专利名称：一种调控桃实生树阶段转变的方法
技术领域：
本发明属于一种桃的育种的方法，具体涉及一种利用生理标记辅助调控桃实生树阶段转 变的方法。
技术背景果树实生树从播种到结果需要几年甚至十几年时间，这是提高果树育种工作效率的技术 瓶颈。果树等木本被子植物的个体发育过程分为童期、成年营养生长期和生殖生长期。实生 树表现童性，不具备成花能力的发育阶段称为童期；实生树虽然具备了成花潜能，但在自然 条件下不能成花，接受某种诱导后可以成花，而且之后即使不再实施这种诱导也能连续成花 的发育阶段称为成年营养生长期；而实生树在自然条件下连续开花结果的阶段称为生殖生长 期。为提高果树育种效率，将实生树从播种到自然条件下连续开花结果所需的时间縮到最 短， 一直是果树育种工作者追求的目标。苹果、桃等多年生木本果树的育种理论上，要縮短 实生树开花结果所需的时间，前期需要采取促进营养生长的技术措施，使其快速通过童期， 而实生树进入成年营养生长期之后则应采取抑制营养生长的技术措施，以降低成花节位，提 早开花结果，从而縮短育种周期。缩短成年营养生长期是指通过采取有效措施降低实生树成花节位。目前还没有专用的降 低果树实生树成花节位的方法，实践中一般采用与促花有关的技术措施，包括低温、生长调 节剂、嫁接、扦插、环剥、环割、绞缢、限根、断根等等。这方面的研究报道很多，许多促 花的技术可以显著提高果树实生树成花率，但并非所有促花措施都能有效地降低实生树的成 花节位。育种实践中成年营养生长期从何时何处起始，到何时何处结束至今尚不清楚，限制了育 种效率的提高。因此，准确确定实生树童性的消失，进入成年营养生长期的临界点，对于提高果树育种效率十分重要，而且，即使找到了某实生树在某特定条件下成年营养生长期的起 始的临界节位，其在不同杂交组合、不同自然条件下也不能通用，所以，只有找到合适的生 理生化标记辅助，适时对实生树采取适宜的调控措施，才能达到上述目的。关于桃及其他木本植物阶段转变的生理标记尚无相关专利，相关论文报道如下桃童期叶片和成年期叶片在光和能力、淀粉、蔗糖、甘露醇含量上都有区别或许可作为桃实生树童 性的标记[1]。桃成熟区茎尖较童区茎尖玉米素含量高，分布广泛，可作为桃实生树童性消失 的标记[1]。但关于实生树阶段转变的调控技术尚无相关专利报道。 发明内容本发明提供一种调控桃实生树阶段转变的方法，该方法縮短实生树开花结果所需的时间， 实生树进入成年营养生长期之后抑制营养生长，以降低成花节位，提早开花结果，从而縮短 育种周期。为实现上述目的，本发明是采用以下技术方案来实现的一种调控桃实生树阶段转变的方法，连续测定不同节位采样中所含内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异戊烯基腺嘌呤iP、玉米素ZT的含量，对其进行分析，确定实生树阶段 转变开始与结束的临界点，对实生树采取调控措施，其具体步骤如下1) 采样① 桃实生幼树于春季从根颈部选留1个萌蘖，8-9月份采样，剪取此选留萌蘖，从实生树 的基部起随节位升高，每5节为1采样单元，取30株实生树，分别取其相同节位采样单元混 合，重复1次，置冰盒中带回；② 自来水清洗后取下韧皮部，用纱布包好投入液氮中待测；2) 采用高效液相色谱法测定韧皮部采样中所含内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、 异戊烯基腺嘌呤iP、玉米素ZT的含量，其中，采用高效液相色谱的条件是，色谱柱为C18 反相柱，流动相中的甲醇与0.5%乙酸的体积比为45 : 55，流速0.8毫升/分钟，紫外检测器， 检测波长为252纳米，采用外标法定性，峰面积标准曲线法定量。其测定步骤如下① 采样经冷冻干燥机干燥20-26小时，研成细粉，过35-45目筛；② 取0.3-0.7克冻干样粉，加入含有0.8-1.2毫摩尔2,6-二叔丁基对甲苯酚的2-3毫升的4 。C100。/。乙腈，25-35。C条件下超声波浴25-35分钟，冰浴浸提10-15小时，4'C条件下 10000-12000转/分离心8-12分钟；③ 取1-2毫升②所得的上清液，25-35。