专利名称：一种用于蛋白质样品富集及与毛细管电泳分析联用的方法
技术领域：
本发明涉及低丰度蛋白质样品富集与检测方法，具体地说是一种用于 蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联用的方法。
背景技术：
毛细管电泳现在已经成为一种常规的分离方法，在化学、生物学等领 域应用广泛。但是由于毛细管的光程短，所以毛细管电泳的检测灵敏度较 低。尽管采用激光诱导荧光检测可以降低毛细管电泳的检测限，但是蛋白 质的荧光标记过程繁琐，而且仪器价格昂贵。因此，发展用于蛋白质样品 富集与毛细管电泳分析联用的方法，对于提高毛细管电泳的检测灵敏度是 非常必要的。
目前，已报道了多种毛细管电泳的样品富集方法。其中场放大进样
(FASS)[1，2]是基于样品缓冲液和电泳缓冲溶液电导率的差异而产生的样 品区带压縮。但是，当样品缓冲液的电导率高于电泳缓冲液时，样品则无 法通过场放大进样富集。等速电泳(ITP)是将样品区带夹在前导缓冲液与 尾随缓冲液之间的一种样品富集方法[3， 4]。但是，ITP不能同时对阳离子 与阴离子进行富集与分离。此外，还有等电聚焦[5]、基于半通透性中空纤 维膜的电堆积[6]和基于刻蚀毛细管的电堆积[7]等方法。 Burgi， D.S. ， Chien， R. L. Anal. Chem. 1992， 64， 1046-1050. Burgi, D.S. Anal. Chem. 1993， 65， 3726-3729. Krivankova, L. ; Gebauer， P. ; Bocek, P, J. Chromatogr, A1995, 716, 35-48. Foret， F. ; Szoko， E. ; Karger， B. L Electrophoresis, 1993， 14， 417-428. Hjerten， S. ; Liao， J. L. : Zhang, R. J. Chromatogr. A 1994， 676， 409-420. Wu， X. Z. ; Hosaka， A. ; Hobo， T.. Anal. Chem. 1998， 70, 2081-2084. Wei W. ， Edward, S. Y. ， Anal. Chem. 2002， 74, 3899-3905.
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于蛋白质样品富集及与毛细管电泳分析 联用的方法。利用此方法可以对低浓度蛋白质样品进行富集，并通过毛细 作用的进样方法实现样品富集与毛细管电泳分离分析的联用。
一种用于蛋白质样品富集及与毛细管电泳分析联用的方法，其特征在 于所述的用于蛋白质样品富集及与毛细管电泳分析联用的方法，包括蛋白 质样品的富集(图l， A)、富集后样品的推出(图l， B)、分离毛细管在毛 细作用下进样(图1， C)和毛细管电泳分析(图1， D);
联用系统包括恒流泵(A0)、膜接口(A1)、聚四氟乙烯管(A2)、硅橡胶 (A3)和分离毛细管(A4);用于蛋白质样品富集的膜接口 (图l， Al;图2) 包括连接毛细管(1)、中空纤维膜(2)、盛装缓冲液的离心管(3)、固定 毛细管的聚四氟乙烯管(4)以及加入与取出缓冲液的开口 (5);
富集样品时，先将膜接口(A1)的中空纤维膜与连接毛细管(1)中充满 样品，再将膜接口(A1)出口端的连接毛细管(1)用硅橡胶堵死，最后使用恒流泵将样品不断推入到膜接口 (Al)中；由于蛋白质大分子无法透过中空 纤维膜(2)而达到富集效果；富集结束后，取下硅橡胶(A3),用恒流泵将 富集后的样品从膜接口(A1)中推出，样品进入到聚四氟乙烯管中；将毛细 管(1)插入到聚四氟乙烯管(4)，样品在毛细作用下进入毛细管(1)的 进样端；进样结束后，将毛细管(1)两端插入到缓冲液中，施加电压，进
行电泳。
