生物表面结构阵列的制作方法

专利名称：生物表面结构阵列的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴定和分析生物相容材料和结构，特别是那些影响细胞 功能的材料和结构，所述细胞功能比如直接细胞生长、扩增、分化、去 分化、矿化、细胞内或细胞间结构化等。
背景技术：
用于高通量筛选的生理相关的细胞培养模型构成了许多人类疾病 治疗改进的一个主要瓶颈。 一些生理和病理-生理状态可用三维细胞或 组织培养物再现，但它们在高通量环境中定量读取方面并非最理想的。
许多针对特化细胞类型的二维培养系统依赖于与饲养层细胞的共培养， 其主要缺陷是不方便和不可再现性。因此，对于许多生物技术分析，特 别是对于细胞置换以及候选药物的筛选和验证来说，非常希望在基底上 固定、分离、扩增、分化和培养活细胞。表面可附着细胞的微芯片有助 于同时高通量筛选很多候选药物。候选药物调节给定疾病状态中所涉及 的生化或生理途径的能力可用其上选择性固定或附着细胞的微芯片进 行检测。
美国专利申请US2004/0053334A1描述了一种基底，其包括含有加 热器的第一层和以两种状态存在的第二温度响应层，由此当温度低于其 "较寸氐温度溶液状态(lower temperature solution state, LCTS )，，时其表 现出非细胞结合状态，而在被加热至超过其LCTS时其表现出细胞结合 状态。
外科治疗经常需要引入植入物，例如假体和可植入装置，其中克服 机体自身排斥机制和支持组织再生的需要是难以完成的挑战。因此植入
的临床成功可依赖于植入物和宿主组织之间界面邻近区域的细胞行为。
此领域进展的一个关键要素在于鉴定和使用用于加工这些装置的生物
相容材料。
Chesmel and Black (1995) J Biomedical Materials Res. 29:1089-1099,描述了一种体外检测系统，用于检测细胞对聚苯乙烯组织培养表 面的化学和形态变化的反应。该系统提供9个在由浇铸于微加工硅晶片 上的聚苯乙烯(具有不同的苯乙烯单体含量)形成的模型生物材料表面， 该表面具有不同深度的(无；0.5-，或0.5卞M)放射状表面沟槽。Turner 等(1997 ) (/ , T^/i/io/ B15:2848-2854 )描述了玟理化(textured ) 硅表面对来自中枢神经系统的星形细胞附着的影响，其中应用了具有由 交替排列成行的硅草(silicon grass )和湿独刻表面组成的两种表面故理 的硅基底。
在对改进的生物相容材料和结构的持续探寻中，仍然需要一种高通 量筛选工具用于鉴定对特定类型的细胞或组织最优的结构和表面。

发明内容
为满足上述的和其他的需求，本发明提供了一种包括生物表面结构 阵列(biosurface structure array, BSSA )的筛选工具，该阵列包含一定 数目的测试区域，由此每个区域具有表面拓朴纳米和/或微米尺度特征。
本发明基于如下认识，细胞功能如直接细胞生长、扩增、分化、去分 化、矿化、细胞内或细胞间结构化等都强烈地受细胞的微环境所影响。不 受理论的限制，特定细胞类型在体内和体外的增殖和分化被认为可能依赖 于提*适的可附着细胞的结构，如与自然界中可见结构不相似的完全人 造的结构，或具有才莫拟期望类型细胞或组织自然环境的表面特性的结构。 本发明尤其是认识到在细胞的微环境中，表面的二维和三维结构或拓朴是 决定细胞生长和分化的关键因素。不同细胞类型的体内增殖和分化的不同 微环境有极大的数量，因此确定促进任何特定细胞类型生长的特定微环境 是困难的和耗时的。
所以需要一种高通量筛选工具用于测试细胞培养的不同微环境，特 别是测试具有不同表面拓朴的结构。制造合适的结构如模拟自然中所见 表面构造的人造结构，需要能够定义微米尺度或纳米尺度之特征的技 术。本发明利用在纳米技术中开发的工具，其允许设计和建造具有小至 约5nm的侧向特征尺寸的表面构造的结构。特别是这些技术的应用允 许制造不同表面拓朴的巨大阵列，其中每种拓朴被精确地定义，由此任 何选定的拓朴都可精确地在以后的相关应用中再现。
本发明提供包括位于单个结构如晶片(wafer )上多个测试区域的生 物表面结构阵列。为了使晶片单位面积上测试区域的数目最大化，并由
此增加其作为筛选工具的效率，使每个测试区域的尺寸最小化将会比较 理想。基于如下认识，即体内的个体细胞在微米和纳米结构水平看待其 周围组织构造，本发明的实施方案提供一种应用于筛选目的的二维平台 上对这种微米和纳米结构的再现。鉴定非常适于获得确定类型细胞之二 维层的表面结构或者最终地最好支持药物摄入所述细胞的结构，将基于 在具有表面结构阵列(或梯度)的晶片上的高通量筛选。
根据一个方面，测试区域所需最小尺寸的一个关键决定因素是为实 现统计学显著的篩选检验所需的细胞数目，以及每个测试区域可容纳的
细胞数目。已经证明，在以下条件下达到统计学显著的筛选结果每个 测试区域的面积至少为0.0625 mm2，其中一个线性维度至少为250 nm， 相当于5个直径50樣i米的细胞，由此避免在测试区域边界的边缘效应 具有统计学显著的影响。具体来说，接近或位于测试区域周缘的细胞的
附着受这些细胞对该测试区域和邻近测试区域各自拓朴结构的亲和力 差异的影响。因此，细胞对任一邻近区域的附着受细胞从一个测试区域 到另 一个测试区域迁移的影响。通过适当地选择每个测试区域尺寸的低 限，可以防止这种边缘效应对筛选结果产生统计学显著的影响。细胞截 面尺寸与测试区域表面积的比优选应不小于1/25，以便允许测试区域容 纳5x5个细胞的阵列，即有3x3个细胞位于内部而沿周缘有一行细胞。
根据另 一个方面，用于筛选细胞的生物表面结构阵列包含多个测试 区域，其中每个测试区域具有暴露于所述细胞的表面，其中所述表面具 有预定的周期性拓朴结构。当该拓朴结构沿一个或多个侧向例如一个或 多个平行于该测试区域各边缘的方向为周期性时，该结构在整个测试区 域内具有高度的均勻性，由此增加筛选结果的再现性。此外，周期性结 构可由少量参数加以定义/分类，由此可进行系统性比较和高度重现性。 在一些实施方案中，测试区域沿一个所述侧向的截面可用一个周期函数 来描述。
BSSA化学组成的描述