C条件下干燥，用0.8-1.2毫升pH 8.0的0.4摩尔/ 升的磷酸缓冲液重新溶解，每次加入0.4-0.6毫升的三氯甲垸萃取3-5次，直至有机相无色， 水相用15-25微升的1.5-2.5摩尔/升的NaOH调pH至8.0,加入70-90毫克的不溶性的聚乙 烯聚吡咯烷酮(PVPP)，涡旋15-25秒后，4'C条件下10000-12000转/分离心8-12分钟；④ 取l-2毫升③所得的上清液，用45-60微升的纯甲酸调pH至3.0，每次加入0.4-0.6毫升的乙酸乙酯，萃取2-5次，合并酯相，25-35。C条件下千燥，用0.15-0.3毫升流动相溶解， 过0.45微米的微孔滤膜后，取10-20微升用高效液相色谱测定内源激素中的脱落酸ABA、赤 霉素GA、异戊烯基腺嘌呤iP、玉米素ZT的含量。3) 实生树阶段转变的确定根据上述不同节位采样中内源激素含量的连续测定结果进行分析，① 随节位升高，实生树某节位韧皮部采样中玉米素ZT、异戊烯基腺嘌呤iP、赤霉素GA 含量骤然升高，且脱落酸ABA含量突然降低，即可判定为实生树该节位已经进入成年营养生 长期，开始阶段转变，即可实施阶段转变的调控；② 随着节位继续升高，当实生树某节位韧皮部采样中玉米素ZT、异戊烯基腺嘌呤iP、赤 霉素GA含量从高水平骤然恢复到低水平，则可以判定为实生树在该节位已经完成阶段转变， 进入生殖生长期，无需再实施阶段转变调控措施；4) 实生树阶段转变的调控所述阶段转变调控的调控措施为下一年的6月底-7月初整株喷施2-3次植物生长调节剂， 此植物生长调节剂选用125毫克/千克水的烯效唑，每2次喷施间隔5-10天。 本发明具有以下优点(1) 本发明采用实生树生理生化指标分析的取样方法，用实生树基生萌蘖与旺盛新梢接 力的办法实现整株所有节位连续取样；30株实生树相同节位混合采样，消除实生树基因型间 的差异；5节为1个采样单位，既消除取样误差，又减少工作量。(2) 本发明在不同节位连续取样的基础上，分析生理生化指标随节位升高的动态变化， 确定成年营养生长期开始和结束的临界点，用多种生长调节剂组合同时对实生树进行促花处 理，调査最低始花节位，使所得结果更准确、更可靠。(3) 利用本发明所提供的方法，桃实生树接受调控提前完成阶段转变，翌年可以在阶段 转变开始的节位之上，阶段转变结束节位之下大量开花结果。如果不实施调控处理，开花结 果的节位不低于阶段转变结束的节位。(4) 本发明与常规技术相比，桃实生树播种当年即通过童期，第2年实施阶段转变调控， 第3年大量开花结果，第5年完成杂种初选；较常规技术提早l年，节省育种成本16.7%。
图1是随节位升高，采样韧皮部中玉米素ZT含量的动态变化图；图2是随节位升高，采样韧皮部中异戊烯基腺嘌呤iP含量的动态变化图；图3是随节位升高，采样韧皮部中赤霉素GA含量的动态变化图；图4是随节位升高，采样韧皮部中脱落酸ABA含量的动态变化图。
具体实施方式
一种调控桃实生树阶段转变的方法，连续测定不同节位采样中所含内源激素中的脱落酸 ABA、赤霉素GA、异戊烯基腺嘌呤iP、玉米素ZT的含量，对其进行分析，确定实生树阶段 转变开始与结束的临界点，对实生树采取调控措施，其具体步骤如下 实施例11) 采样① 昌黎果树所于2003年采样监测大久保、燕红2个当年生自然实生群体，桃实生幼树于 春季从根颈部选留1个萌蘖，9月15日采样，剪取此选留萌蘖，从实生树的基部起随节位升 高，每5节为1采样单元，取30株实生树，分别取其相同节位采样单元混合，重复l次共选 取60株，置冰盒中带回；② 自来水清洗后取下韧皮部，用纱布包好投入液氮中待测；2) 测定采用高效液相色谱法测定韧皮部采样中所含内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异 戊烯基腺嘌呤iP、玉米素ZT的含量，所述高效液相色谱的条件是，色谱柱为C18反相柱， 流动相中的甲醇与0.5%乙酸的体积比为45 : 55，流速0.8毫升/分钟，紫外检测器，检测波长 为252纳米，采用外标法定性，峰面积标准曲线法定量。