专利名称：：一种检测抗体亲和力的方法
技术领域：
：本发明属于医药生物类，具体地是涉及一种检测抗体亲和力的方法。
背景技术：
：抗体亲和力是确定抗体性质的重要参数之一，同时，也是杂交瘤所分泌的单克隆抗体(McAb)稳定性的重要指标。它表示抗体与抗原结合的紧密程度。高亲和力的抗体对于定量检测及导向诊治是有用的，而低亲和力的抗体用于免疫纯化较好。因此，要根据应用的目的选择具有一定亲和力的抗体，就需要先对抗体亲和力进行检测。抗体亲和力是指抗体和抗原结合的牢固程度，常用亲和常数Ka表示。Ka是iH/逆向反应速率常数的比值，单位为稀释度单位(L/mo1)，表示需将lmol抗体稀释至多少升，才能使抗原-抗体结合下降50%;而Ka的倒数为解离常数(Kd)，其单位为浓度单位(mol/L)。为了提高免疫分析的灵敏度、精密度和准确度，选用Ka值高的抗体或抗血清是非常关键的。目前对于抗体亲和力的检测一般采用平衡透析法、酶联免疫吸附试验(ELISA)或放射免疫分析(RIA)的竞争结合试验等。平衡透析法的全部抗原抗体反应过程在均一液相体系中完成，反应的动力学过程受到的干扰因素较少，基本上完全符合质量作用定律的前提条件要求。但该法仅能测定小分子抗原与相应抗体间的亲和常数，同时要求将反应底物进行放射性标记，反应完成后又需将抗原抗体复合物与游离抗原抗体分开，实验过程繁琐、复杂，不易广泛开展。RIA虽然灵敏度高，但会造成放射性污染和危害，且存在常用放射性核素半衰期短、无法自动化分析等诸多不足。理论上采用非竞争性ELISA法测定抗体亲和常数还不十分完善。ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。同时，抗原的包被需4'C过夜，并且有多步的洗漆步骤，所需时间比较长。液相芯片系统是生物芯片领域已经发展成熟的一项技术。液相芯片系统包括Luminex仪器和不同荧光编码的微球等。Luminex仪器是一自动化程度极高的检测和分析仪器。荧光编码的微球目前共有IOO种，可检测IOO种与之相偶联的不同种类的目标分子。将这些微球悬浮于一个液相体系中，就可以对同一个样品中的多个不同的检测对象同时进行检测，这种检测技术称为xMAP(flexibleMulti-AnalyteProfiling)技术。在微球的制造过程中，掺入了两种不同的红色荧光染料，根据这两种染料的比例不同，可以把微球分为100种。在液相芯片系统中，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的微球都带有一个独特的荧光编码。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白(抗体或抗原，用于免疫检测)作为探针分子，检测抗体中以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、检测抗体、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应物的类型；而绿色激光则检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物的浓度。液相芯片平台的优势-(1)高通量，多指标并行检测液相芯片可对同一样本中不同分子同时进行分析，在35-60分钟内可对多达100种不同指标进行检测；与传统方法的逐个检测相比，这是一个质的飞跃。(2)敏感度高，重复性好传统的酶联免疫吸附(ELISA)技术和平面芯片技术是对分子集合的光信号进行检测得到结果，且只实现到半定量检测；而液相芯片技术则可实现定量检测，对单个微球荧光信号进行检测，计算100个微球荧光值，取其中值(Median),所以精确度高，重复性好。早期使用液相蛋白芯片的双抗体夹心法来进行细胞因子的研究己经证明此类技术的灵敏度及检测范围比ELISA高出许多。(3)操作简单，节约时间，样品与成本液相芯片反应在悬浮的液相中进行，液相环境可以更好地保持蛋白的天然构象和活性，也更有利于探针和被检测物的反应，所以反应时间短。反应后通常不用清洗即可以直接检测，克服了平面固相芯片探针点样式容易发生点样错位、耗时、平行等量加样困难、加样头反复加样易发生样本间污染、重复性差等缺点，检测效率大大高于平面固相芯片。
发明内容本发明需要解决的技术问题是提供一种稳定可靠，操作简单的同时检测多种抗体亲和力的方法。