样品溶液中白蛋白的分析方法

文档序号:6122891阅读:1138来源:国知局

专利名称::样品溶液中白蛋白的分析方法
技术领域
:本发明涉及通过质谱分析法或液相层析法分析样品溶液中白蛋白的方法。更具体来讲,本发明涉及分析样品溶液中白蛋白的方法,其特征在于应用质谱分析或液相层析之前对样品溶液的预处理方法,涉及精确和稳定地分析氧化型白蛋白和还原型白蛋白在样品溶液中的量及其存在比值的方法,以及用于精确控制白蛋白定量分析的白蛋白标准样品。
背景技术
:白蛋白是广泛分布在生物体内的最高量的蛋白质。人白蛋白是由585个氨基酸组成的单纯蛋白质,分子量为66kDa,分子内具有17个二硫键和1个游离的半胱氨酸残基。白蛋白在肝脏内产生,分泌入血中。白蛋白在总血浆蛋白中约占60%,已知具有包括下列的生理机能(l)控制和维持血浆渗透压,(2)转运胆红素、氨基酸、脂肪酸、.激素、金属离子、药物等,(3)营养不良时的氨基酸来源,(4)氧化还原緩沖能力等。特别是,药物与白蛋白之间的结合与药物功效的表达密切相关。如上所述,白蛋白是具有各种功能的蛋白质。已知还原型和氧化型白蛋白、糖化白蛋白等不均匀地存在于生物体内的白蛋白中。特别是,白蛋白的进行性糖化通常可见于关于糖尿病的报道(SuzukiE.,DiabetesRes.18(3),153-158,1992),通过葡萄糖结合形成的糖化白蛋白与血红蛋白Alc同样,作为监测血糖水平的标志,在糖尿病临床状态时受到重视。另一方面,也已知生物体内还原型白蛋白(Alb(red》和氧化型白蛋白(Alb(ox))的存在与生物体的疾病有关,近来已引起人们的注意。已知血液中存在Alb(red)(其中N-端第34位半胱氨酸的SH基是游离的)和Alb(ox)(其中通过二硫键将含硫体内化合物如半胱氨酸等加成到第34位半胱氨酸的SH基上)(EraS,Int.J.PeptideProteinRes.31,435-422,1988)。因为二硫键可以在短时间内可逆性形成和解离,所以Alb(red)和Alb(ox)在体内是动态平衡的。因此,Alb(red)和Alb(ox)在血浆中的存在比反映血液的氧化还原状态。也就是说,当受到一些氧化应激时,Alb(ox)的存在比增加。具体来讲,已知在高龄者以及肾病综合征、透析、肝病等患者中Alb(ox)增加(SogamiM.,J.Chromatogr.,332,19-27,1985;AkiharuWatanabe,PhamaMedica,19,195-204,2001;SuzukiE,DiabetesResClinPract,18,153-158,1992)。此外,从血液氧化产物增加、抗氧化酶活性降低和形成与微血管损伤有关的自由基各方面来看,可将糖尿病患者视为处于氧化应激状态(OberleyLW,FreeRadicalBiol.Med"5,113-124,1988)。氧化应激状态是不良状态,其中生物体内氧化反应和抗氧化反应失衡,氧化反应占优势。据说氧化应激导致细胞DNA、细胞膜上的磷脂、蛋白质和碳水化合物损伤,血管病加重,健康状况恶化。这样,据说氧化应激导致老化和各种疾病,已知具有抗氧化剂作用的物质如多酚等对健康有益。因此,如果可以很容易地监测体内的氧化状态,就能够监测健康状况,筛选药物和保健品。已知肝硬化是其中氣化型白蛋白增加的一种代表性疾病。在肝硬化患者中,因为肝脏产生白蛋白的能力减退,所以血液白蛋白水平降低。为了治疗低白蛋白血症,使用人血浆白蛋白制剂和支链氨基酸制剂。在肝病如肝硬化等中,可看到白蛋白水平降低和氧化型白蛋白增加(WatanabeA,Netrition20,351-357,2004)。而且,肾功能损伤(TerawakiH.,KidneyInt.65(5),1988-1993,2004)、糖尿病(SuzukiE.,DiabetesRes.18(3),153-158,1992)、风湿病(NarazakiR.,Arch.Toxicol.14,351-353,1998)、衰老(EraS.,Biochim.Biophys.Acta"1247(1),12-16,1995)等也可出现由氧化应激导致的氧化还原平衡的波动。这样,白蛋白通过自身形成还原剂.氧化剂,在生物体内表现氧化还原緩冲能力。因此,可将氧化型白蛋白与还原型白蛋白的存在比一见为反映生物体的氧化还原状态。因此,一旦可以精确地测定体内血液中还原型.氧化型白蛋白比值,即可灵敏地监测由氧化应激所致疾病的进展、治疗效果或者健康状况。换言之,一旦可容易地测定体内血液中氧化型/还原型白蛋白比值,就可容易地监测疾病的进展程度和治疗效果或者健康状态。有几种方法可测定Alb(red)与Alb(ox)的比值。其中一种用染料结合法将白蛋白定量。作为用于染料结合法的染料,使用两种溴甲酚绿(BCG)和溴曱酚紫(BCP)。因为BCP法对Alb(red)和Alb(ox)显示不同的反应性,所以将BCP法和BCG法测定的白蛋白定量值的差异视为反映Alb(ox)的存在比。然而,该方法在定量方面明显不足。此外,有一种用游离SH基定量试剂如Ellman,sReagent等将Alb(red)-衍生的SH基定量的方法(SogamiM,Int.P印t.ProteinRes.,24(2),96-103,1984)。然而,该方法不能区别非白蛋白的具有SH基的物质。目前,最好的方法是用高效液相层析(HPLC)(SogamiM.,J.Chromatogr.,332,19-27,1985;JP-A-61-155397;JP-B-2-4863)。在用HPLC分析血清白蛋白时,可分别检测还原型白蛋白(Alb(red))和氧化型白蛋白(Alb(ox))。可从分离层析图的峰面积比确定Alb(red)量与Alb(red)和Alb(ox)总量的比值(Alb(red)。/c^Alb(red)峰面积/(Alb(red)峰面积+Alb(ox)峰面积)x100)。然而,现有HPLC法存在一些问题。第一个问题是样品的稳定性。因为血浆中的还原型白蛋白高度不稳定,所以即使在-20。C的保存条件下,由于自然氧化,氧化型白蛋白也会增加,Alb(red)。/。值降低。这种反应与温度上升平行。因此,据说应将血浆保存在-70。C或以下(RyozoMuramoto,IgakunoAyumi,198(13),972-976,2001)。用HPLC法测定时,应将保存在-70。C或以下的血浆融解,然后立即进行HPLC测定。第二个问题是Alb(red)与Alb(ox)分离不充分。因为Alb(red)与Alb(ox)的结构差异非常小,所以用HPLC极难将它们完全分离,在层析图上不能获得基线分离(KeikoYasukawa,临床检查,44(8),907-910,2000)。第三个问题是氧化型白蛋白的结构信息少。在Alb(ox)中,含〃琉化合物如半胱氨酸、谷胱甘肽等通过二石克4定^:合在白蛋白N-端第34个残基半胱氨酸上。用HPLC法检测的Alb(ox)结构不能通过HPLC法具体得知。最近,有^Jl称用质谱仪分析白蛋白的方法可作为可能解决上述第二和第三个问题的方法(KeikoYasukawa,临床检查,44(8),907-910,2000)。近年来质谱法的发展显著,即使对大分子量的蛋白质,其高精确度和高质量分辨率的测量也正成为可能。Alb(ox)比Alb(red)重,其差值在于所加成化合物(例如半胱氨酸)的质量。因此,通过用足够质量分辨率的质谱仪测量可分别检测Alb(red)和Alb(ox)。在上述文献中,Yasukawa等用电喷射离子化质谱仪(ESI-MS)测量了健康者和糖尿病患者的白蛋白,检测了Alb(red)和Alb(ox),还检测了糖化白蛋白。然而,对于ESI-MS法而言,上述第一个问题也仍然是严重的问题。因为当保存温度不在-70。