,0.1%牛血清白蛋白,0.1%NaN3)中稀释到期望的浓度。P71凝潜为Vf——通过将50jil25mMCaCl2和50|il稀释的凝血活酶试剂移液到血凝度计比色杯中并容许混合物加热到37。C保持2分钟,在ST4型血凝度计(DiagnosticaStago)中进行PT分析。然后通过将50pl预热的、混合的正常血浆移液到比色杯中来启动凝结,并记录形成凝块的时间。a尸7T凝结分浙——aPTT凝结分析也在ST4型血凝度计(DiagnosticaStago)中进行。通过将50plaPTT试剂和50pl混合的正常血浆移液到血凝度计比色杯中并将混合物在37。C孵育3分钟来进行aPTT分析。然后将50pi预热的25mMCaCb移液到比色杯中,记录形成凝块的时间。的f——通过生色分析测量因子Vila的酶活性来确定TF变构活化因子Vila的能力。在HBSAC(HBS加0.1%牛血清白蛋白和5mMCalC12)中制备含有Vila和各种浓度的TF(或sTF)的反应混合物。通过在平底96孔平板中添加生色底物Chromozymt-PA(ChtPA)来启动反应。所有形式的TF的典型反应条件都是15nMVIIa、0-50nMTF(rTF在PCPS泡嚢中重脂质化;将sTF变体以50磷脂的最终浓度与磷脂泡嚢混合),和HBSAC中的lmMChtPA,最终体积为100pl。在VERSAmax微平板读数器(MolecularDevices)中在环境温度监视八4()5的变化,每30秒读取读数,持续20分钟。潜合7F的&的Wi/J1——使用X活化速率的TF依赖性提高作为TF:VIIa复合物形成的指示来测量VIIa对各种形式的TF的结合亲和性。通过采用Fiore"a/.的连续生色分析来测量X被TF:VIIa复合物的活化[9]。在HBSAC中制备含有Vila与rTF/PCPS或sTF+SUV的反应混合物。通过向平底96孔平板中添加X和生色底物S-2222的混合物来启动反应。在VERSAmax微平板读数器(MolecularDevices)中在环境温度监视A4D5的变化,每15秒进行采样,持续20分钟。如所描述的通过对八4()5数据拟合二阶多项式来确定X活化的起始速率[9,24]。如所描述的[24]对速率数据拟合配体结合二次方程式来得到VIIa与TF结合的表观KJ直。对于使用重脂质化的rTF的实验,在HBSAC中含有0.25pMVila和20nMX的典型的反应混合物与浓度增加的rTF/PCPS孵育。对于使用sTF的实验,改变反应混合物以含有400pMVIIa、100PCPS泡嚢、20nMX和变动的sTF浓度。对于使用寡聚组氨酸标记形式的sTF的实验,改变反应混合物以含有10pMVIIa、Ni-脂质(50总脂质)、20nMX和变化浓度的寡聚组氨酸标记的sTF变体。^"f^^炎器哞对凝块形4的^f——在这个实验中,将补充有50PCPS泡嚢的混合的正常血浆与各种数量的Ni-NTA珠子(NiSepharose6FastFlow)在TA中混合,并在37。C孵育3分钟。将这种混合物的80(il等分量添加到平底96孔平板中的20pl预热的(37。C)53mMCaCl2中。在VERSAmax微板读数器中在37。C温度监视A4。5的变化持续20分钟,每30秒进行测量。达到半最大吸光度的时间被用作凝结时间。炎^7庙l资沐的^fI活/A。使用如下修改的不连续生色分析[4]在多孔平板中在环境温度下测量X活化的起始速率HBSAC中的反应混合物含有500pMVIIa、变动的X以及PCPS中的4pMmembTF(加50pMPCPS)或4pMsTF-5AA-(His)6加50|iMNiPCPS。在变动的时间,在4。C将20pl等分量转移到含有100pl停止緩冲液I(40mMMes-NaOHpH5.8,12mMEDTA,50mMNaCl,0.25%TritonX-100,0.1%NaN3,0.0120/0防沫剂C)的96孔平板中。在将停止的反应加热到室温之后,通过添加HBSAC中的60nl1.5mMSpectrozymeXa加0.6MTricine隱NaOHpH8.4并定量A405的变化来检测Xa。通过与使用纯化的Xa得到的标准曲线比较来确定产生的Xa数量。炎^^定的y^资的^子义活化。在环境温度进行所有步骤。在硼硅酸盐玻璃试管中在柔和的干燥氮气流下干燥脂质混合物来除去溶剂(氯仿),然后以2mM的总脂质浓度溶解在正己烷中。96孔聚苯乙烯平板(Costar卯18高结合力平板,Corning,Inc.,Coming,NY)的每个反应孔容纳60nmol总脂质,容许己烷在通风橱中蒸发。然后用100|ilTBSA(50mMTris-HClpH7.5,100mM,0.02%NaN3,1%牛血清白蛋白)孵育反应孔1小时,吸出并用TBS(没有白蛋白的TBSA)洗涤三次。用HBSA(没有4丐的HBSAC)中100[al指定浓度的sTF或sTF-5AA-(His)6孵育反应孔1小时,吸出并用TBS洗涤三次。用HBSAC中的100^5pM因子Vila將育反应孔1hr,之后通过添加100^1mMSpectrozymeXa底物和指定的X浓度HBSAC来启动反应。确定A柳的变化,通过与标准曲线比较来确定产生的Xa数量。西子打/《动活化。基本上如所描述的测量VII自动活化的速率[25]。等摩尔浓度的VII和TF(各15nM)在37。C在HBSAC中孵育。在各个时间点,将20(il等分量转移到含有60^停止緩冲液II(O.lMTricine-NaOH,pH8.4,6.7mMCaCl2,0.1%牛血清白蛋白,0.1%TritonX-IOO,0.05%NaN3和100nMsTF)的96孔平板。添加20等分量的5mMChromozymt-PA底物,在环境温度监视A4Q5的变化。如所描述的确定二维二级速率常数(k2D)[25]。7F凝潜为、浙。在LowSaltTBSA(含有10mMNaCl而不是100mMNaCl的TBSA))中,使用PCPS、NiPCPS或NiPCPSPE脂质体中的membTF来制备用于凝结分析的凝血活酶试剂,向所述LowSaltTBSA中额外添加合适的脂质体来达到100的总脂质浓度。