按照权利要求1所述的用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联用的
方法，其特征在于所述恒流泵(A0)的流量为0. 5-2. 5pL/min。
按照权利要求1所述的用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联用的 方法，其特征在于所述的膜接口(A1)的中空纤维膜(2)为醋酸纤维素膜， 内径为100 400nm，截留分子量为3000 8000Da，有效长度为2cm-4cm。
按照权利要求1所述的用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联用的 方法，其特征在于所述的膜接口(A1)的连接毛细管(1)内径与外径要与 醋酸纤维素膜内径相匹配，以保证毛细管(1)可以穿入膜中。
按照权利要求1所述的用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联用的 方法，其特征在于所述的聚四氟乙烯管(A2)的内径接近连接毛细管(1) 的外径，聚四氟乙烯管(A2)与毛细管(1)为密封连接。
按照权利要求1所述一种用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联用 的方法，其特征在于所述硅橡胶(A3)也能是其他的能够提供较高反压的 材料，如毛细管聚合物整体柱，或者毛细管硅胶整体柱，或者毛细管填充 柱等等。
按照权利要求1所述的用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联用的方法，其特征在于所述的分离毛细管的内径为50或者75um。。 本发明采用的技术方案为
使用具有一定截留分子量的中空纤维膜，利用小分子可以自由通过， 而大分子蛋白质被截留的原理来实现蛋白质的富集。在富集时，膜接口的 出口端用硅橡胶堵死，并用恒流泵将样品不断推入到膜接口中进行富集。 膜接口制作时，使用环氧树脂胶将毛细管与中空纤维膜的连接处密封，可 避免在富集过程中样品通过毛细管与中空纤维膜的接口处漏出。富集结束 后，取下硅橡胶用恒流泵将富集后的样品从膜接口中推入聚四氟乙烯管中。 将分离毛细管插入聚四氟乙烯管中，利用毛细作用将聚四氟乙烯管中的样 品转移到分离毛细管的进样端。进样结束后，将分离毛细管两端插入到缓 冲液中，施加电压，进行电泳分离。
具体方法包括蛋白质样品的富集(图1， A)，富集后样品的推出(图 1， B)，分离毛细管插入进样(图1， C)，毛细管电泳分析(图1， D)。此 联用系统包括恒流泵(AO)、膜接口(A1)、聚四氟乙烯管(A2)、硅橡胶(A3) 和分离毛细管(A4)。用于蛋白质样品富集的膜接口 (图l， Al;图2)包括 中空纤维膜(2)、连接毛细管(1)、装有缓冲液的离心管(3)以及固定毛 细管的聚四氟乙烯管(4)。在富集时，先将膜接口的出口端用硅橡胶封住, 再用恒流泵将样品不断推入到膜接口中进行富集。在膜接口制作时，使用 环氧树脂胶将毛细管与中空纤维膜连接，并在连接处密封，从而避免在富 集过程中样品在接口处漏出。富集结束后，取下硅橡胶，用恒流泵将富集 后的样品从膜接口中推入到聚四氟乙烯管中。将毛细管插入聚四氟乙烯管， 富集后的样品在毛细作用下进入毛细管的进样端。进样结束后，将分离毛
细管两端插入到缓冲液中，施加电压，进行电泳分离。
样品富集时，可以通过改变样品进入膜接口的流速与富集时间来改善 样品的富集效果。在毛细管进样时，可以通过调节毛细管插入聚四氟乙烯 管的深度来控制进入毛细管的样品量。
本发明的优点
可实现蛋白质样品富集与毛细管电泳分析的联用，降低毛细管电泳分 析的检测限；与完全离线的方法相比，减少了操作步骤，降低了样品的损 失。对低浓度蛋白质样品具有很好的富集效果；膜接口处死体积小(1WL)， 减少了样品消耗；方法简便、操作简单、成本低廉；具有良好的通用性， 实用性强，具有较高的推广价值。