C或以下时,血浆中氧化型白蛋白比值增加,很难保存样品。而且,因为冷冻保存的血浆从融解至测定期间氧化型白蛋白的比值持续增加,所以出现测量值的波动。因此,通过常规方法,应将保存在-70。C或以下的血浆融解后立即进行HPLC测量或ESI-MS测量。截至测量的时间和室温引起Alb(red)%值的变化。而且,因为用于增强分析精确度的标准物质不能稳定地保存,所以分析精确度的控制非常困难。此外,难以用自动注射器自动分析和自动省力地测量。因此,对还原型白蛋白与氧化型白蛋白存在比值的测量没有广泛开展,只在特定研究机构进行。而且,虽然目前使用的血清白蛋白定量主要是染料结合法,但由于氧化型与还原型白蛋白的反应差异,所以难以实现精确定量(RyozoMuramoto,临床检查,48(5),537-544,2004)。在一般分析中,标准样品对于确保分析的精确度和精密度很重要。氧化型白蛋白通过如下方法在试管中制备,所用方法包括与具有巯基的化合物如半胱氨酸、谷胱甘肽等反应(GabaldonM.,Arch.Biochem.Biophys.431,178-188,2004)。然而,如上所述,因为该反应是可逆的,所以存在氧化型白蛋白很容易转化为还原型白蛋白的问题。因此,需要用一种长时间保持氧化型与还原型白蛋白恒定比值的标准样品进行高精确度的分析。发明公开本发明者进行了广泛研究,发现通过将样品溶液的pH调节至特定范围、优选以特定范围的比值稀释样品以得到稀释溶液,或者通过用层析法(如亲和层析、凝胶过滤层析等)或超滤等除去低分子化合物,可使白蛋白稳定,这可明显抑制样品溶液内还原型白蛋白的氧化,通过将稳定的溶液直接或者过滤后进行质谱分析或液相层析测定,能够以比常规方法稳定得多的高分析精确度测量白蛋白,从而完成了本发明。因此,本发明的要点如下。[1]分析样品中白蛋白的方法,所述方法包括将样品溶液调节至pH4-9,对所述溶液实施质谱分析或液相层析。[2]上述[l]的方法,其中用緩冲液调节pH。[3]上述[l]的方法,其中样品溶液通过用緩沖液使样品稀释50-100000倍获得。[4]上述[3]的方法,所述方法包括将样品溶液温育0-100小时,调节其pH,对样品溶液实施质谱分析或液相层析。[5]上述[2]-[4]中任一项的方法,其中緩沖液是选自磷酸盐緩冲液、Tris-HCl緩沖液、硼酸盐緩冲液、枸橼酸盐緩沖液、乙酸盐緩冲液、碳酸盐缓沖液、HEPES緩冲液和琥珀酸盐緩冲液的至少一种。[6]上述[l]-[5]中任一项的方法,其中样品是取自受试者的血液或血浆。[7]上述[4]的方法,其中温育温度是4-60。C。[8]上述[l]-[7]中任一项的方法,所述方法包括在质谱分析或液相层析之前进行超滤处理。[9]上述[l]-[8]中任一项的方法,所述方法包括在质谱分析或液相层析之前进行层析纯化。[10]上述[9]的方法,其中层析是选自高效液相层析、反相层析、正相层析、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析的至少一种。[11]上述[1]-[10]中任一项的方法,其中用至少一种选自下列的装置进行质谱测定电喷射离子化飞行时间质谱仪、四极质谱仪、离子阱质谱仪、傅立叶变换离子回旋质谱仪、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪、扇形磁场质谱仪和串联四极质谱仪。[12]上述[l]-[ll]中任一项的方法,所述方法包括分析样品中还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量和/或还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比值。[13]上述[12]的方法,其中样品取自处于至少一种选自下列的状态或者担心处于至少一种选自下列的状态的受试者肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、氧化应激、心脏病和肺病。[14]一种分析血液或血浆的方法,所述血液或血浆取自处于至少一种选自下列的状态或者担心处于至少一种选自下列的状态的受试者肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、氧化应激、心脏病和肺病,所述方法包括用上述[l]-[ll]中任一项的方法分析血液或血浆中还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量和/或还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比值,其中所述血液或血浆取自处于至少一种选自下列的状态或者担心处于至少一种选自下列的状态的受试者肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、氧化应激、心脏病和肺病。[15]—种筛选待测物的方法,所述方法包括用上述[l]-[ll]中任一项的方法测量样品中还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量和/或还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比值,所述样品取自给予或未给予待测物的受试者,将给予待测物得到的量和/或存在比值与未给予待测物得到的量和/或存在比值相比,选择与未给予待测物相比,给予待测物后还原型白蛋白的量和/或存在比值较大的样品。[16]上述[15]的方法,其中待测物是抗氧化剂。[17]—种制备用于精确控制白蛋白定量分析的还原型或氧化型白蛋白标准样品的方法,所述方法包括纯化除去低分子化合物和调节pH。[18]上述[17]的方法,其中白蛋白定量分析是对分析样品中还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量或存在比值的分析。[19]上述[17]或[18]的方法,所述方法包括调节pH至4-9。[20]上述[17]-[19]中任一项的方法,其中pH用至少一种选自下列的緩沖液调节磷酸盐緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸盐緩沖液、枸橼酸盐緩冲液、乙酸盐緩沖液、碳酸盐緩沖液、HEPES緩沖液和琥珀酸盐緩沖液。[21]上述[17]或[18]的方法,其中纯化用超滤或层析进行。[22]—种制备用于精确控制白蛋白定量分析的氧化型白蛋白标准样品的方法,所述方法包括加入半胱氨酸或同型半胱氨酸、通过超滤或层析纯化除去低分子化合物以及调节其pH。[23]上述[22]的方法,其中白蛋白定量分析是对分析样品中还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量或存在比值的分析。[24]上述[22]或[23]的方法,其中pH被调节至4-9。[25]上述[22]-[24]中任一项的方法,其中pH用至少一种选自下列的緩沖液调节磷酸盐緩冲液、Tns-HCl緩冲液、硼酸盐緩冲液、枸橼酸盐緩冲液、乙酸盐緩沖液、碳酸盐緩沖液、HEPES緩冲液和琥珀酸盐緩沖液。[26]—种用于精确控制白蛋白定量分析的还原型或氧化型白蛋白标准样品,所述样品通过上述[17]-[21]中任一项的方法获得。[27]—种用于精确控制白蛋白定量分析的氧化型白蛋白标准样品,所述样品通过上述[22]-[25]中任一项的方法获得。[28]—种用于测定分析样品中还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比值的标准样品,所述标准样品包含其中N-端笫34位游离半胱氨酸残基未被修饰的白蛋白,和其中非白蛋白的巯基化合物通过二硫键与N-端第34位游离半胱氨酸残基键合的白蛋白。