生物表面结构阵列的实施方案包括基底层例如晶片形式，以及任选 地表面层。
当基底层为硅例如硅晶片形式时，可以利用现有的产生图案化表面 结构的制造技术。其他适合于制备所述生物表面结构阵列的基础材料包 括任何半导体(掺杂的或未掺杂的)、单种金属、合金、陶瓷、聚合物、
共聚物、复合材料、药物递送系统例如具有生物活性分子的聚合物、其 他生物活性化合物或它们的任何组合。
在本发明的实施方案中，表面层包含支持来自待培养细胞的适当反 应的材料。更具体而言，所述材料需要合适程度的生物相容性。
表面层的实例包括金属表面沉积物，例如钽、钛、Ti-Al-V合金、 金、铬、金属氧化物、半导体氧化物、金属氮化物、半导体氮化物、聚 合物、生物聚合物、或其它合金。
在一些实施方案中，生物表面结构阵列包括另外的成分，如一种或 多种沉积于所述阵列的表面层上的生物活性化合物，例如包含多肽的聚 合物，吸附的生物活性聚合物或化合物等。例如，所述聚合物可以选自 抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、 RNA、多糖、脂质、有机化合物、 无机化合物。
BSSA的结构性质
晶片的表面被分为多个测试区域，即晶片全部表面区域的多个亚区 域(sub-areas )。每个测试区域的表面包括在测试区域表面平面内沿一 维或两维的规则的纳米或微米尺度结构。具有一维纳米或微米尺度特征 的结构的实例包括在纵向上延伸跨测试区域全长并且在侧向具有纳米 或微米尺度维度的特征。二维结构的实例包括这样的结构，其包括在测 试区域所限定平面内两个方向上具有纳米或微米尺度维度的特征。
所述拓朴结构是规则的，即该结构包括按照预定的有序的、非随机 图案安排的特征，由此确保筛选结果的重现性。另外一个优点是微米和 /或纳米尺度的规则的拓朴结构可通过已知生产技术重复性制造，这些 已知才支术比如光刻(photolithography )、 电子束光刻(e-beam lithography )、 热压印(hot embossing )、 纳米压印光刻(nano imprint lithography )、孩吏接触印刷(microcontact printing),聚焦粒子束蚀刻 (focussed ion beam etching)等。可涉及制造所述生物表面阵列的其他 制备步骤的实例包括化学蚀刻、激光烧蚀(laser ablation )、等离子喷 涂、磨料喷射(abrasive blasting )、雕刻(engraving )、刻划(scratching )、 微加工(micro machining )等。
当拓朴结构为沿着一个或多个侧向(例如一个或多个平行于该测试 区域各边缘的方向)的周期性结构时，该结构在整个测试区域内具有高度的均匀性，由此增加筛选结果的再现性。此外，周期性结构可由少量 的参数加以定义/分类，由此可进行系统性比较。在一些实施方案中， 测试区域沿一个所述侧向的截面可用周期性函数描述。
本文中的术语"纳米尺度"意指在约1纳米至约1000纳米范围内的 长度尺度，特别是在约1纳米至约100纳米范围内的长度尺度。本文中 的术语"微米尺度"意指在约l微米至约1000微米范围内的长度尺度。
在本发明的实施方案中，拓朴特征在至少一个侧向的侧向尺度是在
1-105纳米区间内，例如l-2纳米、2-4纳米、4-10纳米、10-100纳米、 100-1000纳米、1-2微米、2-4微米、4-10微米、10-100微米。
在一些实施方案中，特征的尺度在不同测试区域之间有变化，即一 些测试区域具有纳米尺度(即1-1000纳米之间)的特征，而另一些测 试区域具有微米尺度(即1-1000孩￡米之间)的特征。类似地，每个测
试区域可包含不同尺度的特征，例如在一个方向上具有小周期而在另一
方向上具有较大周期(例如大IO、 100或1000倍)的结构。在一些实
施方案中，结构甚至可以在同一方向上具有不同尺度的特征，例如小尺 度特征叠加于大尺度特征上。例如，具有本文所述的规则的纳米或微米 尺度结构的测试区域的晶片可以随后加工从而将不规则/随机的结构置
于一些或全部测试区域的表面上，例如，如Turner等(1997)(同上) 描述的所谓的硅草(silicon grass )结构。
所述特征的深度/高度，即它们在突出测试区域表面之外方向上的线 性尺度可以相似地是纳米或微米尺度，即该结构的高度/深度可以在1 纳米至1000微米范围内。在一些实施方案中，该结构的高度/深度大于 0.6微米，优选地在1.2微米至1000.0微米之间，以及更优选地至少1.2 微米、2.0孩吏米、5.0樣吏米、IO微米、20孩i米、50^t米、IOO孩吏米或1000 微米。
在一些实施方案中，所述结构还可包含沿着突出于表面之外方向上 的图案。例如，突出的表面可以通过化学或其他工艺(例如化学蚀刻工 艺)加以结构化。
在一些实施方案中，所述周期性结构的周期小于所述测试区域的线 性尺度，例如所述测试区域的线性尺度是所述结构周期的整数倍。
在本发明的一些实施方案中，所述表面结构包括具有预定的侧向尺
度和高度/深度的个体特征，如突出、柱子、隆起、沟槽(channel)、凹 陷、孔洞等。作为替代，所述拓朴结构的特征可以定义为所述周期性结 构的周期。因此，周期性结构的特征的侧向尺度可以定义为该周期性形 状/函数的周期，即该结构重复其形状的最短区间的长度。
每个所述特征的侧向截面可以具有适当定义之边界和/或几何形状 的任何形状，如正方形、矩形、六角形、多边形、圆形、环形等，或其 组合。所述特征的顶部和/或侧部表面可以基本上是平的、弯曲的和/或 结构化的，例如通过化学或其他工艺进行修饰。不同的特征可以具有相 同或不同的形状。
在本发明的一些实施方案中，所述结构的最小侧向/竖向尺度小于或
至少相当于暴露于该表面的生物体/细胞的线性尺度，使得该生物体将 经历与其自身尺寸相比较小或至少相当的结构。
测试区域位于其上的晶片可以具有任何适当的尺寸，如2、 4、 6、 8、 12、 14或16英寸晶片，或更小或更大的晶片，由此提供不同尺寸的生 物表面结构阵列并允许平行篩选小的和大的多种不同结构。
