专利名称：：活体表达谱的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于改善活体诊断成像的方法和工具。本发明还涉及用于生产能够精确诊断成像的工具的工具和方法，该成像基于多个生物医学靶标或生物医学疾病诊断靶标的同时的活体定性和/或定量检测，比如多个基因的表达或非表达，或者多个基因产物的存在或缺乏，基因产物诸如或者循环或者结合的蛋白质、碳水化合物或脂质或代谢物。
背景技术：
：病症比如癌症的诊断基于很多的步骤，包括物理检查、生物医学和组织病理学研究和诊断成像技术。肿瘤疾病的最终确诊需要通过物理介入(活组织切片检查、外科手术等)从可疑身体区域中提取组织取样。根据TNM分类系统，该组织在组织学上的特征提供重要的参数来分类肿瘤，该分类系统始终是用于定义适当的治疗方案和疾病预测结果的黄金标准。组织学分析允许将组织分类为恶性、良性或正常的。此外，还确定该区别的程度，提供研究的癌症细胞的扩散程度的指示。过去几年间的发展使其有可能监视可疑组织的代谢改变从而传递被研究组织状态的重要信息。所有采集到一起的诊断信息允许进入被研究癌症的最终阶段，其将确定阶段与所需的治疗方式、临床结论和存活几率直接联系起来。最近已经显示肿瘤的分类有可能通过多个基因或蛋白质的组合的活性和表达水平即所谓生物分子或表达谱的图案的研究来进行[Van'tVeer等人(2002)Nature415,530-536;VandeVijver等人(2002)NewEngl.J.Med.347,1999-2009;Van，tVeer(2003)NatureMed.9,999-1000]。这些图案的分析在可疑被感染身体区域的病体血清或病体组织上完成。当前诊断成像方法利用识别与病理条件相关联的靶标的靶向造影剂。单个蛋白质的检测在区分组成较高级哺乳动物的器官的成百个不同细胞类型时具有有限的作用。而且单个蛋白质通常不能以适宜的高灵敏度和/或特异性来区分细胞的不同生理状态。例如，当今所有用于癌性肿瘤诊断的肿瘤标志物(例如用于前列腺癌的PSA，用于卵巢癌的CA-125等)都受困于在非常早的阶段正确检测疾病的低灵敏度和特异性。基于这种蛋白质存在的临床结论预测通常显示出与个体疾病进展有很少的联系。相反，最近己经显示通过使用体外多个蛋白质或等同分析物(DNA、RNA、代谢物)的组合，基于分子属性将例如肿瘤细胞分类为一致的子分类也是可能的。多种研究已经表明过去怎样应用DNA阵列来分析并对癌症进行分类[Golub等(1999)Science286,531-537;Perou(1999)PNAS96,9212-9217;Alizadeh等(2000)Nature403,503-511;Perou等(2000)Nature406,747-752;Ross等(2000)NatureGenet.24,227-235;Bittner等(2000)Nature406,536-540;Unger等(2001)BreastCancerRes.,3,336-341;R讓sw呵(2001)PNAS,98,15149-15154;West等(2001)PNAS,98,11462-11467;Khan等(2001)NatureMed.7,637-679;Sorlie等(2001)PNAS,98,10869-10874;Perou等(2000)TrendsMol.Med.2000年12月，67-76;Alizadeh(2001)丄Pathol.195，41-52]。尽管单个标志物的方式是有价值的，但其是基于癌症病原和进程的过于简化的基本原理之上的。已证明了癌症显型的外在表达是在癌症细胞和宿主中很多交互路径和进程的结果。为了获得癌症的分子状态的更加完整的画面，在公共和私人部门的研究者都转向了可被用于同时测量成千基因的表达图案的DNA阵列。此外，已经显示了基于使用包括多个分子的状态(例如表达水平)的图案而不是使用单个事件来改善对肿瘤疾病的整体临床结论的预测是可行的(Shipp等人(2002)NatureMed.8,68-74;Shipp等人(2002)Nature,415,530-536;Pomeroy(2002)Nature,415,436-442;Beer等人(2002)NatureMed.8,816-824;Rosenwald等人(2002)NewEngl.J.Med.346,1937-1947)。