[29]上述[28]的标准样品,其中巯基化合物是半胱氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。[30]上述[28]的标准样品,所述标准样品用由血液制备的白蛋白制备。[31]上述[28]的标准样品,所述标准样品用通过重组DNA技术制备的白蛋白制备。[32]上述[28]的标准样品,所述标准样品具有^皮调节至4-9的pH。[33]上述[28]的标准样品,所述标准样品是溶于至少一种选自下列的緩沖液中的溶液磷酸盐緩冲液、Tris-HCl緩冲液、硼酸盐緩冲液、枸橼酸盐緩冲液、乙酸盐緩沖液、碳酸盐緩沖液、HEPES緩冲液和琥珀酸盐緩沖液。[34]上述[28]的标准样品,所述标准样品除了包含其中N-端第34位游离半胱氨酸残基未被修饰的白蛋白之外,基本不含其他巯基化合物。附图简述图1显示实施例1中Alb(red)Q/。值的计算方法。图2显示当来自大鼠的样品溶液^L调节至pH6时,Alb(red)。/。值随时间变化的曲线(实施例1)。图3显示当来自人的样品溶液被调节至各种pH时,AIb(red)%值随时间变化的曲线(实施例1)。图4显示当来自大鼠的样品溶液具有各种稀释率时,Alb(red)%值随时间变化的曲线(实施例1)。图5是显示当来自人的样品溶液具有各种稀释率时,Alb(red)%值随时间变化的曲线(实施例1)。图6显示实施例2的结果。图7是显示实施例3结果的层析图。图8是显示实施例4结果的质谱。从上而下显示的数据是糖尿病模型小鼠的血浆冻融后在37°C温育2小时得到的数据,糖尿病模型,J、鼠的血浆冻融后不温育得到的数据,正常模型d、鼠的血浆冻融后在37。C温育2小时得到的数据,以及正常模型小鼠的血浆冻融后不温育得到的数据。Alb-Cys指添加半胱氨酸的氧化型白蛋白的峰,Alb-GSH指添加谷胱甘肽的氧化型白蛋白的峰,Alb-glc指糖化白蛋白的峰。图9显示实施例5的结果。图IO显示实施例6的结果。图11显示实施例8的结果。图12显示实施例9中HPLC-ESI-TOFMS测量的结果。发明详述本发明的白蛋白分析方法的特征在于在对样品溶液进行质谱分析或液相层析之前将样品溶液调节至pH4-9。更优选将样品溶液调节至pH5.8-6.2。当样品'溶液的pH小于4或大于9时,难以稳定地分析白蛋白,因为样品溶液的制备过程也促使还原型白蛋白氧化为氧化型白蛋白。调节pH的方法实例包括溶解在緩沖液中、添加弱酸性溶液或弱碱性溶液等。其中,优选用緩沖液调节pH,因为可同时进行下文叙述的稀释。使用的緩沖液实例包括常规緩冲液,例如磷酸盐緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸盐緩沖液、枸橼酸盐緩沖液、乙酸盐緩沖液、碳酸盐緩冲液、HEPES盐酸盐緩沖液、琥珀酸盐緩冲液等。特别优选枸橼酸盐緩冲液和磷酸盐緩沖液。本发明特别适用于分析取自受试者的血液或血浆样品。在本发明中,为了监测样品氧化与还原之间的平衡,优选在pH调节或稀释之前,或者超滤或层析处理之前(当应用这些处理时),将血液或血浆样品温育0-100小时,优选2-12小时,以促进还原型白蛋白的氧化反应。这种温育进一步明确样品中还原型白蛋白与氧化型白蛋白的量和/或存在比值的差异,从而能够更方便地监测样品中氧化与还原之间的平衡。温育温度是例如4-60。C,优选25-40。C。作为样品溶液,优选将样品用稀释溶剂稀释50-100000倍得到的溶液。当稀释率小于50倍时,由于低分子化合物与还原型白蛋白的接触频率高,所以还原型白蛋白向氧化型白蛋白的转化率变高。而且在这种情况下,当用緩沖液作为稀释溶液时,緩沖液的pH緩沖能力减弱。另一方面,当稀释率大于100000倍时,白蛋白浓度可能低于装置的检测限度。然而在这种情况下,可通过增加样品的注射量以补偿更大的稀释比来进行检测。稀释溶剂的实例包括緩冲液、水、乙腈、曱醇、甲酸溶液等。如上所述,优选緩冲液,因为还可同时调节pH。緩冲液的实例包括pH调节中示例的那些。其中,特別优选磷酸盐緩冲液。为了抑制白蛋白的氧化反应,优选除去可能包含在样品内的低分子化合物。除去低分子化合物的方法实例包括超滤处理和通过层析纯化,所述层析例如高效液相层析、反相层析、正相层析、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析等。其中,优选通过用具有高白蛋白吸附力的亲和柱的亲和层析纯化。将样品应用于亲和柱,让样品中的白蛋白吸附在柱树脂上。将柱的内部用磷酸盐緩冲液洗涤,同时保留吸附其上的白蛋白,从而除去低分子化合物。完成洗涤后,使具有高盐浓度的磷酸盐緩冲液作为白蛋白洗脱剂流过该柱。结果,使白蛋白从树脂中释放,得到不含低分子化合物的样品。本文中的低分子化合物指分子量不超过2,000、优选不超过1,000、更优选不超过500的化合物。化合物的实例包括氨基酸、有机酸、糖类、脂肪酸、脂类、核酸、核苷酸、核苷、金属离子、甾族化合物、肽等,所述化合物具有不超过上述分子量的分子量。更具体来讲,可包括半胱氨酸、胱氨酸、同型半胱氨酸、同型胱氨酸、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽。当进行超滤时,过滤滤器的孔径通常用截留分子量(molecularweightcut)1000Da-60000Da,优选用具有10000Da-30000Da孔径的滤器。虽然通常在临进行质谱分析或液相层析之前除去低分子化合物,但也可在收集样品(如血液、血浆等)时,用包埋凝胶的收集工具或者包埋pH调节稀释溶剂的收集工具将其预先除去。例如,因为用于纤溶酶原激活剂测定的Biopool的血液收集管(美国专利号5175087)使用枸橼酸盐緩沖液,所以使用该收集管时可在血液样品收集过程中调节pH和稳定白蛋白。此外,优选在质谱测量之前进行层析纯化或使用LC-MS,从而防止出现非白蛋白污染物产生的峰。层析实例包括上述用于除去低分子化合物的实例。其中,优选可容易地与质语分析结合为LC-MS的反相高效液相层析。血液或血浆中的还原型白蛋白高度不稳定。因此,当样品溶液是血液(全血)时,通常不优选低温处理,因为冷冻导致红细胞破坏,红细胞中的血红蛋白影响测定。因此,有利的是在收集血液后立即进行pH调节或稀释,优选接着超滤处理,将血液应用在测定装置上。更优选用pH可调式收集管(如装有调节pH的稀释溶剂的血液收集管)等。当样品溶液是血浆时,可在收集血液后分离血浆,用液氮快速冷冻,低温保存在-70。C或以下。可在低温保存血浆样品之前进行上述pH调节、稀释、超滤和层析。或者,这些操作可在融解低温保存的血浆样品之后而不是保存之前进行。还可以在低温保存之前或收集血液时,用包埋凝胶的收集器具或包埋pH调节稀释溶剂的收集器具预先处理样品。结果,即使在高保存温度下也可长期稳定地保存样品。可用于本发明的质譜-仪实例包括电喷射离子化-飞行时间质谱仪(ESI-TOFMS)、四极质谱仪、离子阱质i普仪、傅立叶变换离子回旋质谱仪、基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)、扇形磁场质谱仪、串联四极质镨仪等。其中,从简单性、高质量分辨能力和高灵敏度方面来看,优选ESI-TOFMS。根据本发明的白蛋白分析方法,可分析样品溶液中还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量和/或还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比值、糖化白蛋白的存在与否、存在的几种氧化型白蛋白的鉴定等。