专利名称：一种调控苹果实生树阶段转变的方法
技术领域：
本发明涉及一种调控苹果实生树阶段转变的方法，具体涉及一种利用生理标记辅助调控 苹果实生树阶段转变的方法。
技术背景果树实生树从播种到结果需要几年甚至十几年时间，这是提高果树育种工作效率的技术 瓶颈。果树等木本被子植物的个体发育过程分为童期、成年营养生长期和生殖生长期。实生 树表现童性，不具备成花能力的发育阶段称为童期；实生树虽然具备了成花潜能，但在自然 条件下不能成花，接受某种诱导后可以成花，而且之后即使不再实施这种诱导也能连续成花 的发育阶段称为成年营养生长期；而实生树在自然条件下连续开花结果的阶段称为生殖生长 期。为提高果树育种效率，将实生树从播种到自然条件下连续开花结果所需的时间縮到最 短， 一直是果树育种工作者追求的目标。苹果、桃等多年生木本果树的育种理论上，要縮短 实生树开花结果所需的时间，前期需要采取促进营养生长的技术措施，使其快速通过童期， 而实生树进入成年营养生长期之后则应采取抑制营养生长的技术措施，以降低成花节位，提 早开花结果，从而縮短育种周期。縮短成年营养生长期是指通过采取有效措施降低实生树成花节位。目前还没有专用的降 低果树实生树成花节位的方法，实践中一般采用与促花有关的技术措施，包括低温、生长调 节剂、嫁接、扦插、环剥、环割、绞缢、限根、断根等等。这方面的研究报道很多，许多促 花的技术可以显著提高果树实生树成花率，但并非所有促花措施都能有效地降低实生树的成 花节位。育种实践中成年营养生长期从何时何处起始，到何时何处结束至今尚不清楚，限制了育 种效率的提高。因此，准确确定实生树童性的消失，进入成年营养生长期的临界点，对于提 高果树育种效率十分重要，而且，即使找到了某实生树在某特定条件下成年营养生长期的起 始的临界节位，其在不同杂交组合、不同自然条件下也不能通用，所以，只有找到合适的生 理生化标记辅助，适时对实生树采取适宜的调控措施，才能达到上述目的。关于苹果及其他木本植物阶段转变的生理标记尚无相关专利，相关论文报道如下甜樱桃组培苗中有一种28千道尔顿蛋白质可做童性标记，童期高于成年期[1'2'3]。这种蛋白质在苹 果等植物上也有，也是组培苗返童和生根能力的标记。但关于实生树阶段转变的调控技术尚 无相关专利报道。 发明内容本发明提供一种调控苹果实生树阶段转变的方法，该方法縮短实生树开花结果所需的时 间，实生树进入成年营养生长期之后抑制营养生长，以降低成花节位，提早开花结果，从而 缩短育种周期。为实现上述目的，本发明是采用以下技术方案来实现的一种调控苹果实生树阶段转变的方法，连续测定不同节位采样中所含多酚中的根皮苷、 杨梅苷、咖啡酸的含量，对其进行分析，确定实生树阶段转变开始与结束的临界点，对实生 树采取调控措施，其具体步骤如下1) 采样① 苹果实生幼树于春季从根颈部选留1个萌蘖，8-9月份采样时，剪取此选留萌蘖，再从 树干中部剪取1个旺盛生长的基部节位与选留萌蘖的梢端节位重叠5-10节的新梢；从实生树 的基部起随节位升高，每5节为1采样单元，取30株实生树，分别取其相同节位采样单元混 合，重复1次；② 自来水清洗所述采样单元后分别取叶片、芽、韧皮部，用纱布包好投入液氮中待测；2) 采用高效液相色谱法分别测定采样叶片、芽、韧皮部中的根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的 含量，利用外标法定性，采用高效液相色谱条件色谱柱为C18反相柱，柱温3(TC，流动相 中的水、冰乙酸、甲醇的体积比为52: 5: 43，流速0.7毫升/分，紫外检测器，检测波长280纳米，所述根皮苷、杨梅苷、咖啡酸标样购自Sigma公司，乙酸、丙酮为国产分析纯， 甲醇为国产色谱纯，水为双蒸水。