测试区域可以具有任"f可几何形状，例如圆形或多边形，如六边形。 然而，矩形的测试区域，特别是正方形的测试区域是方^t的并可有效利 用晶片面积。正方形的测试区域还提供相对于测试区域面积较小的边 界，同时还有效地利用了晶片的面积。因此，提供了大的有效筛选面积， 同时限制测试区域边缘的边界效应。
测试区域可以在每个侧向上具有相同或不同的尺寸。在本发明的一 些实施方案中，测试区域在每个方向上的尺寸是至少0.25mm，优选地 至少0.3mm,更优选地至少0.5mm，最优选地至少lmm,例如在0.25mm 至25mm区间内，优选地在0.3mm至20mm之间，更优选地在0.5mm 至10mm之间，最优选地在lmm至5mm之间，例如所述测试区域可 以是正方形，尺寸为约2mmx2mm、 5mmx5mm 、 10xlOmm 、 或 0.25x0.25mm等。
在一个实施方案中，每个测试区域的尺寸在约2mmx2mm至约 10mmxlOmm之间，在一个标准4英寸晶片上提供约60至约1500个测 试区域。使用每个测试区域可潜在地容纳约1600个细胞的2mmx2mm 测试区域，其一个优点是在筛选具有约50nmx50jim尺寸的细胞时可以 有较高的统计显著性。
当表面面积至少是0.09 mmZ并且其中每个线性尺寸至少是300nm 时，至少约16个50nmx50nm尺寸的细胞可以容纳在测试区域的内部 并被沿着测试区域边缘的至少一排细胞环绕。因此，测试区域的大小足 够为16个细胞提供统一的、没有边界效应的微环境。当表面面积至少 为0.1225 mn^并且其中每个线性尺寸至少为350 nm时，至少约9个 50fimx50nm尺寸的细胞可以容纳在测试区域的内部并被沿着测试区域 边缘的至少两排细胞环绕，由此进一步地减少了边缘效应的影响。或者， 当表面面积至少为0.1225 mm2并且其中每个线性尺寸至少为350nm 时，至少约25个50nmx50nm尺寸的细胞可以容纳在测试区域的内部 并被沿着测试区域边缘的至少一排细胞环绕，由此进一步地增加了可用 于分析的细胞的数量。
本发明的实施方案可通过不同方式实现，包括上述和随后描述的生 物表面结构阵列、筛选生物相容表面结构的方法、进一步的产品手段、 及其一种或多种用途，每种方式都提供结合第一个所提及方面而描述的 利益和优点中的一种或多种，并且具有与结合第一个所提及方面而描述 和/或公开于从属权利要求的实施方案相对应的一个或多个具体实施方 案。
具体来说，本发明还涉及包括本文所述生物表面结构阵列的试剂 盒。这样的试剂盒可应用于以下一种或多种用途细胞附着测定、细胞 分化测定、细胞铺展测定、细胞增殖测定。
适于细胞筛选的包含BSSA的试剂盒
适用于筛选晶片上表面结构的一种或多种细胞效应的包含BSSA的 试剂盒可以包括 一个或多个BSSA晶片，以及任选地可以包括标准细 胞培养基、无菌培养容器或其他标准培养用品、标准细胞、和/或荧光 染料标记的细胞等。优选地，通过选择在一个或多个BSSA上测试区域 的大小使得每个测试区域可容纳至少25个、优选地至少50个、更优选 地至少100个、最优选地至少1000个50nm尺寸的细胞或包含在试剂 盒中的细胞。
例如，这样的试剂盒适合于测量两种细胞类型的附着比率。因此， 在这个实例中，该试剂盒可包括或可用于筛选^J口荧光蛋白EYFP和 ECFP标记的细胞。所述荧光蛋白可在所述细胞中用标准的基因转移技 术表达。另外，为便于监测两种不同细胞类型的细胞数，所述荧光蛋白 可定位于核。
分析BSSA的设备
BSSA晶片筛选的结果可用包括通过显微镜进行光学检查在内的多 种方法来分析。当显微镜位于能控制湿度、co2、温度和/或其他参数的 培养箱中时，可提供一个受控环境以在BSSA上进行细胞培养。 一个适 于自动或至少半自动获取筛选结果的设备的实施方案包括位于培养箱 中的显微镜、接受BSSA晶片的支持物、图像记录设备、和用于控制所 述晶片相对于光轴位置的控制单元。所述控制单元还适于控制显微镜以 获取每个测试区域的一个或多个图像。该控制单元还包括图像处理单 元，其适合于接受和记录图像并对所接受图像进行分析。例如，图像分 析可以包括检测不同荧光颜色的细胞和计算不同荧光颜色的细胞的数 量比。作为替代或除此之外，图像分析处理可包括对被给定荧光颜色细 胞所覆盖之测试区域的总面积的测量，或类似的图像分析步骤。
包含BSSA的试剂盒在筛选测试中的应用
本发明还涉及一种筛选生物相容的表面结构的方法，其包括
(a)将本文所述的生物表面结构阵列与分离的细胞或生物在适合 所述细胞或生物维持和/或生长的条件下相组合。
使用这样的BSSA技术能够在一次单独的实验中通过单一或混合的 细胞培养物筛选大量的结构。本发明描述的生物表面结构阵列可以用于 测定位于BSSA晶片上一个个测试区域中的大量筛选参数，包括矿化、 细胞上分化标记、(增加的或减少的)细胞数、报告细胞中的基因诱导、 生物污着(bio fouling )、特定细胞类型的附着和扩增等。
因此在一些实施方案中，所述方法还包括比较所述细胞或生物附着 至所述生物表面结构阵列之任一测试区域的频率，由此确定所述不同测 试细胞的细胞对各自表面结构的附着的差异。在另一实施方案中，所述 方法还包括比较所述细胞或生物在所述生物表面结构阵列之任一测试 区域上的铺展。在另一实施方案中，所述方法还包括比较附着在所述生 物表面结构阵列任一测试区域的细胞或生物的分化。
在一些实施方案中，所述方法还包括(a)在适合所述细胞或生物 维持和/或生长的条件下培养。
本发明描述的生物表面结构阵列可以用于检测/测试培养大量细胞 或生物的不同微环境，所述细胞或生物包括细胞如动物细胞、植物细胞、 哺乳动物细胞、酵母细胞、真核或者原核细胞或生物等。
当测试区域的每个线性尺度大到足够容纳一行至少5个细胞，优选 地至少10个细胞，更优选地至少20个细胞时，该测试区域就大到足以 在内部区域中容纳足够大量的细胞，即与测试区域边缘分开，以提供充 分统计相关的筛选参数结果。
本发明还涉及一种具有表面的生物相容材料，其中至少一部分所述 表面的特征在于包含纳米或微米尺度特征的拓朴，该表面通过以上和随
后描述的方法得到/可得到。
本发明还涉及一种包含本文所述生物表面结构阵列的晶片，以及这 样的晶片在体外细胞生物测试中的用途。本发明还涉及包含这样晶片用 于体外细胞生物测试的试剂盒。


以下本发明将更充分地结合实施方案和附图加以说明，其中
图l显示生物表面结构阵列晶片的实例的顶视图。