在本发明中,还原型白蛋白指其中N-端第34位游离半胱氨酸残基未被修饰的白蛋白。在本发明中,氧化型白蛋白指其中生物体内非白蛋白的巯基化合物通过二硫键键合在N-端笫34位游离半胱氨酸残基上的白蛋白。通过用本发明的白蛋白分析方法分析取自受试者(该受试者处于或者担心处于至少一种选自肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、氧化应激、心脏病和肺病的状态)的血液或血浆中还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量和/或还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比值,还可确定受试者是否处于选自肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、氧化应激、心脏病和肺病的状态。从中可收集血液或血浆的受试者的实例包括哺乳动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、犬、牛、羊、猴、人等)。已知肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、氧化应激、心脏病、肺病等状态产生氧化应激,它们是导致受试者的氧化与还原平衡紊乱的疾病。也就是说,当受试者处于这些状态时,受试者中氧化型白蛋白相对于氧化型白蛋白和还原型白蛋白总量的比值增大。因此,通过分析氧化型白蛋白的比值,可确定受试者是否患有这些疾病或病症。肝病的实例包括丙型肝炎、乙型肝炎、肝硬化、肝性脑病、原发性胆汁性肝硬化、肝癌等。肾病的实例包括肾衰竭、肾小球肾炎、肾病综合征、肾盂肾炎和痛风肾。脑病的实例包括脑卒中、脑梗塞、肝性脑病、蛛网膜下腔出血等。心脏病的实例包括心绞痛、心肌梗死、心律失常、先天性心脏病等。肺病的实例包括肺炎、肺气肺、哮喘、支气管炎等。通过使用本发明的白蛋白分析方法,还可用还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量和/或还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比值作为指标,筛选待测物。筛选包括用本发明的白蛋白分析方法测量给予或未给予待测物的受试者中还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量和/或还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比值;将给予待测物得到的量和/或存在比值与未给予待测物得到的量和/或存在比值相比;选择与未给予待测物相比,给予待测物后还原型白蛋白的量和/或存在比值较大的受试者。待测物的实例包括各种药物和保健品,例如抗氧化剂、白蛋白结合物质等。本文中的保健品指具有维持或改善健康作用的食品原料和包含所述食品原料的食品。药物的实例包括用于肝病、肾病(特别是肾病综合征)、糖尿病、心脏病和衰老等的预防或治疗药物。此外,保健品的实例包括营养源/营养补充剂,如抗氧化剂、维生素、氨基酸、矿物质、碳水化合物、脂肪酸、酶等。可将与未给予待测物相比,给予待测物后还原型白蛋白的量增加约0.1mg/mL、优选约0.2mg/mL的待测物作为有用的备选药物或保健品。在存在比值方面,可将与未给予待测物相比,给予待测物后还原型白蛋白与总白蛋白的存在比值增加不小于2%、优选不小于3%、更优选不小于5%的待测物作为有用的备选药物或保健品。通过调节pH,并优逸稀释和/或通过超滤和层析除去低分子化合物,用于本发明白蛋白分析方法的样品溶液的预处理方法可明显抑制血液或血浆中白蛋白的氧化反应。结果是,保存管理和运输管理变得容易很多。而且,利用预处理法的本发明的白蛋白分析方法与常规HPLC方法相比,尽可能地抑制白蛋白自然氧化对测量结果的影响,得到稳定的Alb(red"/o值。而且,使用本发明的白蛋白分析方法可实现精确的白蛋白定量,与常规血清白蛋白定量方法不同。在本发明中,用质谱分析或液相层析作为分析方法。特别是,就灵敏度、选择性和检测方法而言,用LC-MS分析更有效。当用质谱分析时,与10常规HPLC方法相比,一次测量最小可以用约0.2nL样品进行测量。此外,因为与液相层析相比,质谱分析通常高度灵敏,所以可充分稀释样品溶液,便于将pH设定在特定范围内和允许较高的稀释率等,从而减少样品溶液中Alb(red)与反应性化合物的接触频率。这里,选择性指Alb(red)和Alb(ox)的选择性。当用质谱分析时,因为其选择性高于液相层析,所以可实现Alb(red)与Alb(ox)的基线分离。而且,当用质谱分析时,因为检测基于m/z值,所以除了Alb(red)%值之外,必要时从质谱上的峰可得到结构信息。白蛋白非常不稳定,随着温育时间的推移,自然氧化导致氧化型白蛋白增加。事实上,当将血浆温育一定时间、调节其pH并稀释得到的样品溶液进行质谱分析或液相层析时,Alb(red)%的变化速度随样品变化。也就是说,白蛋白发挥反映血浆氧化还原状态的探针的作用。一种药物发现方法的途径是以大规模组合合成为中心的探索和研究。本发明的方法由于非常方便,所以可方便和快速筛选药物效果,允许每个样品35分钟的快速测量,能够通过自动注射器自动分析,因为样品不需要在冻融后立即分析。本发明还提供用于精确控制白蛋白定量分析的还原型或氧化型白蛋白标准样品的制备方法,所述方法包括纯化除去低分子化合物和调节pH。在本发明中,白蛋白标准样品指具有稳定的还原型白蛋白与氧化型白蛋白存在比值的白蛋白溶液。在这些白蛋白标准样品中,将溶液中所含还原型白蛋白多于氧化型白蛋白(优选还原型白蛋白和氧化型白蛋白总量中大于50%、更优选不少于70%是还原型白蛋白)的样品称为还原型白蛋白标准样品,将溶液中所含氧化型白蛋白多于还原型白蛋白(优选还原型白蛋白和氧化型白蛋白总量中大于50%、更优选不少于70%是氧化型白蛋白)的样品称为氧化型白蛋白标准样品。本发明还提供用于精确控制白蛋白定量分析的氧化型白蛋白标准样品的制备方法,所述方法包括加入半胱氨酸、同型半胱氨酸或谷通过这些白蛋白标准样品制备方法得到的稳定的白蛋白标准样品也包括在本发明的范围内。具体来讲,上述白蛋白标准样品适用于控制Alb(red)%测量的精确度。pH的调节和低分子化合物的去除如上文关于本发明白蛋白分析方法的叙述。本发明还提供用于测量分析样品中还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比值的标准样品,所述标准样品包含其中N-端第34位游离半胱氨酸残基未被修饰的白蛋白(还原型白蛋白),和其中非白蛋白的巯基化合物通过二硫键键合在N-端第34位游离半胱氨酸残基上的白蛋白。这里,非白蛋白巯基化合物的具体实例包括半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽。上述标准样品优选用血液或者用通过重组DNA技术制备的白蛋白制备。用于制备来自血液的白蛋白的方法无特殊限制,可适当使用本领域通常用于制备来自血液的白蛋白的方法。例如,可述及的方法包括对收集的血液样品进行层析并分离或纯化白蛋白。在这种情况下,标准样品溶液的白蛋白(还原型白蛋白+氧化型白蛋白)浓度优选0.1-50mg/ml。通过重组DNA技术制备白蛋白的方法无特殊限制,可适当使用本领域通常用于通过重组DNA技术制备白蛋白的方法。据报道可将由酵母产生的重组DNA人血清白蛋白作为表达系统(FleerR.等,Biotechnology(NY).1991Oct;9(10):968-75),例如,可使用该文献描述的方法。从还原型与氧化型白蛋白的稳定性方面而言,优选将上述标准样品的pH调节至4-9。