一种适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒及检测方法

文档序号:6124603阅读:511来源:国知局

专利名称::一种适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒及检测方法
技术领域
:本发明涉及转基因作物,具体的说是一种适用于饲料的转基因大豆检测方法及检测试剂盒。
背景技术
:转基因作物是指利用重组DNA技术将外源基因整合于受体植物基因组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代,也称为遗传修饰生物体(Geneticallymodifiedorganisms,GM0s)。自1983年首例转基因植物问世以来,全球转基因作物的种植面积和销售收入均以倍数增长。但从严肃的科学意义上说,转基因农产品的生物安全性目前尚无确定的结论。人类关注转基因食品安全的同时,也关注着动物伺料的安全。甸料安全是食品安全的一个重要环节,转基因饲料的安全性检测也将为相应转基因食品的安全性提供有力的证据。我国的饲料生产已经具有相当规模,饲料中常用的原料有大豆、豆粕、棉籽粕、玉米菜籽粕等,这些可能含有转基因的作物有对动物、人体和生态环境存在不可知的危害。到目前为止,尚未见关于对飼料进行转基因检测的专利技术。
发明内容本发明的目的在于提供一种具有高度灵敏性的适用于饲料的转基因大豆检测方法及检测试剂盒。为实现上述目的,本发明釆用的技术方案为试剂盒1)第一次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22.5nil、引物F20.5]al、引物R20.5ju1,TaqDNA聚合酶0.5ji1;2)第二次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22.5jal、引物F30.5jul、引物R30.5|al、TaqDNA聚合酶0.5ja1;其中,第一次PCR反应引物为F2:5,"CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3,;R2:5,~<XGGAAAGGCCAGAGGATT-3,;第二次PCR反应引物为F3:5,-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3,;R3:5,《AGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3,;第一次PCR和第二次PCR反应液体系中PCR反应缓冲液含有10mMTris-HCI,pH8.3;50mMKCI、1.5mMMgCI2、d證0.2mM;3)阳性对照顧A1ju1。所述阳性对照DNA为转基因大豆DNA。检测方法1)提取模板DNA:称取l-10g转基因大豆的原料,加入10-100ml预冷的提取缓冲液混匀;加入预热60-7(TC的裂解缓冲液混匀;60-7(TC温育30-60min;冷却后加入5-50ml氯仿、异戊醇和乙醇的混合液混勾,室温放置3-10分钟;而后在10000-13000rpm离心8-15min,取上清液并在上清液中加入5-50ml酴和氯仿混合液混匀,室温放置3-IO分钟;再以10000-13000rpm离心8-15min取上清液;上清液中加入其体积2/3的预冷异丙醇,-20--4(TC放置20-30min,10000-13000rpm离心10-15min,即得到提取模板DNA,待用;2)进行转基因检测步骤l)得到的DNA模板液取lnl加入PCR反应缓冲液,并加入引物F2和R2各0.5jil以及TaqDNA聚合酶O.5|il,混合均匀,而后在94。C预变性2min,94。C变性30s,55。C退火30s,72。C延伸45s,共35个循环,最后72。C延伸10min;得到第一次PCR扩增产物,取1ji1第一次PCR扩增产物加入无菌双蒸水进行50-100倍稀释,而后取1ju1稀释液加入PCR反应液缓冲液中,并加入引物F3和3各0.5ia1以及TaqDNA聚合酶0.5ji1,混合均句,以上述PCR反应条件进行第二轮扩增,得到扩增产物;F2:5,"CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3,;R2:5,~CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3,;F3:5,-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3,;R3:5,~CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3,;将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳和紫外光检测结果,如果存在250bp的DNA条带,证明所检测的原料中含有转基因大豆。