3) 实生树阶段转变的确定根据上述不同节位采样中根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的连续测定结果进行分析，① 从基部向上，如果某节位芽采样中开始检测到了根皮苷，或者韧皮部采样中检测不到 咖啡酸，即可判定为实生树在该节位开始阶段转变，进入成年营养生长期，即可实施实生树 阶段转变调控② 如果从某节位开始韧皮部采样中检测不到杨梅苷，或者叶片采样中检测不到咖啡酸， 则可以判定为实生树在该节位完成阶段转变，进入生殖生长期。4) 实生树阶段转变的调控苹果实生树阶段转变开始，进入了成年营养生长期，并且在处于成年营养生长期节位内具有侧生分枝，实施阶段转变调控，调控措施为下一年的6月中旬-7月中旬整株喷施2-3次 植物生长调节剂，所述植物生长调节剂可选用40-60毫克/千克水的6-卞氨基腺嘌呤和 800-1200毫克/千克水的乙烯利或整株喷施2-3次0.5-1.5毫克/千克水的激动素和200-300毫克 /千克水的烯效唑，前后2次喷施间隔5-10天。 本发明具有以下优点(1) 本发明采用实生树生理生化指标分析的取样方法，用实生树基生萌蘖与旺盛新梢接 力的办法实现整株所有节位连续取样；30株实生树相同节位混合采样，消除实生树基因型间 的差异；5节为1个采样单位，既消除取样误差，又减少工作量。(2) 本发明在不同节位连续取样的基础上，分析生理生化指标随节位升高的动态变化， 确定成年营养生长期开始和结束的临界点，用多种生长调节剂组合同时对实生树进行促花处 理，调査最低始花节位，使所得结果更准确、更可靠。(3) 利用本发明所提供的方法，苹果实生树接受调控提前完成阶段转变，翌年可以在阶 段转变开始的节位之上，阶段转变结束节位之下大量开花结果。如果不实施调控处理，开花 结果的节位不低于阶段转变结束的节位。(4) 本发明与常规技术相比，苹果实生树播种后第2年通过童期，第4年实施阶段转变 调控，第5年开花结果，第7年完成杂种初选；较常规技术提早3年，节省育种成本30%。
图1是采样中所含根皮苷含量随节位上升的动态变化图； 图2是采样中所含杨梅苷含量随节位上升的动态变化图； 图3是采样中所含咖啡酸含量随节位上升的动态变化图。
具体实施方式
一种调控苹果实生树阶段转变的方法，根据不同节位采样中所含多酚中的根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的含量，连续测定对其进行分析，确定实生树阶段转变开始与结束的临界点，对实生树采取调控措施，其具体步骤如下实施例11)采样①昌黎果树所于2003年采样监测2年生金冠自然实生群体，9月中旬采样测定，剪取选 留萌蘖，再从树干中部剪取1个旺盛生长的基部节位与选留萌蘖的梢端节位重叠IO节的新梢； 从实生树的基部起随节位升高，每5节为1采样单元，每选取30株实生树，分别取其相同节位采样单元混合，重复1次共选取60株；②自来水清洗所述采样单元后分别取叶片、芽、韧皮部，用纱布包好投入液氮中待测；2) 测定采样叶片、芽、韧皮部中的多酚中的根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的含量，利用外标法定性，采用高效液相色谱的条件色谱柱C18反相柱，柱温3(TC,流动相中的水、冰乙酸、甲醇的 体积比为52: 5: 43，流速0.7毫升/分，紫外检测器，检测波长280纳米，所述根皮苷、杨 梅苷、咖啡酸标样购自Sigma公司，乙酸、丙酮为国产分析纯，甲醇为国产色谱纯，水为双 蒸水。其步骤如下-① 冷冻采样经冷冻干燥机干燥24小时，研成细粉，过40目筛；② 称取100毫克细样粉，加入5毫升石油醚，3(TC提取24小时，8000转/分离心10分 钟，弃上清液，沉淀中加入5毫升石油醚洗涤一次，以8000转/分离心10分钟；沉淀在30°C 避光条件下挥发去石油醚，加入2毫升体积百分比浓度80%的丙酮，超声波处理30分钟，以 8000转/分离心IO分钟;③ 取②所得上清液500微升，离心干燥机中干燥1小时45分钟，加入500微升纯甲醇， 涡旋溶解，12000转/分离心10分钟；④ 取③所得上清液200微升，加入800微升流动相稀释，过0.45微米的滤膜，-20"冰箱 中冷冻保存，取10微升用高效液相色谱测定根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的含量。