优选通过使上述标准样品溶于至少一种选自磷酸盐緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸盐緩沖液、枸橼酸盐緩沖液、乙酸盐緩沖液、碳酸盐緩冲液、HEPES緩冲液和琥珀酸盐緩沖液的緩冲液中得到的溶液。而且,上述标准样品优选不含还原型白蛋白之外的巯基化合物。根据本发明,因为可方便和精确地测量样品溶液中还原型白蛋白与氧化型白蛋白的量和/或存在比值,所以可监测受试者氧化与还原之间的平衡。结果是,可确定受试者是否处于氧化应激状态或者其中氧化型白蛋白增加的肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、心脏病、肺病等。而且根据本发明,可筛选用于预防或治疗肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、氧化应激、心脏病、肺病等的药物。而且,还可筛选将成为保健品的抗氧化剂。而且,给予药物过程中监测氧化应激状态还能够探索已知药物或新药物的适用疾病。以下通过参考实施例详细地解释本发明,不应将这些实施例视为限制性的。实施例1大鼠血浆样品如下制备。将大鼠用乙醚作为吸入麻醉剂麻醉,收集血液。通过离心将所得血液立即分离得到血浆。然后,将血浆部分置于另一个试管中,用液氮冷冻,低温保存在-80。C备用。将已在-80。C低温保存的上述正常大鼠血浆样品在水浴上融解,用50mMNaH2P04/Na2HP04(pH6.0)将样品稀释100倍,用HPLC-ESI-TOFMS分析。人血浆样品如下制备。将人受试者的血液收集入装有肝素的真空血液收集管内,转移至聚丙烯管中进行离心。使其在4。C以3000rpm离心20分钟,将所得上清液部分作为血浆成分使用。用连接高效液相层析装置(HPLC:UltimatePlusCapillary/NanoLCSystem,DionexCorporation,USA)和电喷射-离子化飞行时间质谱仪(ESI-TOFMS:microTOF,BRUKERDaltonicsInc.,USA)的系统进行HPLC-ESI-TOFMS。HPLC装置由微自动注射器(FAMOS)、分裂系统的微流量泵(Ultimate)和装载切换阀的泵(Switchos)三个模块组成。用截留(trap)柱(MonoCap浓缩柱GLScienceInc.,内径0.2mm,长度150mm)和分离柱(MonoCapforFast-flow:内径0.2mm,长度50mm)分离和浓缩样品中的白蛋白。HPLC的洗脱剂是溶液(A)[添加甲酸(lmL)的乙腈/水(Milli-Q)(25:75v/v,1L)混合物]和溶液(B)[添加曱酸(lmL)的乙腈/水(Milli-Q)(90:10v/v,1L)混合物]。将自动注射器的样品架设定为4°C,连续冷却样品瓶。将截留柱用流速为0.05mL/min的流动溶液(A)平4軒,将分离柱用流速为(15^L/min,泵i殳定流速0.125mL/min,分流^各的实际流速15|uL/min)的流动溶液(B)平衡。将经过稀释和过滤处理的上述溶液置于管形瓶中,放在样品架上,开始测定。将样品注射的体积设定为2)liL,在开始测定0分钟-10分钟期间从Swichos中以0.05mL/min送出溶液(A),在此期间样品中的盐和污染成分穿过截留柱,白蛋白被截留柱吸附,从而完成脱盐和浓缩。开始测定后10分钟-15分钟,通过切^换阀改变流^",以形成连接截留柱与分离柱的流路。此时,通过以15|uL/min流速乂人Ultimate中输送溶液(B),使吸附在截留柱上的白蛋白转移至分离柱,并保留在分离柱内。开始测量后15分钟-35分钟,再次改变流路,以形成截留柱和分离柱的单独流路,在此期间以15pL/min流速从Ultimate输送溶液(B),其中粗略地分离含白蛋白的其它污染成分。另一方面,开始测量后15分钟-25分钟,以0.07|LiL/min流速从Switchos输送溶液(B),从而洗脱保留在截留柱中的残留物质。开始测量后25分钟-35分钟,以0.07jiL/min流速从Switchos输送溶液(A),从而用溶液(A)使截留柱初始化。将从分离柱洗脱的白蛋白在高效液相层析与质镨仪界面的电喷射离子源部分离子化,用质语仪检测。对所有质谱进行其中已经优化离子化和离子检测参数的方法。质谱仪的质量检测范围设定在m/z50-3000,检测带多价正离子电荷的白蛋白。离子化参数条件为下列数值。终板偏置-500V,毛细管-5000V,Neblizer气:0.4Bar,干气5.0L/min,干温200°C。控制质谱仪的软件用microTOFControl检测离子化白蛋白。优化条件是毛细管出口150-250V,撇沫板l:50-100V,六极器l:24-36V,撇沫板2:25-35V,六极器2:18-24V,六极器RF:500-800V,转移时间30-50fis,预脉冲贮存20-40|us,透镜1贮存30-60V,透镜1提取18-24V,透镜2:-15至+15V,透镜3:-70至-10V,透镜4:-15至+15V,透镜5:-60至+20V,检测器1400-1600V,滚动平均3,总数20000,推拉式脉冲发生器380-400V,校正器填充40-50V,校正器提取800-1000V,飞行管9000V,反射器1300V和TOF4佥测器1800-2000V。关于数据分析,用质谱仪数据分析软件microTOFData分析。通过电喷射法离子化的白蛋白形成多价离子,检测为多峰(图1(1》。关于质谱,在平滑处理(Gauss算法m/z宽度二0.1,周期=1)和基线处理后,用重叠合功能确定相同电荷的峰。检测分别显示相同电荷的两个峰,将m/z较小的那些峰视为Alb(red),m/z较高的那些峰视为Alb(ox)(图1(2))。在m/zlK0-:U10范围检测到的峰来自带多价电荷的白蛋白(46+至53+)。从峰强度(高度),确定各价的Alb(red)。/Q-(Alb(red)峰强度(高度)/(Alb(red)峰强度(高度)+Alb(ox)峰强度(高度)》x100,计算平均值。因为Alb(red)在样品中的比例由于自然氧化反应而下降,所以Alb(red)。/o值容易随时间推移而下降。因此,用緩冲液将血浆样品稀释100倍,过滤,以控制样品的pH。至于大鼠血浆,当用50mM磷酸盐緩冲液(pH6.0)作为稀释溶液时,虽然观察到一些下降趋势,但在处理后24小时仍可获得稳定的Alb(red)。/。值(图2)。至于人血浆,在扩大的pH范围进行Alb(red)的稳定性测试。所用稀释缓冲液是50mM乙酸盐緩冲液(pH3.0,pH4.0和pH5.0)、50mM磷酸盐緩沖液(pH6.0,pH7.0和pH8.0)和0.1M碳酸盐緩冲液(pH9.0和pH10.0)。确认在酸性区域的pH适用范围。结果是,虽然在pH3.0质谱上观察不到来自白蛋白的信号,但在pH4.0-pH7.0的范围,即使在置于样品架上48小时后仍可获得稳定的Alb(red)o/。值(图3(1))。同样,确认在碱性区域的适用范围。结果是,在pH6.0-pH9.0的范围内,即使在置于样品架上24小时后仍可获得稳定的Alb(red)。/。值。然而,确认在pH10.0随着静置时间的推移,Alb(red)。/。值呈增加趋势(图3(2))。由此证实,通过应用pH4.0-pH9.0的稀释緩沖液,可稳定测量人血浆的Alb(red)%。因为用本发明方法处理的样品溶液即使在置于样品架上24小时后仍可显示稳定的Alb(red)。/。值,所以使通过自动注射器自动测量成为可能。此外,还研究了当用50mM磷酸盐緩沖液(pH6.0)将稀释率改变为10倍、20倍、50倍和100倍时,稀释率对Alb(red)。