例如在乳腺癌的情况下，当今临床使用的对于转移的最强预测(例如淋巴结状态、组织分级)不能根据它们的临床表现精确地分类乳腺肿瘤。通过使用在初期乳腺肿瘤上的体外基因表达分析和应用监督分类算法，可在诊断局部淋巴结中没有肿瘤细胞时能较强地识别出基因表达谱来预测在病人体内到远距离转移的短间隔("弱预测")。这种体外表达谱由涉及细胞循环、介入、转移和血管新生进程的基因组成(Van，tVeer等(2002)Nature415,530-536;VandeVijver等(2002)NewEngl.J.Med.347,1999-2009)。光学成像在活体成像工具中用于组织解剖、生理学和新陈代谢和分子功能的评估是极度灵敏的。当使用低水平辐射时荧光染料可在低浓度时检测到，此时产生对于病人无害的荧光信号。此外，用于疾病的光学活体成像的光学仪器和新造影剂在过去几年在市场上也同样出现了。对于器官和生物分子的光学成像使用了大量的标记。最新开发的一类用于活体光学成像的化合物是量子点。量子点在生物成像中的使用已被Goa等人[(2004)NatureBiotechnology22,969-976]证明，并且由例如Michalet等人[(2005)Science307,538-544;Gao&Simmon(2005)Curr.Op.Biotech16，63-72;还参见(2004)Phys.Med.Biol.49,R13-R48]进行了综述。尽管对于疾病的诊断和分类而言体外分子生物技术是可用的，但是仍然存在对于能够实现详细的特定病人的活体诊断即基于非介入整个身体的分析的技术的进一步需要。
发明内容本发明的一个目的是提供一种用于增强活体诊断成像的可替换的和/或改进的方法和工具。本发明的一个方面涉及用于生产能够精确诊断成像的工具的工具和方法，该成像基于多个生物医学目标或生物医学疾病诊断目标的同时的活体定性和/或定量检测，比如多个基因的表达或非表达(是否是野生型或突变的)，或多个碳水化合物或蛋白质或脂质(循环或结合的)的存在或缺乏。本发明的另一方面涉及通过非介入成像方式为疾病的精确诊断获得相关参数。本发明的方法涉及定性和定量的活体成像，从而确定与特定疾病状态相关联的标识谱的存在，其已经基于组织的分子生物参数而被确定。这使得使用非介入的诊断方法不仅能够诊断疾病状态而且更特别的是诊断疾病的亚型和进程阶段。其为疾病的治疗方案和结论预测提供了那些非常关键的信息。根据本发明的一个特定实施例，其中本发明的方法被应用到癌症的诊断，它们不仅实现了对于癌症存在的识别而且能够分类恶性或良性肿瘤，以及在恶性肿瘤的情况下，能够确定不同的程度和类别。因此，使用非介入的活体诊断方法，可以定义适当的治疗方案并预测用于治疗某种疾病的结论参数。根据本发明的第一方面，提供了一种基于对疾病或病症预先识别的标识谱对所述疾病或病症的活体诊断的方法。因此，本发明的方法包括第一方面，其基于作为生物医学靶标或生物医学疾病靶标或生物医学疾病诊断耙标的多个因素来确定疾病状态(所述疾病或病症的不同类型和进程阶段)的标识谱。这种表达谱可以例如是基因表达谱，比如多个基因的表达谱，例如基因的表达或非表达，或者基因产物比如蛋白质(酶、受体、结构化蛋白质等)的存在或缺乏，或碳水化合物、脂质、代谢物(结合或循环)的表达谱。第二方面包括测定所述标识谱能否通过病人的活体成像被检测到。这可通过利用不同的生物医学靶向基团例如基因和/或特定蛋白质和/或碳水化合物和/或脂质靶向基团(或结合或循环，以及或野生型的或突变的)来实现，所述每个靶向基团都用发射不同波长光的化合物标记。本发明的方法的一个特定实施例是癌症的诊断，其中本发明的方法能够识别特定类型的癌症(恶性、良性、初期、中期、扩散和非扩散肿瘤)。此外，在癌症的诊断中，本发明的方法能够识别转移归巢(metastaseshoming)的位置。根据另一方面，本发明提供制备用于通过表达谱进行疾病和病症的活体诊断的试剂盒的方法，其中试剂盒包括两个或多个，优选为多个特别针对不同因素的靶向基团。根据该方法的特定实施例包括制备或获得对于从包括基因和/或蛋白质和/或碳水化合物和/或脂质和/或代谢物的组中选择的因素特定的靶向基团。这些方法包括a)基于靶标或因素谱，例如多个基因的基因表达谱、多个基因产物比如蛋白质的存在或缺乏，禾口/或结合或循环的碳水化合物和/或脂质和/或代谢物的存在或缺乏，来确定所述疾病或病症的不同类型和进展阶段的标识谱，b)提供那些耙标或因素比如基因和/或蛋白质和/或碳水化合物和/或脂质和/或代谢物特定的靶向基团组成所述表达谱，以及C)用发射不同波长光的化合物标记每个耙向基团。