图2显示图1中晶片沿线A-B的截面图。
图3显示生物表面结构阵列晶片的另一个实例的顶视图。
图4显示包含交替的宽X (微米)的槽和宽Y (微米)的脊的拓朴 结构的顶视图(图4a)和截面图(图4b)。
图5显示包含方形孔和预定节距(pitch distance )的拓朴结构的顶 视图(图5a)和截面图(图5b)。
图6显示包含由宽X(微米)的脊分隔开的尺寸为X(微米)xY(微 米)的矩形孔的拓朴结构的顶视图(图6a)和截面图(图6b, c)。
图7显示包含预定尺寸和预定节距的柱的拓朴结构的顶视图(图7a ) 和截面图(图7b)。
图8显示包含交替的正方形孔和柱的拓朴结构的顶视图。
图9显示容纳25个细胞的测试区域。
图10显示容纳49个细胞的测试区域。
图ll显示具有圓柱的拓朴结构的实例的顶视图。
图12显示用全细胞标记法标记的细胞的实例。
图13显示用核定位焚光蛋白标记的细胞的实例。
图14显示用于记录筛选生物相容表面结构之结果的设备的示意框图。
图15举例说明基因诱导测试的实例。
图16显示在BSSA晶片之参考表面上培养的胚胎成纤维细胞。
图17显示在具有"D2/4"表面结构的测试区域上培养的胚胎成纤维 细胞。
图18显示在具有"D2/4"表面结构的测试区域上培养的胚胎成纤维 细胞。
图19显示在具有"D2/10"表面结构的测试区域上培养的胚胎成纤维 细胞。
图20显示在BSSA晶片之参考表面上和在玻璃上培养的MC3T3细胞。
图21显示在具有"D2/4，，表面结构的测试区域上培养的MC3T3细胞。
图22显示在具有"D2/10，，表面结构的测试区域上培养的MC3T3细胞。
具体实施例方式
图l显示生物表面结构阵列晶片的实例的顶视图。
所述BSSA晶片100包含60个测试区域。 一定数目的测试区域2 留作"空白"，即它们没有被加工成具有结构化的表面。因此，测试区域 2的表面基本上是平的。因此，在每个使用所述BSSA筛选工具的平行
筛选测试中都固有地包括对照试验。余下的标注为Sl、 S2......S54的测
试区域包含如上所述分别结构化的表面。这些测试区域是尺寸为10mmxl0mm的正方形。
图2显示图1中晶片的截面图。图2a显示该晶片沿A-B线的整个 宽度上的截面图。图2b显示其中一个测试区域之表面一部分的放大图。 晶片l具有层状结构，其包括图案化的基底层21例如硅层，以及表面 层23。晶片表面被图案化，例如通过光刻工艺来图案化，以在各测试区 域Sl、 S2, ...， S54的表面上分别提供不同的图案。该结构的深度/高 度为H。在光刻过程中，高度H可通过蚀刻过程来控制。图案化的表 面覆盖有二氧化硅薄层22,和/或不同生物相容材料的表面层23，所述 生物相容材料例如钽或任何其他金属、金属氧化物、金属氮化物、金属 碳化物、金刚石、金刚石样碳、半导体、半导体氧化物/氮化物、绝缘 体、聚合物、共聚物。测试区域之间有没有结构的"空白"边界区域，即 边界区域没有加工为具有结构化的表面。在此情况下，空白边界区域的 厚度为0.3mm。然而，该厚度可以大于或小于0.3mm。在一些实施方 案中没有边界区域，即结构之间可以相互直接接触。空白边界线可以帮 助视觉调整和识别所述结构。
应当注意的是，图2是示意图而未按比例绘制。具体来说，为了改 善可读性，竖向尺度可能被夸大。
制造BSSA的方法
技术领域：
本发明描述的生物表面结构阵列可通过多种生产技术来制造。 BSSA制造工艺的实例包括一种或多种以下本领域已知的技术
光刻方法光刻是一种已知的方法，其中几何形状/图案从光掩膜转移 至待结构化的表面，如晶片的表面。具有最小侧向特征尺寸在约1微米 至100纳米以下范围的光刻i殳备是已知的。例如下文中描述了光刻工 艺S.M.Sze: Semiconductor Devices, Physics and Technology, 2nd Edition, John Wiley & Sons 2002, Chapter 12: Lithography and Etching; 和 Plummer, Deal, Griffin: Silicon VLSI Technology, Fundamentals, Practice, and Modeling, Prentice Hall 2000, Chapter 5: Lithography 。
电子束光刻原则上，电子束光刻可以按光刻中^f吏用光的完全相同的方 式进行光刻胶的膝光。电子束光刻具有高达约5纳米的特别高的分辨 率。
(master stamp )在聚合物基底上压印微米或 纳米尺度的结构。该方法允许使用广泛的聚合物材料，利用原模生产许 多完全图案化的基底。热压印技术提供了一种低成本、高多样性的制造 方法，可很好地适用于从研发应用到大恥漠生产中所用BSSA的制造。 极高度均匀的高深宽比可以在大尺寸晶片(如8英寸或12英寸晶片) 上的微米和纳米尺度结构中实现。尺寸在20纳米以下的特征是可能的。 原模可以通过如电子束光刻等4支术制造。
其他涉及生物表面阵列生产的生产步骤或工艺的实例包括纳米压印光 刻、激光烧蚀、化学蚀刻、等离子喷涂、磨料喷射、雕刻、刻划、或微 加工等。
此外，BSSA的制造还可以包括修饰工艺，用于修饰测试区域的表 面结构，由此可筛选更大范围的微环境。这种技术的实例包括但不限于 直接可适用于三维的拓朴修饰，比如各种喷射处理技术(blasting techniques )，如喷砂处理(sandblasting )、孩i喷射处理(microblasting ) 和喷玻璃珠处理(glassblasting )。这种修饰方法另外的实例包括化学修 饰，例如通过如蛋白质吸附、肽吸附、化学沉积、化学蚀刻、和/或电 化学沉积，在晶片的一个或多个方向上产生一种或多种梯度的方法。例 如，化学梯度可通过逐渐地把晶片浸没在合适的溶液中产生。因此，在 单个晶片上可以筛选很多不同的结构，并且如果具有同样结构的测试区 域沿化学梯度重复，则在变化的化学条件下筛选每种结构。从而有助于 高度平行地筛选不同的微环境。
实施例1
包含60个测试区域的4英寸BSSA晶片的制造和测试——筛选与骨细胞 相容的微结构
A. BSSA晶片的制造