其步骤如下-① 采样经冷冻干燥机干燥20小时，研成细粉，过45目筛；② 取0.3克冻干样粉，加入含有0.8毫摩尔2,6-二叔丁基对甲苯酚的2毫升的4匸100%乙 腈，25r条件下超声波浴35分钟，冰浴浸提15小时，4'C条件下10000转/分离心12分钟；③ 取1毫升②所得的上清液，25'C条件下干燥，用0.8毫升pH 8.0的0.4摩尔/升的磷酸 缓冲液重新溶解，每次加入0.4毫升的三氯甲烷萃取3次，直至有机相无色，水相用15微升 的2.5摩尔/升的NaOH调pH至8.0，加入70毫克的不溶性的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，涡 旋25秒后，4X:条件下10000转/分离心12分钟； 取1毫升③所得的上清液，用60微升的纯甲酸调pH至3.0，每次加入0.4毫升的乙酸 乙酯，萃取3次，合并酯相，25'C条件下干燥，用0.15毫升流动相溶解，过0.45微米的微孔 滤膜后，取10微升用高效液相色谱测定内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异戊烯基腺 嘌呤iP、玉米素ZT的含量；3) 实生树阶段转变的确定根据图1、图2、图3、图4连续测定的结果进行分析，发现实生树60节及以上节位韧 皮部样品中玉米素、异戊烯基腺嘌呤、赤霉素含量骤然升高，且脱落酸含量突然降低，判定 为实生树60节已经进入成年营养生长期，开始阶段转变。到80节完成阶段转变。4)阶段转变的调控-2004年6月28日、7月7日分2次整株喷施125毫克/千克水烯效唑。2005年春季调查，2群体最低成花节位平均68节，成花株率分别为85.41%和68.26%，成花节率分别为47.01%和17.86%。实施例21) 采样2003年8月20日采样，步骤同实施例l;2) 测定采样中内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异戊烯基腺嘌呤iP、玉米素ZT 的含量，其步骤如下① 采样经冷冻千燥机干燥26小时，研成细粉，过35目筛；② 取0.7克冻干样粉，加入含有0.8毫摩尔2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)的3毫升的4°C 100%乙腈，35。C下超声波浴25分钟，冰浴浸提15小时，4'C条件下12000转/分离心8分钟；③ 取2毫升②所得的上清液，35'C条件下干燥，用0.8毫升pH 8.0的0.4摩尔/升的磷酸 缓冲液重新溶解，每次加入0.6毫升的三氯甲垸萃取5次，直至有机相无色，水相用25微升 的1.5摩尔/升的NaOH调pH至8.0，加入90毫克的不溶性的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，涡 旋25秒后，4'C条件下12000转/分离心8分钟；④ 取2毫升③所得的上清液，用60微升的纯甲酸调pH至3.0，每次加入0.6毫升的乙酸 乙酯，萃取5次，合并酯相，35'C条件下干燥，用0.15毫升流动相溶解，过0.45微米的微 孔滤膜后，取20微升用高效液相色谱测定内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异戊烯基 腺嘌呤iP、玉米素ZT的含量；所述高效液相色谱的条件同实施例1 。3) 实生树阶段转变的确定根据上述不同节位采样中内源激素含量的连续测定结果进行分析，① 随节位升高，实生树某节位韧皮部采样中玉米素ZT、异戊烯基腺嘌呤iP、赤霉素GA 含量骤然升高，且脱落酸ABA含量突然降低，即可判定为实生树该节位己经进入成年营养生 长期，开始阶段转变；② 随着节位继续升高，当实生树某节位韧皮部采样中玉米素ZT、异戊烯基腺嘌呤iP、赤 霉素GA含量从高水平骤然恢复到低水平，则可以判定为实生树在该节位已经完成阶段转变， 进入生殖生长期；4)实生树阶段转变的调控2004年6月30日、7月7日分2次整株喷施125毫克/千克 水烯效唑。 实施例31) 采样2003年8月30日采样，步骤同实施例l;2) 测定采样中内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异戊烯基腺嘌呤iP、玉米素ZT 的含量，其步骤如下① 采样经冷冻干燥机干燥22小时，研成细粉，过38目筛；② 取0.4克冻干样粉，加入含有0.9毫摩尔2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)的2.5毫升的4 。Cl00。/。乙腈，28'C下超声波浴29分钟，冰浴浸提ll小时，4。