含有sTF或sTF-5AA-(His)6的凝血活酶试剂类似地在LowSaltTBSA力a100PCPS、NiPCPS或NiPCPSPE脂质体中制备。在STart4血凝度计(DiagnosticaStago,Parsippany,NJ)中进行凝结分析。简要地,各自50(il等分量的25mMCaCl2和凝血活酶试剂在37。C在血凝度计比色杯中一同孵育120秒。然后添加50^等分量的预热的集中的正常人类血浆,测量凝块形成的时间。通过修改凝结分析来最后添加血浆,接触途径的活化被最小化,凝结时间取决于TF活性。TF活性的单位被定义为在最终的150)il凝结反应中产生50秒凝结时间的TF的数量。炎^^定的庙^资的凝潜为Vi——首先在硼硅酸盐玻璃试管中在柔和的干燥氮气流下干燥氯仿中的脂质混合物来除去溶剂,之后将干燥的脂质以0.3到5.3mM的总脂质浓度重新溶解在正己烷中。完全的脂质混合物被称为NiPCPSPE,由10%DOGS-NTA-Ni、12.5%PS、30%PE和47.5%PC组成。还制备缺乏这些组分中的每一种组分的脂质混合物用于对照实验,其组成如下含有12.5%PS、30%PE和57.5°/。PC的PCPSPE;含有10%DOGS-NTA-Ni、12.5%PS和77.5%PC的NiPCPS*;以及含有12.5%PS和87.5%PC的PCPS。ST4比色杯的每个孔容纳150W存在于己烷中的脂质溶液(每个孔含有50到800nmol总脂质)。然后容许己烷在通风橱中在室温下完全地蒸发。接下来,用TBS(50mMTris-HClpH7.5,100mMNaCl和0.02%NaNO洗涤反应孔三次。然后每个反应孔容纳50|il存在于TA(50mMTris-HClpH7.5,0.1%BSA,0.1%NaN0中的指定浓度的sTF或sTF-5AA-(His)6的溶液,之后用石蜡封口膜覆盖反应孔,在室温下孵育1小时。然后从比色杯上移除石蜡封口膜,将它们转移到已经预热到37。C的STart4血凝度计上。每个反应孔添加50^等分量的25mMCaCl2,将比色杯在37。C孵育2分钟,之后添加50pl等分量的预热的(37。C)混合的正常人类血浆,测量凝块形成的时间。参考文献1MorrisseyJH.TissuefactorandfactorVIIinitiationofcoagulation.In:ColmanRW,HirshJ,MarderVJ,ClowesAW,GeorgeJN,editors.HemostasisandThrombosis:BasicPrinciplesandClinicalPractice.Philadelphia:LippincottWilliams&Wilkins,2001:89-101.2CamererE,PrydzH.Notesonthecellbiologyoftissuefactor,//aewoytos^1996;26:25-30.3PaborskyLR,CarasIW,FisherKL,GormanCM.Lipidassociation,butnotthetransmembranedomain,isrequiredfortissuefactoractivity.Substitutionofthetransmembranedomainwithaphosphatidylinositolanchor.J"CTzem1991;266:21911-21916.4NeuenschwanderPF,MorrisseyJH.Rolesofthemembrane-interactiveregionsoffactorVilaandtissuefactor.ThefactorVilaGladomainisdispensableforbindingtotissuefactorbutimportantforactivationoffactorX.J飾/C/zem1994;269:8007-8013.5WaxmanE,RossJBA,LaueTM,GuhaA,ThiruvikramanSV,LinTC,KonigsbergWH,NemersonY.Tissuefactoranditsextracellularsolubledomain:TherelationshipbetweenintermolecularassociationwithfactorVilaandenzymaticactivityofthecomplex,j5/oc/z柳^^y1992;31:3998-4003.6RezaieAR,EsmonCT,MorrisseyJH.ExpressionandPurificationofRecombinantSolubleTissueFactor.UnitedStatespatent5,298,599.Theentirecontentsofthispatentareherebyincorporatedbyreference.7ShigematsuY,MiyataT,HigashiS,MikiT,SadlerJE,IwanagaS.ExpressionofhumansolubletissuefactorinyeastandenzymaticpropertiesofitscomplexwithfactorVila.J編CTzem1992',267:21329-21337.8WaxmanE,LawsWR,LaueTM,NemersonY,RossJBA.HumanfactorVilaanditscomplexwithsolubletissuefactor:Evaluationofasymmetryandconformationaldynamicsbyultracentrifugationandfluorescenceanisotropydecaymethods.