/。的影响。在大鼠血浆的情况下,即使在稀释.过滤处理24小时后,以100倍稀释率处理仍得到稳定的Alb(red)。/。值。但是,在稀释率为10倍、220倍和50倍时,确认在置于样品架上2小时后Alb(red)。/。值下降,并且这种趋势随着时间推移而增长(图4)。在人血浆的情况下,即使在稀释.过滤处理24小时后,以50倍或IOO倍稀释率处理仍得到稳定的Alb(red)。/。值。但是,在稀释率为10倍和20倍时,确认在置于样品架上3小时后Alb(red)。/。值下降,随后该值进一步下降,6小时后达到接近恒定值(图5)。实施例2测量肝病模型大鼠的血浆样品,所述模型通过反复给予四氯化碳制备。通过每周两次将(lmL/kg)等量四氯化碳(CCI4)和橄榄油的混合物皮下给予SD大鼠制备诱发了肝病的模型大鼠。开始给予CCU后每月在乙醚麻醉的状态下从锁骨下静脉收集血液(lmL)。同时,采集对照组正常大鼠的血液样品。将收集的血液立即置于冰浴中,在l小时内离心以分离血浆。将分离的血浆立即用液氮冷冻,保存在-80。C。测量之前将保存的样品融解,按照以下(1)或(2)的描述处理。计算正常大鼠和肝病模型大鼠(开始给予CCU后22周)血浆样品的Alb(red)。/。值。(1)冻融后,立即将样品用50mM磷酸盐緩冲液(pH6.0)稀释100倍。然后,将溶液置于管形瓶内,放在设定温度为4°C的自动进样器上,用HPLC-ESI-TOFMS分析。(2)冻融后,将血浆在37。C温育2小时。温育完成后,按照类似于(l)冻融后的处理进行处理。按照实施例1的相同方法进行HPLC-ESI-TOFMS和计算Alb(red)%值。按照(l)处理,正常大鼠的Alb(red)。/。值是(80.8士U),肝病模型大鼠的Alb(red)Q/。值是(82.8士2.3)。另一方面,按照(2)处理,正常大鼠的Alb(red)。/。值是(65.2士3.7),肝病模型大鼠的Alb(red)。/o值是(54.2士5.6)(表1和图6)。表1.通过改变预处理方法造成的正常大鼠和给予CC14大鼠的Alb(red)y。值的波动<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>按照(l)处理,正常组与肝病模型组之间无显著差异。然而,按照(2)处理时,正常大鼠组与肝病模型大鼠组之间存在显著差异(p0.05),因此,用Alb(red)yo可方便地监测肝病症状。实施例3在上述实施例中,用液相层析-质谱仪(LC-ESI-TOFMS)分析Alb(red)%。然而,在本实施例中将高效液相层析(HPLC)单独用作分析仪。用AKTAexplorer10S(GEHealthcare(以前称为AmershamBiosciencesAB),Sweden)系统进行高效液相层析(HPLC)。用含0.15M硫酸钠的30mM磷酸盐緩冲液(pH6.85)作为HPLC洗脱剂,流速为0.8mL/min。用ShodexAsahipakGS-5207E作为分离柱。通过UV检测(检测波长280nm)监测测量信号。将低温保存在-80。C的正常大鼠血浆样品在水浴中融解,用50mM磷酸盐緩冲液(pH6.0)稀释5倍。将5倍稀释的样品立即应用在HPLC装置中,对在室温下预温育处理2小时的5倍稀释的样品进行分析。结果是,约10.5分钟时在层析图上观察到得自还原型白蛋白的峰。因为预温育处理之前和之后层析案无改变,所以确认通过用pH6.0的緩冲液使大鼠血浆中的白蛋白稳定(图7)。实施例4通过引入肥胖症基因Ay制备比KK小鼠更早和更严重表达肥胖症和高血糖症的<2型糖尿病模型>,改良KK-Ay小鼠。KK-Ay小鼠是<并发模型>,通过将Ay基因引入KK小鼠制备,特征是比KK小鼠更早(7-8周龄)和更严重表达肥胖症和高血糖症。用KK-Ay小鼠(CLEAJapan,Inc.)作为遗传性自发糖尿病模型小鼠,测量血浆样品中的Alb(red)Q/。值。将收集自正常小鼠或糖尿病冲莫型小鼠的血液立即置于水浴中,在1小时内离心制备血浆样品。将血浆样品立即用液氮冷冻,保存在-80。C。将保存的样品按照以下(1)或(2)的描述处理,然后计算正常小鼠和糖尿病小鼠血浆样品的Alb(red)。/。值。(1)冻融后,立即将样品用50mM磷酸盐緩冲液(pH6.0)稀释100倍。然后,将溶液置于管形瓶内,放在设定温度为4°C的自动进样器上,用HPLC-ESI-TOFMS分析。(2)冻融后,将血浆在37。C温育2小时。温育完成后,按照类似于(l)冻融后的处理进行处理。按照实施例1的相同方法进行HPLC-ESI-TOFMS和计算Alb(red)%值。按照(l)处理,正常小鼠的Alb(red)。/o值是80.3。/。,糖尿病^^莫型小鼠的Alb(red)。/。值是80."/。。另一方面,按照(2)处理,正常小鼠的Alb(red)Q/。值是(72.4士0.8),糖尿病模型小鼠的Alb(red)。/。值是(68.9±1.7)。由此证实,预温育处理使各样品的Alb(red)。/。之间存在显著差异。而且,除了还原型白蛋白和氧化型白蛋白之外,还确认了得自糖化白蛋白的峰(图8)。糖化白蛋白在总白蛋白中的比例在正常小鼠为9.9%,糖尿病小鼠为13.9%。因此,在糖尿病小鼠中观察到更大量的糖化白蛋白。实施例5将野生型大鼠(Sparague-Dawley或F344大鼠,雄性,CLEAJapan,Inc.)的血浆用50mM磷酸盐緩沖液(pH6.0)稀释。用0.45|im滤器过滤处理后,将溶液应用于用50mM磷酸盐緩冲液平衡的亲和层析BlueHP柱上。血浆中的白蛋白保留在柱树脂中,其它污染成分穿过柱或者被洗涤除去。最后,将吸附在柱上的白蛋白用含1.5M氯化钾的50mM磷酸盐緩冲液(pH6.0)洗脱,然后在37。C温育处理2小时。按照实施例1的相同方式测量此时Alb(red)。/。的改变,比较经BlueHP柱处理的样品与未处理样品的结果(图9)。结果是,用BlueHP柱处理的样品Alb(red)。/。改变较小。由此证实,因为亲和层析除去了样品中的污染成分,所以可实现Alb(red)的稳定化。实施例6上述数据涉及血浆分离后的稳定性。在本实施例中,在更适合临床检验的状态下检测收集血液中Alb(red)的稳定性。<样品处理〉将收集自健康志愿者0SH3)的血液按照下列任何一种方法处理l)添加肝素,2)添加1/9血液量的0.5M枸橼酸钠緩冲液(pH4.3),和3)添加9倍血液量的75mM磷酸钠緩冲液(pH6),保存在水箱(4。C)中。在刚处理后和处理后3、6、24、30和48小时,取出一定量的各种处理血液,离心得到血浆成分。收集后立即将血浆用液氮冷冻,保存在冷冻机(-80。C)中。<测量方法>将处理的血液l)和2)用稀释溶液(50mM磷酸钠緩沖液,pH6.0)稀释100倍,将处理的血液3)用相同稀释溶液稀释10倍,按照实施例1描述的HPLC-ESI-TOFMS计算氧化型白蛋白比值和还原型白蛋白比值。<测量结果〉计算还原型白蛋白比值(Alb(red)。/。)的残留率。关于处理的血液1),随着保存时间的推移残留率降低,48小时后为95%。另一方面,关于处理血液2)和3),保存48小时后残留率为100-101%,无波动(图10)。因此证实通过调节pH或稀释可抑制还原型白蛋白比值的波动。实施例7按照实施例6的相同方式用HPLC方法检测从收集到测定的血液样品中还原型白蛋白的稳定性。<才羊品处理>从健康志愿者中收集血液0Sh5,样品1-5),向其内加入1/10收集血液量的O.5M枸橼酸钠緩沖液(pH4.3),将混合物保存在冰箱0。C)内。在刚处理后以及处理后24和72小时,取出一定量的各种处理血液,离心得到血浆成分。<测量方法>将血浆用50mM磷酸钠緩沖液(pH6.0)稀释50倍,作为HPLC样品使用。