C下11000转/分离心10分钟；③ 取1.4毫升②所得的上清液，28'C条件下干燥，用0.9毫升pH 8.0的0.4摩尔/升的磷 酸缓冲液重新溶解，每次加入0.5毫升的三氯甲垸萃取3次，直至有机相无色，水相用18微 升的1.8摩尔/升的NaOH调pH至8.0，加入75毫克的不溶性的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)， 涡旋18秒后，4'C条件下11000转/分离心9分钟； 取1.4毫升③所得的上清液，用48微升的纯甲酸调pH至3.0，每次加入0.45毫升的 乙酸乙酯，萃取3次，合并酯相，28t:条件下干燥，用0.18毫升流动相溶解，过0.45微米的 微孔滤膜后，取10微升用高效液相色谱测定内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异戊烯 基腺嘌呤iP、玉米素ZT的含量；所述高效液相色谱的条件同实施例1 。3) 实生树阶段转变的确定同实施例2;4) 实生树阶段转变的调控2004年6月29日、7月5日、7月10日分3次整株喷施125 毫克/千克水烯效唑。实施例41) 采样2003年9月10日采样，步骤同实施例l;2) 测定采样中内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异戊烯基腺嘌呤iP、玉米素ZT 的含量，其步骤如下① 采样经冷冻干燥机干燥24小时，研成细粉，过40目筛；② 取0.5克冻干样粉，加入含有1毫摩尔2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)的2.3毫升的4'C 100%乙腈，30。C下超声波浴30分钟，冰浴浸提12小时，4'C条件下10000转/分离心10分钟；③ 取1.5毫升②所得的上清液，3(TC条件下千燥，用l毫升pH8.0的0.4摩尔/升的磷酸 缓冲液重新溶解，每次加入0.5毫升的三氯甲烷萃取4次，直至有机相无色，水相用20微升 的2摩尔/升的NaOH调pH至8.0，加入80毫克的不溶性的聚乙烯聚吡咯垸酮(PVPP)，涡旋20秒后，4'C条件下10000转/分离心10分钟；④取1.5毫升③所得的上清液，用50微升的纯甲酸调pH至3.0，每次加入0.5毫升的乙 酸乙酯，萃取3次，合并酯相，30。C条件下干燥，用0.2毫升流动相溶解，过0.45微米的微 孔滤膜后，取15微升用高效液相色谱测定内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异戊烯基 腺嘌呤iP、玉米素ZT的含量；所述高效液相色谱的条件同实施例1 。3) 实生树阶段转变的确定同实施例2;4) 实生树阶段转变的调控2004年6月25日、7月1日、7月5日分3次整株喷施125 毫克/千克水烯效唑。实施例51) 采样2003年9月12日采样，步骤同实施例l;2) 测定采样中内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异戊烯基腺嘌呤iP、玉米素ZT 的含量，其步骤如下-① 采样样品经冷冻干燥机干燥25小时，研成细粉，过40目筛；② 取0.6克冻干样粉，加入含有1.1毫摩尔2，6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)的2.8毫升的4 t;iOO。/。乙腈，32'C下超声波浴33分钟，冰浴浸提12小时，4'C下12000转/分离心11分钟；③ 取1.8毫升②所得的上清液，32'C条件下干燥，用1.1毫升pH 8.0的0.4摩尔/升的磷 酸缓冲液重新溶解，每次加入0.55毫升的三氯甲垸萃取4次，直至有机相无色，水相用22 微升的2.2摩尔/升的NaOH调pH至8.0，加入85毫克的不溶性的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)， 涡旋22秒后，4"C条件下以11000转/分离心11分钟；④ 取1.8毫升③所得的上清液，用55微升的纯甲酸调pH至3.0，每次加入0.55毫升的 乙酸乙酯，萃取4次，合并酯相，35r条件下干燥，用0.25毫升流动相溶解，过0.45微米的 微孔滤膜后，取15微升用高效液相色谱测定内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异戊烯 基腺嘌呤iP、玉米素ZT的含量；所述高效液相色谱的条件同实施例1。3) 实生树阶段转变的确定同实施例2;4) 实生树阶段转变的调控2004年6月30日、7月10日分2次整株喷施125毫克/千 克水烯效唑。[1] Bitonti， M. B" Cozza， R.， Chiappetta, A.