肠c/z醒'勿1993;32:3005-3012.9FioreMM,NeuenschwanderPF,MorrisseyJH.ThebiochemicalbasisfortheapparentdefectofsolublemutanttissuefactorinenhancingtheproteolyticactivitiesoffactorVila.CTzem1994;269:143-149.10RufW,RehemtullaA,MorrisseyJH,EdgingtonTS.Phospholipid-independentand-dependentinteractionsrequiredfortissuefactorreceptorandcofactorfunction.C7zew1991;266:2158-2166.11NeuenschwanderPF,MorrisseyJH.DeletionofthemembraneanchoringregionoftissuefactorabolishesautoactivationoffactorVIIbutnotcofactorfunction.Analysisofamutantwithaselectivedeficiencyinactivity.J編C/z纖1992;267:14477-14482.12NemersonY,RepkeD.TissuefactoracceleratestheactivationofcoagulationfactorVII:Theroleofabifunctionalcoagulationcofactor.T7zr函61985;40:351-358.13MorrisseyJH,MacikBG,NeuenschwanderPF,CompPC.QuantitationofactivatedfactorVIIlevelsinplasmausingatissuefactormutantselectivelydeficientinpromotingfactorVIIactivation.1993;81:734-744.14HirshJ,FusterV,AnsellJ,HalperinJLAmericanHeartAssociation/AmericanCollegeofCardiologyFoundationguidetowarfarintherapy.Ocw/加ow2003;107:1692-1711.15BaderR,MannucciPMM,TripodiA,HirshJ,KellerF,SollederEM,HawkinsP,PengM,PelzerH,TeijidorLM,RamirezIF,KoldeH-J.MulticentricevaluationofanewPTreagentbasedonrecombinanthumantissuefactorandsyntheticphospholipids,77zr画6//aemos^1994;71:292-299.16TripodiA,ArbiniA,ChantarangkulV,MannucciPM.Recombinanttissuefactorassubstituteforconventionalthromboplastinintheprothrombintimetest.77zram6//ae歸W1992;67:42-45.17SmithSA,MorrisseyJH.Rapidandefficientincorporationoftissuefactorintoliposomes./7T^謹6/foe歸5t2004;2:1155-1162.18BannerDW,D'ArcyA,Ch6neC,WinklerFK,GuhaA,KonigsbergWH,NemersonY,KirchhoferD.ThecrystalstructureofthecomplexofbloodcoagulationfactorVilawithsolubletissuefactor.1996;380:41-46.19TerpeK.Overviewoftagproteinfusions:frommolecularandbiochemicalfundamentalstocommercialsystems.5/otec/Mo/2003;60:523-533.20DarstSA.Anewtwistonproteincrystallization./VocAto/爿cad<SW1998;95:7848-7849.21NeuenschwanderPF,Bianco-FisherE,RezaieAR,MorrisseyJH.PhosphatidylethanolamineaugmentsfactorVila-tissuefactoractivity:Enhancementofsensitivitytophosphatidylserine.B/oc/ze脂's^y1995;34:13988-13993.22MorrisseyJH,FakhraiH,EdgingtonTS.MolecularcloningofthecDNAfortissuefactor,thecellularreceptorfortheinitiationofthecoagulationproteasecascade.0〃1987;50:129-135.23SmithSA,MorrisseyJH.Propertiesofrecombinanthuman//a謹W2004;2:1610-1616.24FioreMM,NeuenschwanderPF,MorrisseyJH.Anunusualantibodythatblockstissuefactor/factorVilafunctionbyinhibitingcleavageonlyofmacromolecularsubstrates.1992;80:3127-3134.25NeuenschwanderPF,FioreMM,MorrisseyJH.FactorVIIautoactivationproceedsviainteractionofdistinctprotease-cofactorandzymogen-cofactorcomplexes.Implicationsofatwo-dimensionalenzymekineticmechanism.C7zem1993;268:21489-21492.26LauerSA,NolanJP.DevelopmentandcharacterizationofNi-NTA-bearingmicrospheres.Cytome^y2002;48:136-145.27CornellBA,KrishnaG,OsmanPD,PaceRD,WieczorekL.Tethered-bilayerlipidmembranesasasupportformembrane-activepeptides.SocTram2001',29:613-617.28GemmellCH,TurittoVT,NemersonY.FlowasaregulatoroftheactivationoffactorXbytissuefactor.