厚度为525士25微米的单面抛光的硅晶片(4英寸)为生物相容材料 的制造提供了基层。该晶片是一种电阻率为1-20欧姆厘米的n-型晶片。 根据以下方案，通过标准的光刻技术和在SF6/02中放电的活性离子蚀 刻，将微米尺寸的图案印在硅晶片的抛光面上。
1、所述晶片用緩沖的氢氟酸(BHF: BHF是一种溶液，其中浓HF( 49% )、 水、和緩冲盐NH4F的比例约为1:6:4 )预蚀刻30秒，然后在N2气流
下干燥，以及
2、 然后在该晶片上旋涂一层1.5微米厚的光刻胶AZ5214, Hoechst Cdanese Corporation, NJ, US (其化学组成可参见由Hoechst Cdanese Corporation提供的材料安全数据表(MSDS))，并在约卯。C下预烘 焙120秒，以及
3、 涂覆有光刻胶的晶片在AL6-2型EVC光刻机中通过合适的掩膜用紫 外光(UV)膝光5秒，显影50-60秒，然后在120°C下后烘焙1分钟， 以及
4、 然后涂覆有光刻胶的晶片用BHF短暂地蚀刻约30秒而被图案化，接 着在约0.30微米/分钟的速率下接受活性离子蚀刻处理(RIE)，用丙 酮剥离光刻胶，随后RCA清洗。该RCA清洗过程有三个依次应用的 主要步骤用5:1:1的H20:H202:NH4OH溶液(SCI)去除不溶性有 机污染物；用稀释的50:1的H20:HF溶液去除二氧化硅薄层，在该薄 层中可能积累了作为(I)之结果的金属污染物；以及用6:1:1的 H20:H202:HC1溶液(SC2 )去除离子或重金属原子污染物。
5、 图案化的晶片然后通过干法氧化具有20纳米Si02层而钝化，其在 1000°C下热生长15分4中。
6、 通过'减射沉积在图案化晶片上沉积250纳米的钽层。
图3显示如上制备的一个晶片的顶视图。晶片1包括60个尺寸为 10mmxl0mm的测试区域，其中每个区域具有根据实施例1制备的特定 侧向拓朴。每个晶片包括4个具有平坦表面的对照测试区域2，以及14 种不同侧向拓朴中每一种的4个复本。根据这些定义的参数制备了一系 列晶片，其中侧向拓朴的深度分别限定为0.07微米、0.25微米、0.60 微米、1.20微米、1.60微米。
每种特定的侧向结构重复4次。图3中，每个测试区域都被标记以 指示其拓朴表面结构，其中所述标记指示如下结构
"BL，，无结构，即基本上平坦的表面。
"AX/Y":图4所示的线结构。该结构包括宽度为X (微米)的槽41 和宽度为Y (微米)的脊42。因此，图4的线结构具有仅一维的微米 尺度特征。在实施例1中，区域A2/2包括具有宽度2微米的槽和宽度
2微米的脊的线结构，区域A4/4包括具有宽度4微米的槽和宽度4微 米的脊的线结构，区域A10/10包括具有宽度10微米的槽和宽度10微 米的脊的线结构，区域A4/2包括具有宽度4微米的槽和宽度2微米的 脊的线结构，以及区域A10/2包括具有宽度10微米的槽和宽度2微米 的脊的线结构。
"BX/Y":图5所示的方形孔结构。该结构包括尺寸为X (微米)xx
(微米)的方形孔/凹陷51,且节距为X+Y,即脊52的网的宽度为Y。 因此，图5的结构在测试区域的表面平面中的两个维度上都具有微米 尺度特征。在实施例1中，区域B4/4包括尺寸为4微米x4微米和8 微米节距的方形孔，区域B10/4包括尺寸为10微米xlO微米和14微 米节距的方形孔，以及区域B15/4包括尺寸为15微米xl5微米和19 微米节距的方形孔。
"KX/Y":图6所示的包含被脊分隔开的矩形孔/凹陷的结构。该结构 包括被宽度为X (微米)的脊62分隔开的尺寸为X (微米)xY (微 米)的矩形孔61。因此，区域K10/110包括被宽度为10微米的脊分 隔开的尺寸为10微米xllO微米的矩形孔。
"DX/Y":图7所示的包含突^/柱的结构。该结构包括具有尺寸为X
(微米)xx (微米)的方形横截面和节距X+Y的突^/柱71。因此， 区域D2/4包括具有柱尺寸为2微米x2微米的方形柱结构且节距为6 微米，以及区域D2/10包括具有柱尺寸为2微米x2微米的方形柱结构 且节距为12微米。
"CX":图8所示的方形孔/柱结构。该结构外观J象棋盘，具有孔81和 突^/柱82,并且二者均是尺寸为X (微米)xx (微米)的方形形状。 因此，区域CIO包括方形的孑U柱结构，且孔和柱的尺寸均为10微米xl0 微米；区域C40包括方形的孑U柱结构，且孔和柱的尺寸均为40微米x40 微米；以及区域C90包括方形的孔/柱结构，且孔和柱的尺寸均为卯 孩吏米x卯微米。
应当理解，上述制备方法也可以用于具有其他形式和尺寸的测试区 域以及其他结构类型的晶片上。同样的生产方法可用于各种不同的晶 片，其中测试区域的布局和具体表面结构可通过晶片曝光时所用的掩膜 来确定。
B.筛选BSSA晶片以鉴定用于骨细胞(成骨细胞)附着的生物相容材料
每个晶片都置于P15皿中(NUNC, Biotech line)并先后用70%乙 醇和PBS ( 6.8g NaCl, 0.43g KH2P04， 0.978g Na2HP04*2H20溶于1 升双蒸水中， PH7.4)清洗。MC3T3-E1鼠成骨细胞系(Sudo， H et al. 1983， J Cell Biol 96(l):191-98 )的细胞以浓度20000细胞/cm2接种于所 述晶片。细胞在常规培养基(a-最小基本培养基[(i-MEM，10%胎牛血 清[FCS]， 100U/ml青霉素，和100微克/毫升链霉素(Gibco， Invitrogen 提供))中培养4天。细胞在增湿的培养箱中维持(5%<:02/95%空气气 氛，37。C)，随后在生长培养基中加入50ng/ml抗坏血酸(Wako Chemicals, DE )和10mM (5-甘油磷酸(Sigma-Aldrich, DK)。每周两 次更换培养基，培养细胞3周。
鼠成骨细胞在晶片测试区域上的生长
(a) 体外矿化培养3周后，通过用PBS清洗晶片和用70。/。乙醇在-20。C 固定晶片上的细胞l小时来测试每个培一中晶片上的矿化程度。然 后细胞用双蒸水漂洗，接着用pH调节至4.2的40mM茜素红S
(Sigma-Aldrich, DK)室温(约20画25。C )染色10分钟。晶片用H20 进行后漂洗并在PBS中孵育15分钟以减少非特异性染色。