根据所需的诊断，通过识别例如在健康个体和具有所述疾病或病症的个体之间区别表达的基因和/或蛋白质和/或碳水化合物和/或脂质的因素；和/或例如在疾病的不同阶段中区别表达的基因和/或蛋白质和/或碳水化合物和/或脂质的因素，和/或例如在生物基础不同但是可导致同样症状的疾病中区别表达的基因和/或蛋白质和/或碳水化合物和/或脂质的因素，根据本发明可确定与特定疾病、疾病类型或进程阶段相关联的标识谱。生物医学靶标，例如在这些情况下的每种情况中的基因，的区别表达是定性和/或定量的。根据本发明的特定实施例，使用比如微阵列分析和不同的显示方法的技术在体外确定标识谱。本发明的特定实施例涉及标识谱，其中区别表达的蛋白质是细胞表面蛋白质、细胞表面受体或隐性蛋白质。本发明的另一方面还涉及通过表达谱对病症进行活体诊断的试剂盒，其中试剂盒包括直接针对在健康和疾病中区别表达的因素的多个靶向基团，其中不同的靶向基团被不同地标记。根据特定实施例各个因素选自由基因和/或蛋白质和/或碳水化合物和/或脂质和/或代谢物组成的组。根据特定实施例，每个不同的靶向基团用发射不同波长的光的化合物来标记。本发明该方面的特定实施例涉及试剂盒，其中发光的化合物选自由荧光染料、量子点和发光材料比如纳米荧光体组成的组。本发明的另一个特定实施例在本发明的环境中使用量子点，因为它们能够产生具有不同发光光谱的大量标记，该光谱能够通过特异性的和灵敏的方式进行定性和定量检测。在本发明环境中提出的特定量子点包括由SeCd、CdS、HgTe和CdTe制成的量子点。在本发明的用于活体检测的方法和试剂盒中使用的靶向基团包括蛋白质、抗体或片段或其衍生物反义分子、适配子、肽或类肽、荷尔蒙和能够结合特定靶标的小分子。根据本发明的特定实施例，靶向基团是单克隆抗体或抗体片段或衍生物，比如单链Fv或Fab片段。对于本发明的活体检测方法特别有用的是人源化的抗体或抗体片段。根据本发明的特定实施例，组成活体检测的标识谱(或者其代表性选择)的基因和/或蛋白质和/或碳水化合物和/或脂质和/或代谢物的数量在2到10之间，更特别的在2到5之间，但是组成标识谱的5到10或10到20个比如基因的生物医学目标也是可以的。本发明的试剂盒中具有相应数量的靶向基团。本发明的另一方面涉及在诊断成像中所述的试剂盒的应用。本发明的另一方面涉及对应于其表达与疾病相关联的特定因素的多个特定靶向基团在用于组织或器官的活体诊断成像的诊断试剂盒的制造中的应用，其中使用发射不同波长光的化合物来标记每个不同的靶向基团。更特别的，所述因素是基因和/或蛋白质和/或碳水化合物和/或脂质和/或代谢物。本发明将根据特定实施例并参考某些附图来描述，但是本发明不被它们限制，本发明仅由权利要求限制。权利要求中的任何参考标记不应当被理解为限制其范围。在此描述的附图仅是示意性和非限制性的。在附图中，一些单元的尺寸被夸大了并且没有按比例画，其仅用于说明的目的。其中在说明书和权利要求中使用了术语"包括"，其并不排除其它元件或步骤。此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等等是用于区分类似的单元并且不一定是在描述连续的或先后的顺序。应当理解的是这样使用的术语在适当环境下是可互换的并且本发明在此描述的实施例能够以除了在此说明的其它顺序来操作。而且，说明书和权利要求中的术语顶部、底部、上面、下面等等是用于描述目的并且不一定用于描述相对位置。应当理解的是这样使用的术语在适当环境下可互换并且本发明在此描述的实施例能够以除了在此说明的其它方向描述。图1是不同尺寸的QD(量子点)取样的吸收和光致发光；图2是用相同UV波长激发的不同尺寸的量子点。具体实施例方式本发明涉及确定疾病或病症的不同类型和进程阶段标识谱，以及所述标识谱在活体诊断成像中的应用。在此使用的用于疾病和/或疾病的类型和进程的标识谱指的是作为疾病特征的表达谱。这种标识谱是通过以下方法得到定性或定量测定多个个体的因素的表达水平，然后与适当的控制或参照(即健康个体、不同类型的疾病、不同阶段的疾病)的表达水平进行比较，从而识别因素的哪个组合能够通过控制或参照区分疾病、疾病的类型或疾病的阶段。在此提及的因素包括在疾病状态中被不同地表达的任意分子。根据本发明的特定实施例，其表达组成标识谱的因素是基因、蛋白质、碳水化合物、脂质和/或代谢物。在本发明的环境中这种标识谱可包括至少两个的表达，更特别的在2到10之间，例如4，5，6，或7，或者任选的在IO到20或20到30个因素之间。