， Giannino， D" Castiglione， M. R.， Dewitte， W.， Mariotti， D.， Onckelen， H. V. and Innocenti， A. M.， Distinct nuclear organization, DNA methylation pattern and cytokinin distribution mark juvenile, juvenile-like and adult vegetative apical meristems in peach (/Vm"m戸w'ca (L.) Batsch), J. Exp. Bot" 2002， 53, 1047-105权利要求
1. 一种调控桃实生树阶段转变的方法，其特征在于，连续测定不同节位采样中所含内源激素中的脱落酸、赤霉素、异戊烯基腺嘌呤、玉米素的含量，对其进行分析，确定实生树阶段转变开始与结束的临界点，对实生树采取调控措施，其具体步骤如下1)采样①桃实生幼树于春季从根颈部选留1个萌蘖，8-9月份采样，剪取此选留萌蘖，从实生树的基部起随节位升高，每5节为1采样单元，取30株实生树，分别取其相同节位采样单元混合，重复1次，置冰盒中带回；②自来水清洗后取下韧皮部，用纱布包好投入液氮中待测；2)采用高效液相色谱法测定韧皮部采样中内源激素中的脱落酸、赤霉素、异戊烯基腺嘌呤、玉米素的含量；3)实生树阶段转变的确定根据上述不同节位采样中内源激素含量的连续测定结果进行分析，①随节位升高，实生树某节位韧皮部采样中玉米素、异戊烯基腺嘌呤、赤霉素含量骤然升高，且脱落酸含量突然降低，即可判定为实生树该节位已经进入成年营养生长期，开始阶段转变；②随着节位继续升高，当实生树某节位韧皮部采样中玉米素、异戊烯基腺嘌呤、赤霉素含量从高水平骤然恢复到低水平，则可以判定为实生树在该节位已经完成阶段转变，进入生殖生长期；4)实生树阶段转变的调控实生树节位进入了成年营养生长期，即可实施阶段转变调控，调控措施为下一年的6月底-7月初整株喷施2-3次植物生长调节剂，每2次喷施间隔5-10天。
2、 根据权利要求1所述的一种调控桃实生树阶段转变的方法，其特征在于，采用高效液 相色谱的条件是，色谱柱为C18反相柱，流动相中的甲醇与0.5%乙酸的体积比为45 : 55， 流速0.8毫升/分钟，紫外检测器，检测波长为252纳米，其测定步骤如下① 采样经冷冻干燥机干燥20-26小时，研成细粉，过35-45目筛；② 取0.3-0.7克冻干样粉，加入含有0.8-1.2毫摩尔2,6-二叔丁基对甲苯酚的2-3毫升的4 。C100。/。乙腈，25-35。C条件下超声波浴25-35分钟，冰浴浸提10-15小时，4'C条件下 10000-12000转/分离心8-12分钟；③取1-2毫升②所得的上清液，25-35。C条件下干燥，用0.8-1.2毫升pH 8.0的0.4摩尔/ 升的磷酸缓冲液重新溶解，每次加入0.4-0.6毫升的三氯甲垸萃取3-5次，直至有机相无色， 水相用15-25微升的1.5-2.5摩尔/升的NaOH调pH至8.0，加入70-90毫克的不溶性的聚乙 烯聚吡咯烷酮，涡旋15-25秒后，4X:条件下10000-12000转/分离心8-12分钟； 取1-2毫升③所得的上清液，用45-60微升的纯甲酸调pH至3.0,每次加入0.4-0.6毫 升的乙酸乙酯，萃取2-5次，合并酯相，25-35"条件下干燥，用0.15-0.3毫升流动相溶解， 过0.45微米的微孔滤膜后，取10-20微升用高效液相色谱测定内源激素中的脱落酸、赤霉素、 异戊烯基腺嘌呤、玉米素的含量。
全文摘要
本发明涉及一种调控桃实生树阶段转变的方法，连续测定不同节位采样中所含内源激素中的脱落酸ABA、赤霉素GA、异戊烯基腺嘌呤iP、玉米素ZT的含量，对其进行分析，确定实生树阶段转变开始与结束的临界点，对实生树采取调控措施，抑制营养生长，以降低成花节位，提早开花结果，从而缩短育种周期。桃实生树播种当年即通过童期，第2年实施阶段转变调控，第3年大量开花结果，第5年完成杂种初选，较常规技术提早1年，节省育种成本16.7％。
文档编号G01N33/00GK101228838SQ200710002559
公开日2008年7月30日 申请日期2007年1月26日 优先权日2007年1月26日
发明者俎文芳, 刘国俭, 常瑞丰, 张新忠, 李春敏, 王广鹏 申请人:河北省农林科学院昌黎果树研究所