(b) 可与钙结合的茜素红微弱地染色了所有的测试区域，但强烈地染色了 具有微结构D2/4的测试区域，这已被几个独立实验中晶片上的细胞生 长所确认。D2/4具有二维的周期性结构，具有尺寸为2微米x2微米和 6微米节距的方形柱(如图7所示)。
(c) 通过比较具有不同侧向拓朴深度的晶片上的矿化，揭示出细胞培养中 矿化过程具有显著的竖向尺寸依赖性。与其他测试区域相比，在测试
检测到。在具有竖向尺寸为1.2微米和1.6微米的测试区域显示了矿化。
揭示材料生物相容特性的方法的实例包括上述的细胞附着测试、细 胞铺展测试、细胞运动性测试、差异细胞附着测试、细胞增殖测试、基 因诱导测试等。
例如，在细胞增殖测试中，细胞可用荧光蛋白标记，并在持续长达 数天的期间内数次扫描BSSA晶片以确定细胞增殖。当晶片被置于包括 培养箱中显微镜的自动分析设备中时，扫描可以自动地由该设备执行。
图9显示容纳了 25个细胞的测试区域。所述方形测试区域91大到 足以容纳5x5=25个细胞。在分析筛选实验(例如细胞附着实验，细胞 增殖实验等)期间，在测试区域内部的细胞被分析(如计数)，而沿着 测试区域91边界的细胞在分析中不予考虑，它们仅作为使内部区域的 细胞与相邻测试区域微环境(未明确显示)绝缘。在图9中，内部区域 由虚线方形92举例表示，并且大到足以容纳3x3=9个细胞。因此，在 方形92内的细胞用于分析，而在环绕分析方形92的边界区域93内的 细胞则提供对抗边界效应的屏蔽。
图IO显示容纳了 49个细胞的测试区域。方形测试区域101大到足 以容纳7x7=49个细胞。如上所述，在分析时，在测试区域内部(由虚 线方形102所示)的细胞被分析，而在环绕分析方形102的边界区域103 内的细胞则提供对抗边界效应的屏蔽。在图IO的实施例中，9个细胞用 于分析，而沿每个边缘的两排屏蔽细胞则不予考虑。或者，中心25个 细胞可以用于分析，而每边仅一排屏蔽/绝缘细胞。
因此，可以实现统计学相关的结果，同时降低由于梯度效应造成的 错误源，所述梯度效应是由于接近测试区域边缘的细胞受到测试区域结 构和周边结构(例如相邻测试区域的结构)的双重影响。更大的测试区 域可容纳更多的细胞，由此可提供更多的细胞用于分析，例如5x5、 10x10、 20x20个细胞、40x40个细胞、或更多细胞，从而提供改善的统 计结果。此外，大测试区域允许排除2、 3、 4或更多排的细胞，由此降 低边界效应的影响。
图11显示具有圆形截面的凸起/柱的拓朴结构的两个实例的顶视 图。圆柱的直径为x,节距为y,如图lla和图lib所示。
图12和13举例说明使用焚光蛋白的差异细胞附着测试的实例。
如上所述，本文所述的BSSA可用于任意两种或多种不同细胞类型 的差异附着的筛选测试。在一个这种差异细胞测试(DCA)的实例中， 一个细胞系经遗传修饰而稳定表达增强的黄色荧光蛋白(EYFP)基因， 而其他细胞要么表达增强的青色荧光蛋白(ECFP)要么根本不表达任 何荧光蛋白。两种细胞系以不同比例接种在BSSA晶片上。在一至七天 细胞培养后，通过荧光显微分析来计算两种细胞类型在细胞培养物中的 比例。通过与参考测试区域比较，当更高百分比的相关细胞类型附着在 所述表面时，可以检测所述结构在附着、增殖等方面的优点。例如，使
用4英寸的BSSA晶片，有可能筛选大约1500个尺寸为0.2mmx0.2mm 的方形，每个方形包含不同的表面结构。这样的方形能容纳数千个细胞， 使得DCA效应的定量在统计学上高度相关。
图12是差异细胞附着测试的一个实例，其中用全细胞标志标记细 胞。图12a-c显示在图7所示的具有结构D2/4的测试区域上，细胞种植 到晶片上分别l天(图12a)、 2天(图12b)和7天(图12c)后的带 有血清的成纤维细胞(NIH)。图12d-f显示在图7所示的具有结构D2/4 的测试区域上，细胞种植到晶片上分别1天(图12d)、 2天(图12e) 和7天(图12f)后带有血清的成骨细胞(MC3T3 )。
图13显示用核定位荧光蛋白标记的细胞的一个实例。特别地，图 13a显示通过青光滤光器观察到的用核定位ECFP (青)瞬时转染的 BOSC23细胞。在另一个实例中，细胞可用稳定地表达不同荧光蛋白的 逆转录病毒载体来转导；或通过分离稳定维持在细胞内的载体(例如在 载体整合后)来产生稳定表达荧光蛋白的细胞克隆。使用黄色滤光器(图 13b)不能检测到荧光背景，显示用这些滤光器组合有可能完全地区分 增强的黄色荧光蛋白(EYFP)和ECFP。此外，可以看到，有可能对 表达核定位EYFP和ECFP的细胞进行计数。
图14显示用于记录生物相容表面结构筛选结果的设备的示意框图。 该设备包括位于培养箱1402中的显微镜1401，该培养箱具有能控制湿 度、C02、温度和/或其他培养箱内参数的培养箱控制单元1403。该"i史 备还包括用于保持BSSA晶片1405的样品保持器1404，以便晶片可用 显微镜1401检查。该系统还包括控制单元1406，用于控制显微镜以及 晶片相对于显微镜光轴的位置。例如，样品保持器可安装成可移动的以 1更其可以在控制单元1406的控制下在一个或多个方向上移动，由此允 许显微镜自动地或半自动地获取不同个体测试区域的图像。作为替代或 除此之外，显微镜1401可安装成能在一个或多个方向上相对样品保持 器1404移动。显孩史镜1401包括数码照相机1407用以记录晶片上测试 区域的图像，并且控制单元进一步改造为控制照相机和显微镜，即控制 其功能，比如调整焦距、快门速度和任意光学过滤等。为确保对每个测 试区域每张照片的正确对焦，显微镜上装配有激光对焦系统用以保证快 速可靠地、与晶片尺寸无关地对焦整个晶片。控制单元1406还包括图 像处理单元1408,其适于接收记录的图像并执行对已接收图像的分析。 例如，图像分析可包括检测不同荧光颜色的细胞和计算不同荧光颜色细胞数量的比率。作为替代或除此之外，图像分析过程可包括测量给定荧 光颜色细胞覆盖的测试区域的总面积，或类似的图像分析步骤。图像分 析程序可进一步执行对测试区域的分选，例如根据在此区域中具有预定 特性的细胞(比如表达黄色荧光蛋白的细胞)的最高百分比进行分类。
在各自测试区域上细胞的通常形态也可以用差异干涉对比(DIC)成像 来评价。