确定基因的表达水平可通过测量蛋白质含量来直接执行或通过测量在DNA或mRNA水平的基因表达来间接执行或者通过测量作为基因产物蛋白质的蛋白质的存在(定性和/或定量)和/或活性来再次直接或间接执行(例如其中基因编码酶、酶的代谢产物)。根据本发明的一个实施例，与特定疾病或病症或其特定类型或进程阶段相关联的标识谱的存在或缺乏，通过应用能够确定标识谱的特定因素的多个特定靶向基团在病体中进行活体成像来识别，其中每个不同的靶向基团被有区别地进行标记。在此使用的区别标记是指对于每个因素或靶标每个靶向基团使用不同的标记，其允许在同时检测不同因素时进行区分。区别标记的一个例子包括使用发射不同波长光的化合物。被光学检测的每个靶向基团与它们的靶标因素的结合定性或定量地反映了不同靶标的存在。基于以上，可确定病人活体的标记谱的存在或缺乏。根据本发明，在特定条件下产生标识谱，使用基于以上的检测方法，例如活体检测方法，能够实现所述条件非常精确的识别。由于本发明的标识对于所述条件谱的特异性，本发明的方法不仅允许一般疾病条件(比如癌症、关节炎、进口药剂的感染等)的诊断，而且能够区分不同类型疾病、不同阶段的疾病，以及在一些情况下能够预测诊断疾病的进一步发展和/或鉴定特定治疗的敏感度。根据本发明的标记谱的产生通过特定的疾病或疾病类型或其进程状态的表达谱以及对特定的疾病或疾病类型或其进程状态的表达谱与充分控制或参照之间的比较来完成。因此基于所需的标识谱的类型，可通过识别因素来获得标识谱，该因素例如是当在健康个体和具有特定疾病或不适的个体之间比较时在组织中区别表达的基因、蛋白质、碳水化合物、脂质和/或代谢物，通过识别在疾病的不同阶段在组织中区别表达的各因素或者通过识别在生物学基础不同但是在病人上产生相同症状的疾病中一个或多个组织上区别表达的各因素。在每个这种情况下，该区别表达可以是一个因素的定性或定量表达或二者上各区别的结果。在一定条件下组织的表达谱可在体外或体内获得。根据本发明的特定实施例，组织的表达谱在体外获得。对于特定条件的表达谱可在体外确定，例如通过使用方法比较来自被感染组织的生物材料和控制组织的生物材料，该方法例如是但是不限于微阵列技术、区分显示方法和蛋白质组技术，例如比较结合有质谱的二维蛋白凝胶图案。这种比较优选是基于多个样品，从而改善所研究的区别的可靠性；随后任选通过适当的数据分析系统(例如使用诸如学习算法的算法)分析通过这些方法获得的数据。这些方法能够进行定性和定量的测定并且能够同时区分大量因素的表达。在本领域中对于不同疾病比如不同类型的癌症的特定组织可在体外识别基因表达谱[Van'tVeer等(2002)Nature415,530-536]。根据特定实施例，本发明的方法包括体外获得的信息到体内检测设置的应用和转移。能够实现标识谱的(定性和定量的)检测的活体检测方法的使用也是可预想的。因此本发明提供工具和方法以通过非介入成像方式获得对于特定疾病(例如，但是不限于癌症)的分类和结论参数，从而避免外科手术介入来抽出病人身体的组织部分。表达谱以及随后与参照的比较能够识别可将某个(定性和/或定量)表达谱与某特定条件相联系的因素的特定系列或组合。根据本发明，任选从该系列因素中作出选择，来确定那些其表达能够进行活体检测即用靶向基团进行靶向的那些因素。这种靶向可以是基因、对应的mRNA、对应的基因产物、所述基因产物的糖基化物或所述基因产物的底物或代谢物。在一些情况下，基因的表达还可通过靶向与基因(比如酶的代谢物)表达直接相关联的化合物来检测。以下是关于本发明的活体诊断方法中被分析的适当因素或靶标的选择的选择标准因素在细胞内或外的定位、靶向基团与体内因素的结合作用(即在细胞的新陈代谢或活动上)，并且这是对于被感染和未被感染的细胞和组织的，其它实际考虑还可确定因素或所选的靶标的选择，比如与所述因素特异性结合的靶向基团的有效性和尺寸。在本发明的活体方法中预期可作为因素被检测的分子类型包括细胞表面蛋白质、受体、隐性蛋白质、胞质体蛋白质、细胞核蛋白质、碳水化合物、代谢物等。根据本发明的特定实施例，因素或靶标是隐性蛋白质(生长因子和细胞信号分子)和/或细胞表面蛋白质比如细胞膜受体、细胞粘结分子和其它细胞表面多肽，其能够容易地接近靶向基团。然而可替换的，因素是内部分子如信号级联的成分，诸如激酶、磷酸酶或转录因子。根据本发明，所选择的因素组合的定性和/或定量表达能够实现某个条件的特异性识别。