图1为本发明的操作流程图2为膜接口 (图l， Al)的放大图3为三种蛋白质的混合液(Cytochrome C, 0. 0333mg/mL; lysozyme， 0.0333mg/mL ; trypsin inhibitor, 0.167 mg/raL)经过膜接口富集、进样 和电泳分离所得的谱考察了在相同富集时间(20min)、不同富集流速(0.5txL/min， luL/min， 2uL/min)下蛋白质的富集分离效果；样品溶解在10mM磷酸盐 缓冲液(pH3.0)中，缓冲液池中装满lOmM磷酸盐缓冲液(pH3.0)，电泳 缓冲液为20 mM磷酸盐(pH3. 0);每个峰对应的蛋白质为1， Cytochrome C; 2，lysozyme; 3， trypsin inhibitor
a:富集前样品；b,' 0.5uL/min流速下富集所得样品；c: 1 y L/min流
速下富集所得样品；d: 2ixL/min流速下富集所得样品； 图4为胰岛素溶液(0.027mg/mL)经过膜接口富集前的谱图； 图5为胰岛素溶液(0.027mg/mL)经过膜接口富集后的谱图。
具体实施方式
实施例1:
请参阅图1与图2，富集样品时，先将膜接口(A1)的中空纤维膜(2) 与连接毛细管(1)中充满样品，再将膜接口出口端的连接毛细管用硅橡胶 (A3)堵死，最后使用恒流泵(AO)将样品不断推入到膜接口中进行蛋白 质的富集。富集结束后，取下硅橡胶，用恒流泵将富集后的样品从膜接口 中推入到聚四氟乙烯管(A2)中。分离毛细管(A4)插入聚四氟乙烯管中，利 用毛细作用样品转移到分离毛细管(A4)的进样端。进样结束后，将分离毛 细管两端插入到缓冲液中，施加电压，进行电泳分离。
样品为三种蛋白质的混合液(Cytochrome C， 0.0333mg/mL; lysozyme， 0.0333mg/mL; trypsin inhibitor, 0.167 mg/mL)。样品溶解在lOmM磷酸 盐缓冲液(pH3.0)中，膜接口中装满10mM磷酸盐缓冲液(pH3.0)，电泳 缓冲液为20 mM磷酸盐(pH3.0)。膜接口的两端连接毛细管内径均为 100um，外径均为375um，长度均为10cm。分离毛细管内径为50u m，外 径375um，总长为34cm，有效长度为24cm。毛细管电泳施加电压为-16kv。
每次样品富集结束时，关闭恒流泵，稳定lmin后取下硅橡胶。用 0.5uL/min的流速将富集在膜接口处的样品推出进入到聚四氟乙烯管中。 将分离毛细管的进样端插入到聚四氟乙烯管中进行进样，插入深度为4mm。
进样结束后，进行电泳分析。考察了富集时间(20min)相同，不同富集流 速(0. 5uL/min， 1 u L/min， 2uL/min)下的富集效果，如图3所示。
由图3可以看出，在三种富集流速下，富集20min后蛋白质样品均得 到了很好的富集。随着富集流速的增大(0.5wL/min—2uL/min),富集效 果也有所提高。富集流速2uL/min，富集时间20min时，富集倍数可以达 到21倍。
实施例2:
样品为胰岛素溶液(0.027mg/mL)。样品溶解在10mM磷酸盐缓冲液 (pH3.0)中，膜接口中装满lOmM磷酸盐缓冲液(pH3.0)，电泳缓冲液为 20 mM磷酸盐(pH3.0)。膜接口的两端连接毛细管内径均为100ym，外径 均为375nm,长度均为10cm。分离毛细管内径为50 y m，外径375um,总 长为34cm，有效长度为24cm。毛细管电泳施加电压为-16kv。
每次样品富集结束时，关闭恒流泵，稳定lmin后取下硅橡胶。用 0.5iiL/min的流速将富集在膜接口处的样品推出进入到聚四氟乙烯管中。 将分离毛细管的进样端插入到聚四氟乙烯管中进行进样，插入深度为4mm。 进样结束后，进行电泳分析。考察了富集时间20min，富集流速luL/min 下的富集效果，如图4、图5所示。