控制单元的执行可通过含有数个不同元件的硬件、利用适当配置和 编程的计算机如个人计算机、或作为它们的组合来实现。
显微镜以及控制显微镜和执行图像分析的软件改造为自动处理一 个或多个不同大小的晶片，例如具有高达至少6000个2x2mm尺寸的测 试方形的晶片。对于每个测试方形获得一至数张照片。显微镜、样品保 持器和控制单元被进一步改造为以自动方式处理不同尺寸的晶片，如4 英寸晶片、6英寸晶片、8英寸晶片和/或12英寸晶片。
图15举例说明基因诱导测试的一个实例。该基因诱导测试的实例 使用来自基因敲入小鼠(Knock-in mice)的原代细胞。对于活细胞，使 用EGFP的报告系统或其他表达荧光蛋白的报告系统都能用于构造报 告基因构建物以替代天然基因。在ES细胞中同源重组后，产生了基因 敲入小鼠，如"Dmd(mdx-beta geo): a new allele for the mouse dystrophin gene" by K. Wertz and EM. Fuchtbauer, Dev Dyn. 1998 Jun;212(2):229-41" +所述。从这些小鼠分离出相关的原代细胞。当目 标基因被诱导时，来自这种小鼠的细胞表达EGFP构建物。图15显示 作为这种骨诱导性表面篩选的实例，BSSA晶片的4个测试区域。测试 区域1501作为骨诱导表面而测试区域1502包含非骨诱导表面。可以理 解的是许多其他报告系统也可用于这种方案。 一个例子是表达Betagal 的基因敲入小鼠。已经存在超过6000个不同的使用这一表达系统的基 因敲入小鼠，i口"A large-scale, gene-driven mutagenesis approach for the functional analysis of the mouse genome" by Hansen J, Floss T， Van Sloun P, Fuchtbauer EM, Vauti F, Arnold HH, Schnutgen F， Wurst W, von Melchner H, Ruiz P, Proc Natl Acad Sci USA, 2003 Aug 19;100(17):9918-22. Epub 2003 Aug 6"中所述。
实施例2
用于细胞筛选的包含BSSA晶片的试剂盒
用于筛选产胰岛素细胞的试剂盒包含不同的BSSA晶片，并可另外 包括标准细胞培养基和无菌容器以及来自胰岛素敲入小鼠的多种原代 细胞。通过使用这样的细胞可以测定各表面促进分化的能力，例如从间 充质干细胞分化成P-细胞(产胰岛素细胞)，其可用于测定p-细胞等的 优先附着和扩增。对于人原代细胞，可以用相关基因的抗体对其固定和 染色。上述试剂盒可以与本发明所述的显微镜合用。作为替代或除此之 外，该试剂盒包括这样的显微镜和/或用于自动或半自动筛选晶片的具 有控制软件和/或分析软件的软件包。
本文所述的BSSA可用于筛选与多种疾病有关的生物相容表面。
例如，能够将细胞类型导向至形成多巴胺能神经元的任何结构都是 令人感兴趣的，因其可作为帕金森病的直接治疗以及潜在地受关注用于 多种其他的神经相关疾病如阿尔茨海默病。维持在这种分化状态的细胞 更令人感兴趣，因为它们可用于药物的筛选和初步测试目的。细胞类型 对不同表面结构的附着效率可用使用商品抗体的免疫染色技术测量，这 些商品抗体能识别细胞类型特异性蛋白质标记，如突触蛋白I(synapsin I)(神经元)、GFAP (星形细胞)和PLP (少突胶质细胞)以及具有不 同颜色荧光标签的神经胶质，并能通过双重免疫染色和荧光显微技术鉴 定不同细胞类型。不同细胞类型的存在可在不同时间区间测量，其也允 许鉴定支持神经元细胞群扩增的表面微米和/或纳米尺度结构。
使用酪氨酸羟化酶(TH )和多巴胺转运蛋白(DAT )特异性抗体可 鉴定多巴胺能神经元(DAergic neurons )。因此可测量表面结构，相对 于其他细胞类型如其他神经元类型和星形细胞，支持多巴胺能神经元存 在和分化的能力。
此外，有利于(5-细胞扩增或诱导干细胞(间充质细胞)分化成为 产胰岛素p-细胞的任何结构在糖尿病中都是令人感兴趣的。这些细胞可 用于治疗因生活方式和/或老龄化而发展为I型糖尿病的日益增长的人 群。生长在这种表面上的产胰岛素细胞可用于药物测试/验证分析。
对于能实现和/或有利于来自骨髓抽出物的细胞的分离、扩增、启 动或分化的结构，使用BSSA可鉴定其骨形成能力。生长在这种结构上 的细胞可与矫形手术结合使用。生长在这种结构上的原代细胞可在多种 药物测试中使用。
在多种医学应用中还期望能够在原代细胞转染时不使用病毒转
导。本文所述的BSSA可用于筛选纳米和/或微米尺度的结构，该结构单 独地或与不同涂层(如PLA、 PLG、 PAGA、和聚(D,L-丙交酯-共-乙交 酯)(PLGA)聚合物)联用，将增加DNA在多种细胞类型中的吸收。 例如，所述报告系统可由哺乳动物DNA表达栽体组成，该载体编码增 强的绿色荧光蛋白(EGFP)。这种质粒可用于BSSA，并且通过荧光显 微镜鉴定令人感兴趣的结构。
这样的结构在siRNA技术中以及在用于瞬时表达效应物基因(如 用于矫形研究的骨形成细胞中的BMP-2 )的原代细胞基因转导中将是主 要的兴趣点。
实施例3
筛选具有胚胎成纤维细胞和成骨MG3T3细胞的表面
图16-19显示了在BSSA晶片的测试区域上胚胎成纤维细胞的筛 选结果。图16显示在BSSA晶片的参考表面上的胚胎成纤维细胞。图 17显示在测试区域上的胚胎成纤维细胞，该测试区域具有特征高度为 1600纳米的"D2/4"表面结构。图18显示在具有特征高度1600纳米的 "D2/4"表面结构的测试区域上的胚胎成纤维细胞的另一些实例。图19 显示在测试区域上的胚胎成纤维细胞，该测试区域具有特征高度为1600 纳米的"D2/10"表面结构。
胚胎成纤维细胞是高度伸展的细胞，具有长和厚的应力纤维(肌 动蛋白纤维束)。此外，胚胎成纤维细胞还是活动细胞。如图16-19所 示，通过沿着它们选择性结构化，应力纤维具有与D2/4而不是D2/10 反应的倾向。在较少活动的细胞中，发现在该结构周围有F-肌动蛋白的 沉积。