HPLC条件柱ES-502N7,6mmi.d.x100mmDEAE-form(Shodex)柱温350C溶剂A:50mM乙酸钠-400mM硫酸钠(pH4.85)溶剂B:乙醇梯度A/B=100/0—5min—100/0—25min—95/5—5min—100/0—5min—画O流速1.0mL/min检测荧光激发280nm发射340nm样品注射体积20<测量结果>还原型白蛋白比值(HPLC法)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>还原型白蛋白比值的残留率(HPLC法)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>保存72小时后还原型白蛋白比值的残留率为99.4-100.4%,与刚处理后相比无波动。从这些结果中,可确认血液样品收集后长达72小时还原型白蛋白的稳定性,从而确保可能将分析样品从医院运输至分析实验室。实施例8在本实施例中,用固相提取作为层析确认除去血浆的低分子化合物后样品的稳定性。<冲羊品处理>将收集自健康志愿者的血液0SH3,A-C)用l)添加肝素或者2)添加1/9血液量的0.5M枸橼酸钠緩沖液(pH4.3)的方法处理,离心得到血浆成分。<固相提取>1.将50mM磷酸钠緩冲液(pH6.0,l兆0uL)加入血浆(20iiL)中。2.活化和平衡固相提取柱(BondElut-C18EWP200mg/3cc)。用含0.1%甲酸的90%乙腈(2mL)活化,用水(lmL)平衡。3.将1的样品应用在2的固相提取柱上。4.将该柱用含0.1%曱酸的10。/。乙腈(2mL)洗涤,将白蛋白用含0.1%曱酸的90%乙腈(1mL)洗脱。5.将4的洗脱液直接用作测量样品。<ESI-TOFMS测量条件>使洗脱剂(含0.1%甲酸的90%乙腈)以15|uL/min流速流动,根据流动-注射方法用自动进样器将测量样品(lpL)注入ESI-TOFMS内。测量的MS条件与实施例1中描述的HPLC-ESI-TOFMS的MS部分相同。<测量结果>根据上文,处理人血液得到血浆,然后对其进行固相提取得到样品。在用于ESI-TOFMS测量的自动进样器中检测其稳定性。在测量当天、第1天和第2天测量还原型白蛋白比值的残留率(%),在下表显示。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>处理血液1)和2)在自动进样器上2天都是稳定的。因此,不管血液收集方法如何,通过固相提取然后层析,可在分析前使血液样品稳定地维持2天。从结果可清楚看到,通过层析除去血浆中的低分子化合物可抑制氧化型白蛋白的形成,能够稳定地分析。本实施例结果可确保本发明分析方法的稳定性。而且,假定实际的血液收集在医院等中进行,根据固相提取方法可确认血浆保存稳定性。<才羊品处理>将收集自健康志愿者0SN3)的血液用下述任一种方法处理l)添加肝素或者2)添加1/9血液量的0.5M枸橼酸钠缓沖液(pH4.3),离心得到血浆成分。在血浆刚分离后、冰箱内保存1天后和冰箱内保存2天后,将所得血浆按照同上的方法进行固相提取,然后进行ESI-TOFMS测量。<测量结果(图11)>计算还原型白蛋白比值(Alb(red)%)的残留率。关于处理的血液1),残留率随着保存时间推移而下降,2天后变成92-94%。另一方面,关于处理的血液2)和3),保存2天后残留率为100-101%,与刚处理后相比无波动。从这些结果可确认由于进行了pH调节处理,所以冷藏2天后还原型白蛋白保持稳定。而且,其中将固相提取与ESI-MS组合的流动-注射方法可大幅缩短测量时间,因为MS测量时间不超过5分钟。实施例9在本实施例中,描述还原型或氧化型白蛋白标准样品的制备方法。将血液从健康志愿者中收集,通过血浆分离得到血浆样品。按照实施例5显示的操作对样品进行亲和层析纯化白蛋白。将纯化的洗脱液用含1.5M氯化钾的50mM磷酸盐緩冲液(pH6.0)稀释至4mg/mL(用作还原型白蛋白标准样品)。向该溶液内,加入任何一种下列含疏基低分子化合物半胱氨酸、其氧化物胱氨酸、同型半胱氨酸、其氧化物同型胱氨酸、还原型谷胱甘肽及其氧化物氧化型谷胱甘肽,得到氧化型白蛋白标准样品。作为生物体内存在的氧化型白蛋白,分别如下制备添加半胱氨酸的白蛋白、添加同型半胱氨酸的白蛋白和添加谷胱甘肽的白蛋白3种。制备添加半胱氨酸的白蛋白时,使4mg/mL纯化的白蛋白溶液(120mL)与0.6mM半胱氨酸(由SigmaLtd.制造)水溶液(12mL)和0.6mM胱氨酸(由SigmaLtd.制造)水溶液(108mL)混合。制备添加同型半胱氨酸的白蛋白时,使4mg/mL纯化的白蛋白溶液(120mL)与3mM同型半胱氨酸(由SigmaLtd.制造)水溶液(8mL)和3mM同型胱氨酸(由SigmaLtd.制造)水溶液(72mL)混合。制备添加谷胱甘肽的白蛋白时,使4mg/mL纯化的白蛋白溶液(120mL)与3mM还原型谷胱甘肽(由WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造)水溶液(8mL)和3mM氧化型谷胱甘肽(由WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造)水溶液(72mL)混合。将每种制备的溶液分开,置于几个Falcon管(50cc大小)内,用氩气充溢这些管。将管在37。C温育箱中静置(水平放置)48小时。反应完成后,除去过量的含巯基低分子化合物及其氧化物,用MicroconYM-30(500|aL大小由MILLIPORE制造)通过超滤浓缩溶液。将溶液以2000rpm离心,用含0.9w/v。/。氯化钠的50mM磷酸盐緩冲液(pH7.3)交换緩沖液。将(l)浓缩白蛋白溶液、(2)除去滤液和(3)填充含0.9w/v。/。氯化钠的50mM磷酸盐緩沖液(pH7.3)的步骤(l)-(3)重复15次或以上,以除去所制备溶液中的含巯基低分子化合物及其氧化物。按照实施例1的描述,通过HPLC-ESI-TOFMS测量确定由本制备方法得到的氧化型白蛋白标准样品(3种)中还原型或氧化型白蛋白的纯度(%)(还原型或氧化型白蛋白相对子还原型白蛋白和氧化型白蛋白总量的比例)(图12)。结果是,添加半胱氨酸的白蛋白(图12[B〗)、添加同型半胱氨酸的白蛋白(图12[C])和添加谷胱甘肽的白蛋白(图12[D])中氧化型白蛋白的纯度分别是950/。、96%和65%。另一方面,还原型白蛋白在还原型白蛋白标准样品中的纯度(图12[A])是78%。在4°C、-20°C和-80。C保存后评估按照上述方法制备的还原型白蛋白标准溶液和各种氧化型白蛋白标准样品的稳定性。定期取样,用实施例1描述的HPLC-ESI-TOFMS测量纯度的改变。还原型白蛋白与氧化型白蛋白标准样品的保存稳定性(纯度改变率%)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>结果是,在所有温度下氧化型白蛋白标准样品的纯度几乎无改变,从而显示氧化型白蛋白标准样品的保存稳定性。此外,根据实施例7描述的HPLC法和用制备的标准样品分析白蛋白。还原型白蛋白、添加半胱氨酸的白蛋白,添加谷胱甘肽的白蛋白纯度的分析值与通过更高精确度的ESI-TOFMS测量的值非常相符。因此,通过使用本发明的白蛋白标准样品可确保HPLC法的分析精确度。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>工业适用性根据本发明,因为可以高灵敏度地方便地测量还原型/氧化型白蛋白以及糖化蛋白成分的量和存在比值,所以可提供有用的生物化学研究、疾病诊断和药物筛选的方法。具体来讲,因为可以高灵敏度地方便地测量还原型/氧化型白蛋白和糖化蛋白成分的存在比值,所以可优选分析与氧化应激有关的各种疾病,例如肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、氧化应激、心脏病、肺病等。虽然上文已经详细描述了本发明的一些实施方案,但是可以在基本不脱离本