解决上述技术问题的技术方案是一种检测抗体亲和力的方法，包括以下步骤(1)抗原包被微球-将50uL的微球活化，活化后的微球离心；-吸弃上清，将微球重悬于pH=5.0的200-300yL50rnM的MES缓冲液的溶液中，涡漩振荡10-30s，超声振荡10-30S;微球离心；该步骤重复一次；-吸弃上清，将微球重悬于100uL50mM的MES缓冲液(pH5.0)中，涡漩振荡约10-30s，超声振荡约10-30s;-往悬浮的微球中加入0.8-1.2ug抗原，用50mM的MES缓冲液(pH5.0)溶液将总体积补至450-550pL;用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-3hr;-偶联抗原后的微球离心；-吸弃上清，将微球重悬于500uLPBS-TBN(即PBS中含O.1%BSA，0.02%Tween—20，0.05%NaN，pH7.4)溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;室温避光振荡30min;_将偶联抗原后的微球离心，吸弃上清，将微球重悬于0.8-1.2mLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡10-30s，超声约10-30s后将微球离心；重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于250-1000PLPBS-TBN溶液中；-包被好的微球通过计数后于2-8'C避光保存；(2)抗体亲和力的检测-取出96微孔滤板，确定和标记位置；将待检测的抗体进行梯度稀释，例如稀释至浓度分别为100、10、1、0.1、0.01、10—^g/ml;将不同浓度的抗体；分别对应加入到滤板的微孔中，每孔的量为23-28^1;-抗原包被的微球涡漩振荡，超声处理后稀释至35-45个Ail;-在微孔中分别加入抗原包被的微球25^tl，37'C振荡孵育25-35min;-抽滤，洗板三次。-每孔加入45-55^1的2ng/ml藻红蛋白标记的抗抗体(PE-Ab)，37'C左右振荡孵育25-35min;-抽滤，洗板三次；-读取荧光值；(3)数据处理。抗体亲和常数K的计算方法与酶促反应的米-曼氏常数类似。在抗原浓度不变的情况下，将已知浓度的抗体(M)进行梯度稀释。设抗体浓度高时与酶标抗原的结合率为100%(称最大结合率，MFI值最高)，则结合率为50%所对应的抗体浓度的倒数值即为亲和力。根据这一原理，发明人设计了以下的数据处理方法-将抗体浓度转换为单位是mol/L:-以10为底取对数，再取相反数；-以上述算出的数据作横坐标，以对应MFI值作纵坐标，作平滑曲线-拟合出曲线方程-抗体高浓度平台MFI值减去低浓度平台MFI值，除以二，代入上述曲线方程，算出的对应横坐标数值即可作为该抗体与抗原亲和力的一个代表值。也可继续按上述步骤逆向运算得出抗体的亲和常数(L/mo1)。优选地，所述微球活化包括以下步骤-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球，大约20s;-取50uL微球离心；-去掉上清夜,将微球重悬于100yL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，离心；-吸弃上清，加入80pL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s;-力口入10"50mg/n￡Sulfo-NHS(N-Hydroxysulfosuccinimidesodiumsalt，N-羟基硫代琥珀酰亚胺)，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-力卩入10liL50mg/mLEDC(l-Ethyl-3-(3-ditnethyllaminopropyl)carbodiimidehydrochloride,卜乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀。优选地，所述离心的速度》8000g,时间为1-2min。本发明利用抗原、PE标记抗体在液相芯片平台上建立一种全新的抗体亲和力检测方法，具有以下优点-1)应用于液相芯片检测技术平台的原料质检和抗体筛选，本发明的检测方法不需反复洗涤，简单快捷；2)敏感度高，重复性好，检测结果更加稳定可靠；3)能同时对多种抗体进行亲和力检测，大大提高检测效率。图l是实施例l检测结果示意图；图2是实施例2检测结果示意图；图3是实施例3检测结果示意图。具体实施例方式以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。实施例中，所述各种溶液的配方如下1.50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例1以P—HCG(P-subunithumanchorionicgonadotropin,人绒毛膜促性腺激素P亚单位)的三种不同抗体(克隆号分别为M94139.7,220-5011，220-5013)的亲和力检测为例。