所述步骤1)中提取的模板顧A沉淀在体积浓度为70%乙醇中洗涤l-2次,晾干后,溶于500-1000]il双蒸水中,待用。所述步骤l)中异戊醇、乙醇和氯仿的体积比为4:20:76;酚和氯仿体积比为1:1;提取缓冲液为0.8MNaCI;5函Tris-CI,l隨EDTA;pH8.0;裂解缓冲液为0.8MNaCI;50MTris-CI,10mMEDTA;20%CTAB;pH8.0。所述预冷的异丙醇预冷温度为4。C。本发明所具有的有点本发明通过针对各种畜禽和水产饲料建立了具有高度灵敏性的转基因检测技术,并且提取高质量的DNA和釆用高灵敏度的检测技术对其外源基因进行检测。本发明克服配合词料中添加的转基因豆粕DNA为受到严重破坏的DNA的缺点,豆粕为转基因大豆生产豆油过程中产生的副产品,其基因组DNA在压榨的过程中产生了剧烈的破坏,伺料加工过程中粉碎、制粒和熟化等高温、高剪切力等问题,也进一步破坏了其基因组DNA,由此得到转基因饲料中外源基因的检测具有更高的难度,并通过本发明试剂盒可提取高质量的DNA和釆用高灵敏度的检测技术对其外源基因进行检测。本发明釆用CTAB法提取配合饲料的基因组总DNA,并且根据GenBank中登录的转基因大豆外源基因序列设计了2对引物,釆用这两对引物对含有2%,5%,20%,30%,50%含量的转基因豆粕的饲料进行进行巢式PCR检测,结果显示能成功检出其中的转基因成分。利用本发明对巿售35份饲料中有32份检出了转基因大豆的特异外源基因序列,发现其中91%的饲料釆用了转基因豆粕。本发明具有很高的灵敏度。图1为本发明饲料中的DNA电泳图谱。图2为本发明同豆粕含量的对虾饲料的巢式PCR扩增结果的电泳图谱,其中根据M为,DL2000分子量标准;l为,阴性对照(非转基因饲料);2-7,不同豆粕含量的对虫下饲料(重量百分比分别为50%,30%,20%,5%,2%,0%);8为,阳性对照DNA(转基因大豆)具体实施例方式下面进一步详细叙述本发明。实施例1适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒1)第一次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22.5nl,引物F2和R2(各0.5ml),TaqDNA聚合酶0.5ju1。2)第二次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22.5yl,引物F3和R3(各0.5|al),Taqdna聚合酶0.5)j1。其中,第一次PCR反应引物为F2:5,"CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3,;R2:5,~CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3,;第二次PCR反应引物为F3:5,-TAACMCATGGCACAAGGGATACA-3,;R3:5,~CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3,;第一次PCR和第二次PCR反应液体系中PCR反应缓冲液含有10mMTris-HCI,pH8.3;50mMKCI、1.5mMMgCI2、dNTP0.2mM。3)阳性对照DNA1ju1。所述阳性对照DNA为转基因大豆DNA。实施例2适用于词料的转基因大豆的检测方法1)提取模板DNA:含转基因豆粕不同质量百分比的对虾配合饲料的制备方法配合饲料的配方组成如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表中矿物质配方为磷酸二氢钙,23.5g/kg,氯化钠,1g/kg;磷酸二氢钾,10g/kg;七水硫酸镁,4g/kg;七水硫酸铁502.8mg/kg;—水硫酸锰62.1mg/kg;七水硫酸锌442mg/kg;碘化钾(1%)100mg/kg,亚硒酸钠(1%)100mg/kg。各种原料粉碎后过60目筛,微量添加成分釆取逐级扩大法混合均勾,混合制粒,颗粒饲料9(TC烘干30分钟,风干冷冻用于转基因大豆成分检测。称取lg上述制备的转基因豆粕含量2%的对虫下配合饲料粉末;将粉末转入50ml离心管中,加入10ml、4。C预冷的提取缓冲液,混勾;加入65。C预热的裂解缓冲液,混勻;65。C温育30min;冷却后加入5ml氯仿、异戊醇和乙醇的混合液,其中异戊醇乙醇氯仿(V/V)=4:20:76,颠倒混匀,室温放置8分钟,使其自然分层;而后在10000rpm离心8min,取上清液并在上清液中加入5ml酚和氯仿(V/V=1:1)混合液,颠倒混匀,室温放置7分钟,使其自然分层;再以10000rpm离心8min取上清液;上清液中加入其体积2/3的4。C预冷的异丙醇,小心混匀,-2(TC放置20min,10000g离心10min,即得到模板DNA(参见图1,可见饲料中的DNA已经受到剧烈破坏。)