飾w/1988;72:1404-1406.29GemmellCH,NemersonY,TurittoV.Theeffectsofshearrateontheenzymaticactivityofthetissuefactor-factorVilacomplex.M/cravosc1990;40:327-340.30MorrisseyJH.Tissuefactor:anenzymecofactorandatruereceptor.77z謂Z7/7aewa^2001;86:66-74.31MassignonD,MoulsmaM,BondonP,DebizeG,AbidiH,ButtinT,BonC,PilloncheryG,CoeurP.Prothrombintimesensitivityandspecificitytomildclottingfactordeficienciesoftheextrinsicpathway:evaluationofeightcommercialthromboplastins,r/2rom61996;75:590-594.32KitchenS,JenningsI,WoodsTA,WalkerID,PrestonFE.Tworecombinanttissuefactorreagentscomparedtoconventionalthromboplastinsfordeterminationofinternationalnormalisedratio:athirty-three-laboratorycollaborativestudy.TheSteeringCommitteeoftheUKNationalExternalQualityAssessmentSchemeforBloodCoagulation.77z;x>w61996;76:372-376.33Kemball-CookG,GarnerI,ImanakaY,NishimuraT,O'BrienDP,TuddenhamEG,McVeyJH.High-levelproductionofhumanbloodcoagulationfactorsVIIandXIusinganewmammalianexpressionvector.Ge亂1994Feb25;/M0:275-9.34VanDenBesselaar,A.M.,Tripodi,A.,Poller,L.WHOguidelinesforthromboplastinsandplasmausedtocontroloralanticoagulationtherapy.Annex3.^^W//ea/AOg朋Tec/zWe/Ser1999;889:64-93.35Jeong,S.W.,O'Brien,D.F.J(>gC/em.2001Jul13;66(14):4799-802.36M.S.Kent,H.Yim,D.Y.Sasaki,J.Majewski,G.S.Smith,K.Shin,S.Satija,andB.M.Ocko丄awg画,r2002;18(9)pp3754_3757.37Nilsson,J.,Persson,B.,andvonHeijne,G.(2005)Comparativeanalysisofaminoaciddistributionsinintegralmembraneproteinsfrom107genomes,7V她/似60,606-616.38Wallin,E,,andvonHeijne,G.(1998)Genome-wideanalysisofintegralmembraneproteinsfromeubacterial,archaean,andeukaryoticorganisms,7,1029-1038.39Jones,D.T.(1998)Dotransmembraneproteinsuperfoldsexist,Fi^S281-285.40Seddon,A.M.,Curnow,P.,andBooth,P.J.(2004)Membraneproteins,lipidsanddetergents:notjustasoapopera,历0c/2/w.—.爿"a7<5(5<5,105-117.41Morrissey,J.H.(2001)in/Tewoy^whaw<iT7zrom6os7'5v5as7'c/V/w一/es<3"<iC〃m.ca/尸raWce(Colman,R.,Hirsh,J.,Marder,V.,Clowes,A.,andGeorge,J.,Eds.)pp89-101,LippincottWilliamsandWilkins.42Morrissey,J.H.,Neuenschwander,P.F.,Huang,Q.,McCallum,C.D.,Su,B.,andJohnson,A.E.(1997)FactorVila-tissuefactor:functionalimportanceofprotein-membraneinteractions,r/7r函6.Z/aewoW.7S,112-116.43Rezaie,A.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