然而，这并不排除在本发明的活体方法要检测的因素组合中，例如在实现某个细胞或组织或某个代谢反应的识别中存在在标识谱中作为参照的因素。因此根据特定实施例，用于基于标识谱的活体检测中选择的多个因素或靶标还包括在健康和疾病条件下或者在疾病的不同阶段中具有恒定表达的靶标。根据特定实施例该靶标对于被研究的器官或者细胞类型是特异性的。因素的一个例子是GFAP(胶质纤维酸性蛋白质)，其在星形胶质细胞表面被特异性表达。该蛋白质可用于区分神经细胞和星形胶质细胞。不同的耙向基团可用于本发明的环境中。适用于在DNA或mRNA水平的基因表达检测的靶向基团典型地是反义分子。低聚核苷酸可通过链霉亲和素和生物素之间的强特异性交互作用来用量子点标记。可替换的，DNA耦合到包含量子点的微球体。适用于蛋白质或碳水化合物表达的检测的靶向基团是例如抗体(以及抗体片段)、肽、荷尔蒙、受体配合物、适配子和小分子比如酶抑止剂、受体激动剂和受体拮抗剂。根据某个实施例，靶向基团与细胞表面蛋白质例如受体和细胞膜蛋白质，尤其是与细胞和细胞之间相互作用相关的蛋白质相连接。在优选实施例中，靶向基团是低分子量蛋白化合物比如抗体片断、配合物和表示配体的结合部分的肽。为了使用活体成像技术检测细胞内靶标，靶向基团必须进入细胞。上述相同的化合物和方法适用于该目的。而且，可以预想对于一些条件，细胞内目标用于溶解细胞的检测。例如，癌症发展的特点细胞的高速分裂细胞并且产生大量的溶解细胞。使用没有被非溶解细胞内部化但是结合到细胞内的蛋白质的一个或多个靶向基团能够区分发生高增殖速率和低增殖速率的器官，其指示肿瘤的侵袭性质。通过耙向基团与其分子靶标的高亲合性结合，得到成像过程中的高位置特异性信号。根据本发明，在活体同时检测因素组合中的每个的特异(定性和/或定量)表达，尤其是通过活体成像检测。因此，本发明的方法和化合物依赖于标记和允许同时区分检测不同因素的相应检测方法使用。优选的这种标签和其检测方法允许多个不同因素的定性和定量检测。根据本发明的特定实施例，其通过光学成像和发光标记的使用来实现。光学成像在用于组织解剖、生理学和新陈代谢和分子功能的评估的活体成像工具时极度灵敏。对于生物的光学成像一般基于在UV(紫外线)和NIR(近红外)光谱区域范围内的光发射。光进入活体组织的穿透深度有赖于应用的波长，因为入射光的散射和吸收与应用的波长机能相关。在小于600nm的光谱范围中，身体组织中的光吸收相对较高导致了几百微米至几毫米的小穿透深度，其仅适用于组织或器官表面的表面研究。为了较大组织容量的成像，在NIR频谱范围(700—900nm)内的光更加合适，并且其提供对评估材料的达到几厘米的较高穿透深度。因此，识别生物体中组织的组织的形态和/或功能的改变是可能的。根据本发明，每个靶向基团链接到对比增强材料(标记)上，允许同时对每个因素或靶标进行定性和/或定量检测。根据本发明的特定实施例可以预想用于在活体内识别标识谱存在的因素组合的检测的所有革巴向基团用相同类型的标记来标记(其可使用相同成像形式来检测)。为了使用光学成像以定性和定量的方式确定因素的表达，每个不同的耙向基团都用在不同波长发光的光学标记来标记。根据本发明适用于光学成像标记例如是荧光染料和量子点。根据一个实施例用于光学成像的标签是荧光标记。在不同波长发光并且适用于标记不同靶向基团的荧光分子在本领域中是已知的并且在商业上是可得的(例如Sigma-Aldrich)。根据另一个实施例，根据本发明使用的用于光学成像的标记是量子点，也被称为Qdot或QD(它们是商业上可得的，例如EvidentTechnology)。这些是典型地从II/VI和III/V材料系统衍生的结晶半导体团簇。最常使用的半导体是CdSe、CdS、HgTe、InP禾nInAs。量子点的结构尺寸应该在各个材料的激发波尔半径的数量级上，为了获得量子效应，其典型的数量是l一10nm的尺寸。使用适当的合成方法可产生具有准球形的晶化完善的粒子[Myrray等(1993)J.Am.Chem.Soc.115,8706,Micic等(1996)Appl.Phys.Lett.68,3150;Vossmeyer等J.Phys.Chem.98，7665(1994)]。尽管结晶过程能够被很好的控制，合成中典型地形成分布的尺寸。该分布形成了电子状态的加宽，并且因此形成了QD总体的光学响应。尺寸分布可通过尺寸选择性沉淀大约20—35nmFWHM(半高宽)的方式来变窄。Qdot可被合成在所谓的"核壳"系统中，其中粒子用具有较高带隙的壳体材料来围绕，例如ZnS。