。DNA沉淀在70y。乙醇中洗涤一次,稍晾干后,溶于500ul双蒸水中,待用,其他含量的对虾配合饲料按此步骤进行提取。其中预冷的提取缓冲液为0.8MNaCI,50MTris-CI,10mMEDTA,pH8.0;预热的裂解缓冲液为0.8MNaCI,50MTris-CI,10mMEDTA,20%CTAB,p亂0。2)进行转基因检测分别取1li1转基因豆粕含量分别为2%,5%,20%,30%,50%的对虫下配合饲料DNA液作为模板,分别与24nl第一次PCR反应液体系混合均勻,而后在94。C预变性2min;94。C变性30s,55。C退火30s,72。C延伸45s,共35个循环;最后72。C延伸10min,分别得到含有不同含量的转基因豆粕的第一次PCR扩增产物,分别取1n1上述第一次PCR扩增产物加入双蒸水进行100倍稀释,而后与24M1第二次PCR反应液体系混合均匀,再以上述PCR反应条件进行第二轮扩增,得到扩增产物。其中,第一次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22.5|jl,引物F2和R2各O.5jul,TaqDNA聚合酶0.5pl;F2:5,~CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3,;R2:5,"CCGG嵐GGCCAGAGGATT-3,;第二次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22.5|al,引物F3和R3各0.5ia1,TaqDNA聚合酶0.5ju1。F3:5,-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3,;R3:5,"CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3,;其中,第一次与第二次PCR反应液体系中PCR反应缓冲液含有10mMTris-HCI,pH8.3;50mMKCI;1.5mMMgCI2;dNTP0.2mM将经二次扩增的产物,经O.8%的琼脂糖凝胶电泳20-30分钟(80-100V/cm),得琼脂糖电泳检测图谱(参见图2)。紫外光检测结果,如果存在250bp的DNA条带,证明所检测的原料中含有转基因大豆。实施例37与实施例2不同之处在于1)提取模板DNA:称取10g转基因大豆的原料,加入100ml预冷的提取缓冲液混匀;加入70。C预热的裂解缓冲液混匀;7(TC温育60min;冷却后加入50ml氯仿、异戊醇和乙醇的混合液混匀,室温放置3分钟;而后在13000rpm离心15min,取上清液并在上清液中加入50ml酚和氯仿混合液混匀,室温放置3分钟;再以13000rpm离心15min取上清液;上清液中加入其体积2/3的预冷异丙醇,-4(TC放置20min,10000,离心;15min,即得到提取模板DNA,提取的模板DNA沉淀在体积浓度为70%乙醇中洗涤2次,晾干后,溶于1000pl双蒸水中,待用。2)进行转基因检测。实施例4与实施例2不同之处在于1)提取模板DNA:称取5g转基因大豆的原料,加入60ml预冷的提取缓冲液混匀;加入6(TC预热的裂解缓冲液混匀;6(TC温育450min;冷却后加入25ml氯仿、异戊醇和乙醇的混合液混匀,室温放置5分钟;而后在12000rpm离心Umin,取上清液并在上清液中加入25ml酚和氯仿混合液混勻,室温放置8分钟;再以12000rpm离心12min取上清液;上清液中加入其体积2/3的预冷异丙醇,-3(TC放置20fflin,10000rpm离心;15min,即得到提取模板DNA,提取的模板DNA沉淀在体积浓度为70%乙醇中洗涤2次,晾干后,溶于700m1双蒸水中,待用。2)进行转基因检测。权利要求1.一种适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒,其特征在于1)第一次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22.5μl、引物F20.5μl、引物R20.5μl,TaqDNA聚合酶0.5μl;2)第二次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22.5μl、引物F30.5μl、引物R30.5μl、TaqDNA聚合酶0.5μl;其中,第一次PCR反应引物为F25’-CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3’;R25’-CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3’;第二次PCR反应引物为F35’-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3’;R35’-CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3’;第一次PCR和第二次PCR反应液体系中PCR反应缓冲液含有10mMTris-HCI,pH8.3;50mMKCI、1.5mMMgCI2、dNTP0.2mM;3)阳性对照DNA1μl。