所述抗体亲和力检测方法的步骤如下抗原包被微球_用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球(美国Luminex公司)，大约20s;-取50uL微球于1.5ml的离心管中，》8，000g的速度离心l-2min;-去掉上清夜，将微球重悬于100uL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，>8000g的速度离心l一2min;-吸弃上清，加入80yL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s;-加入10uL50mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-加入10uL50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀；—活化后的微球，》8000g，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于250uL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s，微球》8000g，离心l-2min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于100txL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-往悬浮的微球中加入1ygP—HCG抗原，用50mM的MES(pH5.O)溶液将总体积补至500nL;-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡2hr;-偶联抗原后的微球以》8000g的速度，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于500uLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-室温避光振荡30min;—微球》8000g，离心1-2min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s，微球于》8000g，离心1-2min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于250-1000yLPBS-TBN溶液中；-包被好的微球通过luminex仪器计数；-包被好的微球置于2-8'C避光保存。抗体亲和力的检测-取出96微孔滤板，确定和标记位置；-将e—HCG抗体(克隆号分别为M94139.7,220-5011，220-5013)分别进行梯度稀释，稀释至浓度分别为20、2、0.2、0.02、0.002、0.0002ng/ml，按标记位置分别加入到滤板微孔中；-抗原包被的微球涡漩振荡(vortex)30s，超声处理lmin，将抗原包被的微球稀释至40-滤板微孔中分别加入抗原包被的微球25pl(即1，000个/孔)和抗体25pl，37。C震荡孵育30min。-抽滤，洗板三次。_分别加入相应的50pl的2叫/mlPE-Ab(藻红蛋白标记的抗抗体)，37'C避光振荡孵育30min。-抽滤，洗板三次。-上机读荧光值。-数据处理-将抗体浓度转换为单位是mol/L;-以10为底取对数，再取相反数；-以上述算出的数据作横坐标，以对应MFI值作纵坐标，作平滑曲线-拟合出曲线方程；_抗体高浓度平台MFI值减去低浓度平台MFI值，除以二，代入上述曲线方程，算出的对应横坐标数值即可作为该抗体与抗原亲和力的一个代表值。也可继续按上述步骤逆向运算得出抗体的亲和常数(L/mo1)。实验结果以e—HCG为例表中MFI值即荧光值，M94139.7，220-5011，220-5013分别为P—HCG的三种不同抗体。表l吗/ralmol/L浓度的负对数M94139.7(MFI值)220-5011(MFI值)220-5013(MFI200.0001253.90308998727734.54327.52723420.00001254.90308998727391395.524628.50.20.000001255.90308998725055.529.552960.020.0000001256.9030899872714.514.52250.0021.25E-087.903089987119.57220.00021.25E-098.903089987201210结果计算如下M94139.7抗体亲和常数的计算y=(27734.5-20)/2=13857代入公式y=-22341x+156936解得x=6.404312699亲和常数1(=1/(10-"薩柳)=2.50E+06同理，可计算220-5011和220-5013两种抗体的亲和常数，分别为2.85E+04,2.97E+05实施例2PSA(ProstateSpecificAntigen,前列腺特异性抗原)的三种抗体(克隆号分别为M701042,PS5，BM215)亲和力检测。所用方法与实施例1的步骤相同。结果如下，表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结果计算如下M701042抗体亲和常数的计算y=(6323.5-438.5)/2=2942.5，代入公式y=-4447.5x+38174，解得x3.92164亲和常数K-1/(10—792164)=8.35E+07同理，可计算PS5和BM215两种抗体的亲和常数，分别为9.70E+07,7.66E+07。