权利要求
1.一种用于蛋白质样品富集及与毛细管电泳分析联用的方法，其特征在于所述的用于蛋白质样品富集及与毛细管电泳分析联用的方法，包括蛋白质样品的富集、富集后样品的推出、分离毛细管在毛细作用下进样和毛细管电泳分析；联用系统包括恒流泵(A0)、膜接口(A1)、聚四氟乙烯管(A2)、硅橡胶(A3)和分离毛细管(A4)；用于蛋白质样品富集的膜接口(图1，A1；图2)包括连接毛细管(1)、中空纤维膜(2)、盛装缓冲液的离心管(3)、固定毛细管的聚四氟乙烯管(4)以及加入与取出缓冲液的开口(5)；富集样品时，先将膜接口(A1)的中空纤维膜与连接毛细管(1)中充满样品，再将膜接口(A1)出口端的连接毛细管(1)用硅橡胶堵死，最后使用恒流泵将样品不断推入到膜接口(A1)中；由于蛋白质大分子无法透过中空纤维膜(2)而达到富集效果；富集结束后，取下硅橡胶(A3)，用恒流泵将富集后的样品从膜接口(A1)中推出，样品进入到聚四氟乙烯管中；将毛细管(1)插入到聚四氟乙烯管(4)，样品在毛细作用下进入毛细管(1)的进样端；进样结束后，将毛细管(1)两端插入到缓冲液中，施加电压，进行电泳。
2. 按照权利要求1所述的用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联 用的方法，其特征在于所述恒流泵(AO)的流量为0.5-2.5nL/min。
3. 按照权利要求1所述的用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联 用的方法，其特征在于所述的膜接口(A1)的中空纤维膜(2)为醋酸纤维 素膜，内径为100 400u m，截留分子量为3000 8000Da，有效长度为2cm-4cm。
4. 按照权利要求1所述的用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联用的方法，其特征在于所述的膜接口(A1)的连接毛细管(1)内径与外径 要与醋酸纤维素膜内径相匹配，以保证毛细管(1)可以穿入膜中。
5. 按照权利要求1所述的用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联 用的方法，其特征在于所述的聚四氟乙烯管(A2)的内径接近连接毛细管(1)的外径，聚四氟乙烯管(A2)与毛细管(1)为密封连接。
6. 按照权利要求1所述一种用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析 联用的方法，其特征在于所述硅橡胶(A3)也能是其他的能够提供较高反 压的材料，如毛细管聚合物整体柱，或者毛细管硅胶整体柱，或者毛细管填 充柱等等。
7. 按照权利要求1所述的用于蛋白质样品富集与毛细管电泳分析联用 的方法，其特征在于所述的分离毛细管的内径为50或者75μm。
全文摘要
一种用于蛋白质样品富集及与毛细管电泳分析联用的方法，包括蛋白质样品的富集、富集后样品的推出、分离毛细管在毛细作用下进样和毛细管电泳分析；联用系统包括恒流泵、膜接口、聚四氟乙烯管、硅橡胶和分离毛细管；富集样品时，使用恒流泵将样品不断推入到膜接口中；富集结束后，样品进入到聚四氟乙烯管中；将毛细管插入到聚四氟乙烯管，样品在毛细作用下进入毛细管的进样端；进样结束后，将毛细管两端插入到缓冲液中，施加电压，进行电泳。其优点为与完全离线的方法相比，减少了操作步骤，降低了样品的损失；对低浓度蛋白质样品具有很好的富集效果；膜接口处死体积小，减少了样品消耗；方法简便，操作简单，成本低廉。
文档编号G01N27/447GK101344503SQ20071001204
公开日2009年1月14日 申请日期2007年7月11日 优先权日2007年7月11日
发明者乔晓强, 孙良亮, 张丽华, 张玉奎, 张维冰, 振 梁, 玉 梁, 王婷婷 申请人:中国科学院大连化学物理研究所