在该系统中粒子的光学属性由材料的选择的核体的尺寸来定义。壳体通过降低低能位表面陷阱态的方式来调节核体的表面，其中低能位表面陷阱态与尺寸无关并且与半导体材料的体带隙的关系紧密。这实现了更高的荧光发射效率和Qdot的化学和光学稳定性。此外，可进一步引入的有机或聚合物材料涂层，其例如可通过防止凝聚增加溶液中粒子的胶质稳定性，提供有效的电子屏障(通过钝化表面阱状态，来帮助限定纳米晶地的电子和孔波函数)，调节它们在不同介质中的溶解性，提供生物分子结合的连接化学性质，并且减小非特异性结合。其已经显示了与Qdot结合的生物分子像抗体一样保持它们的生物活性，并且它们可通过对方案的细微调整在普通化验中使用。可制备具有相同的表面性质和连接化学性质与它们的发光颜色无关的高效Qdot。上述量子效应从胶状Qdot的带隙的相关性产生并且因此它们的发射波长取决于粒子尺寸。随着粒子尺寸的减小发射能量会增加。因此，实际上仅使用几个不同的半导体材料就可实现从UV到IR的每个发射波长。对于具有不同主要尺寸的一系列InPQD总体的吸收和发射的改变在图1中再现。如图所示可看到发射最大值以及吸收边二者的蓝移，与上述预测一致。这表明了光学带隙的尺寸相关性。除了它们又窄又对称的发射带之外，它们非常高的光稳定性和消光系数以及它们非常高的量子产率，Qdot基本上吸收小于它们的发射波长的每个波长。因此，在可见和IR光谱区域中发光的所有Qdot粒子可用相同UV能量同时激发(参见图2)。特别的该性质简化了Qdot在复合化验中的应用并且大大减小了设备的成本，因为对于不同的发光颜色不再需要不同的激发源(激光)。因此，Qdot的使用具有多个优点并且实现了复合方式。量子点可被应用在体外和活体的生物装置中。用特定颜色对全部细胞群进行快速标记可使用作为胞吞作用的有效易化蛋白的肽转运结构域或阳离子脂质来执行。使用功能化的qdot可,得更好的特异性和有效性。另一个策略包括将一抗与qdot交联。这可通过两种不同的方法来执行。第一种方法包括直接与靶标对应的一抗的生物素化，其随后被附着到抗生物素蛋白涂覆的qdot。第二种方法包括涉及与抗体的Fc区域具有亲合力和与带电qdot具有静电相互作用的连接蛋白。为了减小qdot探针的尺寸，表面受体的配体通过生物素链霉亲和素或通过如上技术所述的直接交联与qdot结合。例如，EGF-标记qdot可被用于研究在不同的癌症细胞株中的受体介导信号转换。一些蛋白质可被肽识别，并且这些可用如上述现有技术中所述的用于功能化qdot中的肽。在没有这些肽序列或者识别配体时，靶标分子可被设计为包括可识别多肽，例如通过抗生物素蛋白多肽链结合到人类CD14受体的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定序列[Pibaud等(2004)J.Am.Chem.Soc.126,6115]。而且，生物素化肽一涂覆qdot可被用于标记在细胞的胞质膜中表达的抗生物素受体。相同的概念可被用于靶向和标记细胞质或细胞核耙标。然而，如果想要内部化，那么qdot需要(0进入细胞质并且(n)达到它们的目标而不陷于胞吞作用路径(以上引用的Jmswal等)。肽-qdot可被用于通过现有技术所述的静脉注射到活鼠来靶向组织特异性血管标记(肺血管和癌症细胞)。Qdot在可见光谱内发光，并且如现有技术所述光谱分层算法可被用于从器官的qdot信号中分离组织自动荧光。该问题可使用NIR发光qdot(850nm)来克服[Kim等(2004)NatureBiotechnol.22,93-97]。Qdot还可用于发展用于染料的活体交联策略，比如耙向四半胱氨酸基序列的联砷配体的使用[Adams等(2002)J.Am.Chem.Soc.124,6063-6076(2002)]，靶向六组胺酸基序列的^2+-氮三乙酸基团的使用[1<:3口3111￡^等(2001)J.Am.Chem.Soc.123,12123-12125]。与生物素一抗生物素蛋白对正交的亲合对的发展也可应用于本发明，所述亲和对中的一个成分可被容易地附加或结合到靶标蛋白质。已经报道了由分子演变发展的所述对的很多实例，其中结合肽含有约200氨基酸[靶向荧光素的单链片断抗体，解离常数Kd约为50Fm[Boder等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，10701-10705]到大约30氨基酸[靶向的发夹形肽，Kd约为25pM[Mark(2004)Chem.Biol.11,347-356]。