3) 实生树阶段转变的确定根据图l、图2、图3连续测定的结果进行分析，实生树76-80节及以上节位芽样品中检 测到了根皮苷，并且韧皮部样品中检测不到咖啡酸，因此判定为实生树在76-80节开始阶段 转变，进入成年营养生长期。实生树120节完成阶段转变，进入生殖生长期。4) 阶段转变的调控2004年6月25日、7月5日和7月15日分3次整株喷施0.5毫克/千克水的激动素(KT30) 和300毫克/千克水的烯效唑。 实施例2步骤1)——3)同实施例1，其中，从树干中部剪取的新梢与选留萌蘖的梢端节位重叠6节；4)阶段转变的调控2004年6月28日、7月3日和7月8日分3次整株喷施1毫克/千克水的激动素(KT30)和250毫克/千克水的烯效唑。 实施例3步骤1)——3)同实施例1其中，从树干中部剪取的新梢与选留萌蘖的梢端节位重叠8节；4)实生树阶段转变的调控2004年6月28日、7月8日分2次整株喷施1.5毫克/千克水的激动素(KT30)和200 毫克/千克水的烯效唑。实施例41) 采样① 昌黎果树所于2004年采样监测2年生金冠自然实生群体，8月中旬采样测定，剪取选 留萌蘖，再从树干中部剪取1个旺盛生长的基部节位与选留萌蘖的梢端节位重叠5节的新梢； 从实生树的基部起随节位升高，每5节为1釆样单元，每选取30株实生树，分别取其相同节 位采样单元混合，重复1次共选取60株；② 自来水清洗所述采样单元后分别取叶片、芽、韧皮部，用纱布包好投入液氮中待测；2) 测定采样叶片、芽、韧皮部中的多酚中的根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的含量，利用外标法定性， 采用高效液相色谱的条件同实施例1。3) 实生树阶段转变的确定根据上述不同节位采样中根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的连续测定结果进行分析，① 从基部向上，如果某节位芽采样中开始检测到了根皮苷，即可判定为实生树在该节位 开始阶段转变，进入成年营养生长期，即可实施实生树阶段转变调控② 如果从某节位开始韧皮部采样中检测不到杨梅苷，则可以判定为实生树在该节位完成 阶段转变，进入生殖生长期。4) 实生树阶段转变的调控-2005年6月28日、7月8日分2次整株喷施40毫克/千克水的6-卞氨基腺嘌呤和1200 毫克/千克水的乙烯利。 实施例5步骤l)——2)同实施例4，其中，从树干中部剪取的新梢与选留萌蘖的梢端节位重叠5节；3)实生树阶段转变的确定根据上述不同节位采样中根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的连续测定结果进行分析，① 从基部向上，如果某节位韧皮部采样中检测不到咖啡酸，即可判定为实生树在该节位 开始阶段转变，进入成年营养生长期，即可实施实生树阶段转变调控② 如果从某节位开始叶片采样中检测不到咖啡酸，则可以判定为实生树在该节位完成阶 段转变，进入生殖生长期。4)实生树阶段转变的调控2005年6月25日、7月4日禾B7月10日分3次整株喷施60毫克/千克水的6-卞氨基腺 嘌呤和800毫克/千克水的乙烯利。 实施例6步骤l)——2)同实施例4，其中，从树干中部剪取的新梢与选留萌蘖的梢端节位重叠9节3) 实生树阶段转变的确定根据上述不同节位采样中根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的连续测定结果进行分析，① 从基部向上，如果某节位芽采样中开始检测到了根皮苷，即可判定为实生树在该节位 开始阶段转变，进入成年营养生长期，即可实施实生树阶段转变调控② 如果从某节位开始叶片采样中检测不到咖啡酸，则可以判定为实生树在该节位完成阶 段转变，进入生殖生长期。