实施例3TNF-a(Tumornecrosisfactor-alpha,肿瘤坏死因子a)的三种抗体(克隆号分别为TNF-aF6，D2，28401.111)亲和力检测。所用方法与实施例l的步骤相同。结果如下，表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果计算如下TNF-aF6抗体亲和常数的计算y=(10233.5-2)/2=5116.75，代入公式y=-4981.5x+26157，解得x=4.2237亲和常数K-1/(10—42237)=1.67E+04同理，可计算D2和28401.Ill两种抗体的亲和常数，分别为5.86E+04,6.97E+0L权利要求1.一种检测抗体亲和力的方法，其特征是，主要包括以下步骤(1)抗原包被微球-将50μL的微球活化，活化后的微球离心；-吸弃上清，将微球重悬于pH＝5.0的200-300μL50mM的MES缓冲液的溶液中，涡漩振荡10-30s，超声振荡10-30s；微球离心；该步骤重复一次；-吸弃上清，将微球重悬于100μL50mM的MES缓冲液(pH5.0)中，涡漩振荡约10-30s，超声处理约10-30s；-往悬浮的微球中加入0.8-1.2μg抗原，用50mM的MES缓冲液(pH5.0)溶液将总体积补至450-550μL；用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-3hr；-将偶联了抗原后的微球离心；-吸弃上清，将微球重悬于500μLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s；室温避光振荡30min；-将偶联了抗原的微球离心，吸弃上清，将微球重悬于0.8-1.2mLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡10-30s，超声约10-30s后将微球离心；重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于250-1000μLPBS-TBN溶液中；-包被好的微球通过计数后于2-8℃避光保存；(2)抗体亲和力的检测-取出微孔滤板，确定和标记位置；将待检测的抗体进行梯度稀释；将不同浓度的抗体，分别对应加入到滤板的微孔中，每孔的量为23-28μl；-抗原包被的微球涡漩振荡，超声处理后稀释至35-45个/μl；-在微孔中分别加入抗原包被的微球25μl，37℃左右震荡孵育25-35min；-抽滤，洗板三至五次；-每孔分别加入45-55μl的2μg/ml藻红蛋白标记的抗抗体，37℃左右避光振荡孵育25-40min；-抽滤，洗板三至五次；-读取荧光值；(3)数据处理。2.根据权利要求1所述的检测抗体亲和力的方法，其特征是所述微球活化包括以下步骤-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球，大约20S;-取50uL微球离心；_去掉上清夜,将微球重悬于100μL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，离心；-吸弃上清，加入80uL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s;-加入10μL50mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-加入10uL50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；'-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀。3.根据权利要求1或2所述的检测抗体亲和力的方法，其特征是，所述离心的速度≥8000g，时间为1-2min。4.根据权利要求1或2所述的检测抗体亲和力的方法，其特征是，所述数据处理包括以下步骤-将抗体浓度转换为单位是mol/L_以10为底取对数，再取相反数-以上述算出的数据作横坐标，以对应MFI值作纵坐标，作平滑曲线图-拟合出曲线方程-抗体高浓度平台MFI值减去低浓度平台MFI值，除以二，代入上述曲线方程，算出的对应横坐标数值即可作为该抗体与抗原亲和力的一个代表值。也可继续按上述步骤逆向运算得出抗体的亲和常数。全文摘要本发明公开了一种检测抗体亲和力的方法，该检测方法主要包括步骤(1)抗原包被微球，(2)抗体亲和力的检测和(3)数据处理。所述检测抗体亲和力的方法具有简单快捷、敏感度高、重复性好、检测结果更加稳定可靠等优点。文档编号G01N33/543GK101173923SQ20071003056公开日2008年5月7日申请日期2007年9月27日优先权日2007年9月27日发明者彭臻菲,杨惠夷,许嘉森申请人:广州益善生物技术有限公司