用于根据本发明的可替换的成像形式包括核成像、MRI和CT。适用于核成像的适当标签例如是99锝、125碘(SPECT)、18氟、11碳(PRT)，适用于超声成像的适当标签是充气微泡和脂质体。用于MRI的标签典型的是Gd络合物，氧化铁(磁性)和纳米粒子。用于CT的标签典型的是碘化合物和脂质。如上所示，根据本发明的特定实施例，可以预想用于检测活体识别标识谱存在的靶标组合的所有靶向基团用相同类型的标签来标记(其可使用相同的检测方法检测)。然而根据本发明可替换的实施例，一个或多个靶向基团，尤其是那些用于识别与非疾病有关的靶标的靶向基团，还可包括另一类型的标签。例如在其中量子点被用作标识谱的基因的标签的装置中，与具有恒定表达水平的蛋白质结合的基团用例如微泡或用于MRI的化合物来标记。这实现了器官的可视化并且还可用作浓度测定的内标。根据本发明的实施例可替换地，组成标识谱的基因的表达的检测还可通使用以不同成像形式的标签标记的多个靶向基团来完成。例如，一个靶向基团用荧光染料标记，第二靶向基团用放射性同位素标记以及第三靶向基团用超声微泡标记。随后采用光学成像、射线照相术和超声波的组合来准同时确定不同靶向基团与它们耙标的结合。本发明的一个方面涉及一种用于疾病或病症的特异性活体诊断方法，其基于活体确定一组因素的表达谱，基于先前识别的所述疾病或病症的标识谱。活体检测方法例如通过使用特定于这些因素的每个用在发射不同波长光的化合物来标记的多个靶向基团来实现。本发明的方法实现了多个非常特定疾病状态的识别。例如可获得标识谱从而实现识别疾病类型，提供疾病进程的信息、结论和/或适当的治疗。对于本发明的方法可预期的重要应用是癌症的诊断。实际上，如在现有技术中的体外识别的表达谱所证明，本发明的方法能够区分良性和恶性肿瘤，并且能够确定某个肿瘤的等级。特定因素的表达也被证明与肿瘤转移的可能性有关。几个基因和/或蛋白质(例如白介素-11(IL-ll)、缔结组织成长因子(CTGF)、趋化因子受体-4(CXCR-4)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)或者肿瘤抑止蛋白VHL(pVHL)指示了肿瘤远距离转移的高发生率[Van'tVeer(2003)NatureMed.9,999-1000;Bernard(2003)Nature425，247-248]。已发现某些基因的表达也指示了某个肿瘤在身体中转移位置的优选场所[Kang等(2003)CancerCell3,537-549]。最终，更具特异性的癌症诊断实现了特制的治疗方案虽然化疗减小了远距离转移的将近三分之一的风险；然而70—80%接受这种治疗的病人可以不用化疗而存活下来。通过使用在原发性乳腺肿瘤中的体外基因表达分析以及监督分类算法的应用，在诊断中通过识别基因表达标识来强有力地预测短时间内局部淋巴结中没有肿瘤细胞的病人体内的远距离转移间隔("弱预测")。该体外表达标识由涉及细胞循环、侵袭、转移和血管生成过程的基因组成[Van'tVeer等(2002)Nature415,530-536;VandeVijver等(2002)NewEngl.J.Med.347,1999-2009]。已报道发现提供了策略来选择能够从该治疗中受益的病人。本发明的方法还使得采用非介入的活体检测方法来识别个人病体的表达标识成为可能。本发明的活体表达诊断工具用作可替换的方式或者与以下诊断技术的一个或多个结合使用物理检查、生物化学和组织病理学研究以及基予其形态例行诊断癌症的诊断成像技术。例l:乳腺癌活体表达谱的量子点标记靶向基团分析了所描述的乳腺癌的体外表达谱的该组70个基因(Van'tVeer等Nature415,530-536)用于活体表达谱的适用性表1描述的靶基因是选自上述该组70个基因分泌蛋白或细胞外蛋白质。靶向基团的可用性还可进一步确定靶标，并且这些靶向基团的每个被不同的量子点标记。表l:乳腺癌成像的耙标<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>随后一组2—10个的这些标记用于活体检测己被诊断患癌症的病人的不同癌症类型的标识谱，从而对每个病人确定最佳治疗方案。权利要求1.一种用于疾病或病症的活体诊断的方法，包括步骤基于多个因素的表达谱确定所述疾病或病症的不同类型和进程阶段的标识谱；利用对于每个所述因素的不同的特定靶向基团，确定在病人体内是否检测到所述标识谱，其中每个所述靶向基团被不同地标记。