发明内容和优点的情况下对显示的具体实施方案进行各种修改和变更。这样的修改和变更包括在本发明的精神和范围内,如附属权利要求的阐述。本申请以在日本提交的专利申请号2005-217993为基础,其内容通过本次引用全部结合到本文中。权利要求1.一种分析样品中白蛋白的方法,所述方法包括将样品溶液调节至pH4-9,对溶液进行质谱分析或液相层析。2.权利要求1的方法,其中pH用緩沖液调节。3.权利要求l的方法,其中样品溶液通过用緩冲液使样品稀释50-100000倍获得。4.权利要求3的方法,所述方法包括将样品溶液温育0-100小时,调节其pH,对稀释的样品溶液进行质谱分析或液相层析。5.权利要求2-4中任一项的方法,其中緩冲液是选自磷酸盐緩冲液、Tris-HCl緩沖液、硼酸盐緩冲液、枸橼酸盐緩冲液、乙酸盐緩沖液、碳酸盐緩沖液、HEPES緩沖液和琥珀酸盐緩沖液的至少一种。6.权利要求1-5中任一项的方法,其中样品是取自受试者的血液或血浆。7.权利要求4的方法,其中所述温育温度是4-60。C。8.权利要求1-7中任一项的方法,所述方法包括在质镨分析或液相层析之前进行超滤处理。9.权利要求1-8中任一项的方法,所述方法包括在质谱分析或液相层析之前通过层析纯化。10.权利要求9的方法,其中层析是选自高效液相层析、反相层析、正相层析、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析的至少一种。11.权利要求1-10中任一项的方法,其中质谱用至少一种选自电喷射离子化飞行时间质谱仪、四极质谱仪、离子阱质谱仪、傅立叶变换离子回旋质谱仪、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪、扇形f兹场质谱仪和串联四极质谱4义的装置进行。12.权利要求l-ll中任一项的方法,所述方法包括分析样品中还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量和/或还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比。13.权利要求12的方法,其中样品取自处于至少一种选自下列的状态或者担心处于至少一种选自下列的状态的受试者肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、氧化应激、心脏病和肺病。14.一种分析血液或血浆的方法,所述血液或血浆取自处于至少一种选自下列的状态或者担心处于至少一种选自下列的状态的受试者肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、氧化应激、心脏病和肺病,所述方法包括用权利要求1-11中任一项的方法分析血液或血浆中还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量和/或还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比,所述血液或血浆取自处于至少一种选自下列的状态或者担心处于至少一种选自下列的状态的受试者肝病、肾病、糖尿病、风湿病、脑病、疲劳、衰老、氧化应激、心脏病和肺病。15.—种筛选待测物的方法,所迷方法包括用权利要求1-11中任一项的方法测量样品中还原型白蛋白和氧化型白蛋白的量和/或还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比,所述样品取自给予或未给予待测物的受试者,将给予待测物得到的量和/或存在比与未给予待测物得到的量和/或存在比相比,选择与未给予待测物相比,给予待测物后还原型白蛋白的量和/或存在比较大的样品。16.权利要求15的方法,其中待测物是抗氧化剂。17.—种制备用于精确控制白蛋白定量分析的还原型或氧化型白蛋白标准样品的方法,所迷方法包括纯化除去低分子化合物和调节pH。18.权利要求17的方法,其中白蛋白定量分析是对分析样品中还原型白蛋白与氧化型白蛋白的量或存在比的分析。19.权利要求17或18的方法,所述方法包括调节pH至4-9。20.权利要求17-19中任一项的方法,其中pH用至少一种选自下列的缓冲液调节磷酸盐緩沖液、Tris-HCl緩冲液、硼酸盐緩沖液、枸橼酸盐緩冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸盐緩冲液、HEPES緩沖液和琥珀酸盐緩冲液。21.权利要求17或18的方法,其中纯化用超滤或层析进行。22.—种制备用于精确控制白蛋白定量分析的氧化型白蛋白标准样品的方法,所述方法包括加入半胱氨酸或同型半胱氨酸、通过超滤或层析纯化除去低分子化合物以及调节其pH。23.权利要求22的方法,其中白蛋白定量分析是对分析样品中还原型白蛋白与氧化型白蛋白的量或存在比的分析。24.权利要求22或23的方法,其中pH^f皮调节至4-9。25.权利要求22-24中任一项的方法,其中pH用至少一种选自下列的緩沖液调节磷酸盐緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸盐緩冲液、枸橼酸盐緩沖液、乙酸盐緩冲液、碳酸盐緩冲液、HEPES緩沖液和琥珀酸盐緩冲液。26.—种用于精确控制白蛋白定量分析的还原型或氧化型白蛋白标准样品,所述样品通过权利要求17-21中任一项的方法获得。27.—种用于精确控制白蛋白定量分析的氧化型白蛋白标准样品,所述样品通过权利要求22-25中任一项的方法获得。28.—种用于测定分析样品中还原型白蛋白与氧化型白蛋白的存在比的标准样品,所述标准样品包含其中N-端第34位游离半胱氨酸残基未被修饰的白蛋白,和其中非白蛋白的巯基化合物通过二硫键键合在N-端第34位游离半胱氨酸残基上的白蛋白。29.权利要求28的标准样品,其中所迷巯基化合物是半胱氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。30.权利要求28的标准样品,所述标准样品用由血液制备的白蛋白制备。31.权利要求28的标准样品,所述标准样品用通过重组DNA技术制备的白蛋白制备。32.权利要求28的标准样品,所述标准样品具有被调节至4-9的pH。33.权利要求28的标准样品,所述标准样品是溶于至少一种选自下列的緩沖液中的溶液磷酸盐緩冲液、Tris-HCl緩冲液、硼酸盐緩冲液、枸橼酸盐緩冲液、乙酸盐緩沖液、碳酸盐緩冲液、HEPES緩冲液和琥珀酸盐緩冲液。34.权利要求28的标准样品,所述标准样品除了其中N-端第34位游离半胱氨酸残基未被修饰的白蛋白之外,不含其他巯基化合物。全文摘要本发明提供分析样品溶液中白蛋白的方法,所述方法的特征在于在质谱分析或液相层析之前对样品溶液的预处理方法,还提供精确和稳定地分析样品溶液中氧化型白蛋白和还原型白蛋白的量及其存在比值的方法,以及用于精确控制白蛋白定量分析的白蛋白标准样品。文档编号G01N27/62GK101273267SQ20068003534公开日2008年9月24日申请日期2006年7月27日优先权日2005年7月27日发明者中山聪,山田尚之,河上麻美,洼田和幸,竹鼻健司申请人:味之素株式会社
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1