4) 实生树阶段转变的调控2005年6月25日、7月4日分2次整株喷施50毫克/千克水的6-卞氨基腺嘌呤和1000 毫克/千克水的乙烯利。lj Hammatt， N.， Molecular and genetic regulation of juvenility and adventitious rooting, NERC Tree Biotechnology Liaison Group Newsletter, 1992Besford， R.T" Hand, P" Peppitt， S.D.， Richardson, C.M. and Thomas, B.， Phase change in /Vwwm arv/謂differences between juvenile and mature shoots identified by 2-dimensional protein separation and / vifra translation of mRNA. J. Plant Physi. 1996， 147: 534-538.3Hand, P" Besford, R.T" Richardson, C.M.， and Peppitt， S.D., Antibodies to phase related proteins in juvenile and mature尸n/w w "v/歸.Plant Growth Regulation. 1996， 20: 25-29
权利要求
1. 一种调控苹果实生树阶段转变的方法，其特征在于，连续测定不同节位采样中所含多酚中的根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的含量，对其进行分析，确定实生树阶段转变开始与结束的临界点，对实生树采取调控措施，其具体步骤如下1)采样①苹果实生幼树于春季从根颈部选留1个萌蘖，8-9月份采样时，剪取此选留萌蘖，再从树干中部剪取1个旺盛生长的基部节位与选留萌蘖的梢端节位重叠5-10节的新梢；从实生树的基部起随节位升高，每5节为1采样单元，取30株实生树，分别取其相同节位采样单元混合，重复1次；②自来水清洗所述采样单元后分别取叶片、芽、韧皮部，用纱布包好投入液氮中待测；2)采用高效液相色谱法分别测定采样叶片、芽、韧皮部中的根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的含量；3)实生树阶段转变的确定根据上述不同节位采样中根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的连续测定结果进行分析，①从基部向上，如果某节位芽采样中开始检测到了根皮苷，或者韧皮部采样中检测不到咖啡酸，即可判定为实生树在该节位开始阶段转变，进入成年营养生长期；②如果从某节位开始韧皮部采样中检测不到杨梅苷，或者叶片采样中检测不到咖啡酸，则可以判定为实生树在该节位完成阶段转变，进入生殖生长期；4)实生树阶段转变的调控苹果实生树阶段转变开始，进入了成年营养生长期，并且在处于成年营养生长期节位内具有侧生分枝，实施阶段转变调控，调控措施为下一年的6月中旬-7月中旬整株喷施2-3次植物生长调节剂，前后2次喷施间隔5-10天。
全文摘要
本发明涉及一种调控苹果实生树阶段转变的方法，连续测定不同节位的采样中所含多酚中的根皮苷、杨梅苷、咖啡酸的含量，对其进行分析，确定实生树阶段转变开始与结束的临界点，对实生树采取调控措施，抑制营养生长，以降低成花节位，提早开花结果，从而缩短育种周期。苹果实生树播种后第2年通过童期，第4年实施阶段转变调控，第5年开花结果，第7年完成杂种初选，较常规技术提早3年，节省育种成本30％。
文档编号G01N30/02GK101228837SQ200710002558
公开日2008年7月30日 申请日期2007年1月26日 优先权日2007年1月26日
发明者常瑞丰, 张新忠, 李春敏, 王广鹏, 赵永波, 陈东玫 申请人:河北省农林科学院昌黎果树研究所