2.按权利要求1所述的适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒,其特征在于所述阳性对照DNA为转基因大豆DNA。3.—种按权利要求1所述的适用于饲料的转基因大豆检测方法,其特征在于1)提取模板腿A:称取l-10g转基因大豆的原料,加入10-100ml预冷的提取缓冲液混句;加入预热60-7(TC的裂解缓冲液混匀;60-70。C温育30-60min;冷却后加入5-50ml氯仿、异戊醇和乙醇的混合液混句,室温放置3-IO分钟;而后在10000-13000rpm离心8-15min,取上清液并在上清液中加入5-50ml酚和氯仿混合液混匀,室温放置3-10分钟;再以10000-13000rpm离心8-15min取上清液;上清液中加入其体积2/3的预冷异丙醇,-20--40°<3放置20-30min,10000-13000rpm离心10-15min,即得到提取模板画A,待用;2)进行转基因检测步骤l)得到的DNA模板液取ljal加入PCR反应缓冲液,并加入引物F2和R2各0.5ju1以及TaqDNA聚合酶O.5|il,混合均勾,而后在94。C预变性2min,94。C变性30s,55。C退火30s,72。C延伸45s,共35个循环,最后72。C延伸10min;得到第一次PCR扩增产物,取1]i1第一次PCR扩增产物加入无菌双蒸水进行50-100倍稀释,而后取1n1稀释液加入PCR反应液缓冲液中,并加入引物F3和3各0.5jul以及TaqDNA聚合酶O.5|al,混合均匀,以上述PCR反应条件进行第二轮扩增,得到扩增产物;F2:5,-CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3,;R2:5,~CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3,;F3:5,-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3,;R3:5,~CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3,;将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳和紫外光检测结果,如果存在250bp的DNA条带,证明所检测的原料中含有转基因大豆。4.按权利要求3所述的适用于饲料的转基因大豆检测方法,其特征在于所述步骤l)中提取的模板DNA沉淀在体积浓度为70%乙醇中洗涤l-2次,晾干后,溶于500-1000ji1双蒸水中,待用。5.按权利要求3所述的适用于饲料的转基因大豆检测方法,其特征在于所述步骤l)中异戊醇、乙醇和氯仿的体积比为4:20:76;酚和氯仿体积比为l:l;提取缓冲液为0.8MNaCI;50MTris-CI,10mMEDTA;pH8.0;裂解缓冲液为0.謹NaCI;50MTris-CI,lOmMEDTA;20%CTAB;pH8.0。6.按权利要求3所述的适用于饲料的转基因大豆检测方法,其特征在于所述预冷的异丙醇预冷温度为4'C。全文摘要本发明涉及转基因作物,具体的说是一种适用于饲料的转基因大豆检测方法及检测试剂盒。具体试剂盒PCR反应缓冲液22.5↘1,引物F2和R2各0.5↘1或F3和R3各0.5↘1,TaqDNA聚合酶0.5μl;阳性对照DNA1↘1。引物为F25’-CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3’;R25’-CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3’;F35’-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3’;R35’-CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3’。经过检测添加不同含量转基因豆粕的饲料进行检测,结果显示本发明能够成功检测出其中的转基因大豆外源基因。利用本发明对市售多种添加豆粕的畜禽和水产饲料进行检测,结果显示91%的配合饲料中含有转基因大豆成分,表明本发明为灵敏性高。文档编号G01N21/77GK101319996SQ20071001689公开日2008年12月10日申请日期2007年7月20日优先权日2007年7月20日发明者梅刘,雷王,王宝杰,蒋克勇,冉陶申请人:中国科学院海洋研究所
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1