图20-22显示了在BSSA晶片的测试区域上成骨MC3T3细胞的 筛选结果。图20a显示在玻璃上的MC3T3细胞，并且图20a显示在BSSA 晶片的参考表面上的MC3T3细胞。图21显示在具有"D2/4"表面结构 (1600纳米)的测试区域上的MC3T3细胞。图22显示在具有"D2/10" 表面结构(1600纳米)的测试区域上的MC3T3细胞。
MC3T3是具有较细应力纤维的较小细胞。此外，MC3T3还是较 少活动的细胞。如图20-22所示，在D2/4上而非在D2/10结构上有较 少应力纤维。此外，许多F-肌纤蛋白沉积在D2/4结构周围。最后，细
胞形状是^f艮据它们所在的结构。
在图16-22中，所有的染色都是在细胞接种48小时后用罗丹明标记 的鬼笔环肽进行的。
权利要求
1、一种用于测试用于细胞或生物培养的不同微环境的生物表面结构阵列，所述生物表面结构阵列包含多个测试区域，其中每个测试区域具有a)至少0.0625mm2的表面积，其中每个线性尺寸是至少250μm，以及b)待暴露于所述细胞或生物的表面，其中所述表面具有预定的规则的纳米或微米尺度的拓扑结构。
2、 根据权利要求1的生物表面结构阵列，其中所述规则的结构是 周期性结构。
3、 一种用于筛选细胞的生物表面结构阵列，所述生物表面结构阵 列包含多个测试区域，其中每个测试区域具有待暴露于所述细胞的表 面，其中所述表面具有预定的表面积和预定的周期性拓朴结构。
4、 根据权利要求1-3中任一项的生物表面结构阵列，其中所述表 面积是至少0.09 mm2,并且其中每个线性尺寸是至少300 nm。
5、 根据权利要求1-3中任一项的生物表面结构阵列，其中所述表 面积是至少0.1225 mm2，并且其中每个线性尺寸是至少350 nm。
6、 根据权利要求1-3中任一项的生物表面结构阵列，其中所述表 面积是至少4 mm2,并且其中每个线性尺寸是至少2 mm。
7、 根据权利要求l-6中任一项的生物表面结构阵列，其中所述拓 朴结构包含多个特征，所述特征的侧向(间距)尺寸在约lnm和约 1000,000 nm之间。
8、 根据权利要求7的生物表面结构阵列，其中所述尺寸选自以下 区间之一约lnm和约2nm之间、约2nm和约4nm之间、约4nm和 约10nm之间、约10nm和约100nm之间、约100nm和约1000nm之 间、约lnm和约2jim之间、约2jim和约4pm之间、约4nm和约lOpm 之间、约10jim和约100nm之间。
9、 根据权利要求1-8中任一项的生物表面结构阵列，其中所述阵 列的基底层包含硅。
10、 根据权利要求l-8中任一项的生物表面结构阵列，其中所述阵 列的基底层包含半导体、单种金属、合金、陶瓷、聚合物、共聚物、复 合物、药物递送系统、生物活性化合物中的至少一种。
11、 根据权利要求1-10中任一项的生物表面结构阵列，其中所述 阵列的表面层包含金属，如钽、钛、Ti-Al-V合金、金、铬、金属氧化 物、半导体氧化物、金属氮化物、半导体氮化物、聚合物、生物聚合物、 合金。
12、 根据权利要求l-ll中任一项的生物表面结构阵列，其中在所 述阵列的表面层上沉积了一种或多种生物活性化合物。
13、 根据权利要求12的生物表面结构阵列，其中所述生物活性化 合物是包含多肽的聚合物。
14、 根据权利要求13的生物表面结构阵列，其中所述聚合物包括 抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、 RNA、多糖、脂质、有机化合物、 无机化合物中的至少 一种。
15、 根据权利要求1-14中任一项的生物表面结构阵列，其中每个 测试区域具有最大的和最小的线性尺寸，并且所述最大和最小的线性尺 寸的比小于IO,优选地小于5，更优选地小于2。
16、 一种包含根据权利要求1-15中任一项的生物表面结构阵列的 试剂盒。
17、 根据权利要求16的试剂盒，其用于细胞附着测试、细胞分化 测试、细胞运动性测试、细胞增殖测试中的至少一种。
18、 一种筛选生物相容表面结构的方法，其包括以下步骤a) 将根据权利要求l-15任一项的生物表面结构与分离的细胞或 生物在适合所迷细胞或生物维持和/或生长的条件下相组合。
19、 根据权利要求18的方法，其还包括培养步骤，所述培养是(a) 在适合所述细胞或生物维持和/或生长和/或分化/去分化的条件下进行 的。
20、 根据权利要求18或19的方法，其中测试区域的每个线性尺寸 大到足够容纳一排至少5个细胞，优选地至少IO个细胞或生物，更优 选地至少20个细胞或生物。
21、 根据权利要求18-20中任一项的方法，其还包括比较所述细胞 或生物附着至所述生物表面结构阵列的任一测试区域的频率的步骤。
22、 根据权利要求18-20中任一项的方法，其还包括比较所述细胞 或生物在所述生物表面结构阵列的任一测试区域上铺展的步骤。
23、 根据权利要求18-20中任一项的方法，其还包括比较附着在所 述生物表面结构阵列任一测试区域上的细胞或生物的分化的步骤。
24、 根据权利要求18-23中任一项的方法，其中所述细胞或生物包 括动物细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、真核或原核细胞或 者生物中的至少一种。
25、 一种具有表面的生物相容材料，其中至少一部分所述表面的特 征在于预定的规则的纳米或微米尺度的拓朴结构，所述表面通过根据权 利要求18-24中任一项的方法获得。
26、 一种包含根据权利要求l-15任一项的生物表面结构阵列的晶片。
27、 根据权利要求29的晶片在体外细胞生物测试中的用途。
28、 一种用于执行体外细胞生物测试的包含根据权利要求29之晶 片的试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种生物表面结构阵列(BSSA)，该阵列包含多个测试区域，由此每个区域都具有表面拓扑，而该表面拓扑的特征是在微米或纳米尺度下定义的。本发明的BSSA还可包含吸附在一个或多个所述测试区域的化合物，如活性生物化合物或聚合物。
文档编号G01N33/50GK101180538SQ200680017763
公开日2008年5月14日 申请日期2006年4月25日 优先权日2005年4月26日
发明者弗莱明·贝森巴赫, 芬恩·斯科·彼得森, 莫恩斯·吕特高·杜赫, 莫藤·福斯 申请人:奥胡斯大学