2.如权利要求1所述的方法，其中所述因素选自由基因、蛋白质、碳水化合物、脂质和代谢物组成的组。3.如权利要求1所述的方法，其中每个所述的特定靶向基团用发射不同波长光的化合物、或者用不同放射性同位素标记的化合物(用于PET、或者SPECT成像的目的)、或者具有不同磁性特性的基团标记的化合物(用于MR成像的目的)来标记。4.如权利要求1所述的方法，其中疾病或病症是癌症。5.如权利要求3所述的方法，其中所述方法实现了对选自由良性、恶性、初期、中期、蔓延性和非蔓延性肿瘤组成的组的癌症类型的识别。6.如权利要求3所述的方法，其中标识谱识别转移归巢的位置。7.—种通过表达谱进行疾病或病症的活体诊断的试剂盒的制备方法，所述试剂盒包括多个靶向基团，其中每个靶向基团都特定对应于一个因素，所述方法包括步骤a)基于多个因素的表达谱确定所述疾病或病症的不同类型和进程阶段的标识谱；b)提供特定对应于每个所述因素的靶向基团；c)不同地标记每个所述靶向基团。8.如权利要求7所述的方法，其中所述因素选自由基因、蛋白质、碳水化合物、脂质和代谢物组成的组。9.如权利要求7所述的方法，其中所述不同地标记包括用a)发射不同波长光的化合物，b)不同放射性同位素标记的化合物(用于PET、或者SPECT成像的目的)，或者c)具有不同磁性特性的基团标记的化合物(用于MR成像的目的)来标记所述特定靶向基团。10.如权利要求7所述的方法，其中所述标识谱通过识别以下因素进行确定1)在健康个体和患有所述疾病或病症的个体之间不同地表达的因素；和/或2)在疾病的不同阶段不同地表达的因素；3)在其生物学的基础不同但是可导致相同症状的疾病不同地表达的因素，其中所述不同表达是定性的和/或定量的。11.如权利要求7所述的方法，其中所述标识谱在体外确定。12.如权利要求11所述的方法，其中所述标识谱通过微阵列分析确定。13.如权利要求7所述的方法，其中所述因素是细胞表面蛋白质、细胞表面受体或隐性蛋白质。14.一种用于通过表达谱进行病症的活体诊断的试剂盒，所述试剂盒包括每个都特定对应于不同因素的多个靶向基团，其特征在于每个所述靶向基团用发射不同波长光的化合物来标记。15.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述发射光的化合物选自由荧光染料、量子点、发光物质、放射性核或同位素、顺磁性和/或超磁性物质组成的组。16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述发光物质是纳米荧光体。17.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述量子点选自由SeCd、CdS、HgTe和CdTe组成的组。18.如权利要求14所述的试剂盒，其中靶向造影剂用不同的对比增强物质来标记。19.如权利要求14所述的试剂盒，其中靶向基团选自由蛋白质、抗体或抗体的片段或衍生物、反义分子、适配子、肽或类肽、荷尔蒙和能够特别连接到靶标的小分子组成的组。20.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体。21.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述抗体片段或其衍生物是Fv或Fab片段的单链。22.如权利要求19所述的试剂盒，其中抗体、抗体片段或其派生物是人的或人化的。23.如权利要求14所述的试剂盒，其中基因和/或蛋白质的特定靶向基团在2到5之间。24.如权利要求14所述的试剂盒，其中基因和/或蛋白质的特定靶向基团在2到IO之间。25.权利要求14所述的试剂盒在活体诊断成像中的应用。26.多个基因和/或蛋白质的特定靶向基团在制造用于组织或器官的活体诊断成像的诊断试剂盒中的应用，其中每个不同的靶向基团被发射不同波长的光的化合物标记。全文摘要本发明涉及使用多个特定靶向基团的活体表达谱，其中每个靶向基团用能够同时识别每个靶向基团到靶标的连接的不同化合物标记。文档编号G01N33/50GK101194164SQ200680020382公开日2008年6月4日申请日期2006年6月1日优先权日2005年6月7日发明者H·赫梅尔,M·温特,R·霍夫曼申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司