专利名称：一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法
技术领域：
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及新型链霉亲和素标记的藻蓝蛋 白类荧光蛋白质的制备方法。
技术背景藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据 其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、 藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和 变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亚基， 每个亚基中藻胆色素(phycobilin )通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白 (即o-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相 互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得 CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发 射约630nm的荧光；CPC吸收约620咖的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650 660nm的可见光，发射约660 670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素 (phycoerythrobilin，简称PEB); PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素 (phycoviolobilin，简称PVB ); PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素 (phycocyanobilin，简称PCB); CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。链霉亲和素可以跟生物素特异结合，通过链霉亲和素-生物素系统，可以实现信号放 大作用，提高检测灵敏度。目前链霉亲和素-生物素系统已经广泛应用于生物学检测和医 疗检测等领域。目前主要是通过化学交联实现链霉亲和素对目标的标记。CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley A丄Cai Y A, Glazer A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host[J] Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98(19):10560 10565)。 PCB生物合成基因由力o7和pcjo4组成，可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产PCB (F. T丄andgraf, C. Forreiter, et al. Recombinant holophytochrome in Echerichia coli[J]. FEBSLetters, 2001,508:459-462)。与前人的方法不同，我们发现」朋Z ae朋sp. PCC7120中W75M9基因编码betal55裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源的betal55裂合 酶。这些betal55裂合酶能催化PCB与CPC的beta亚基及其同源蛋白质的155位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合，从而生成具有优良荧光性质的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。通过基因工程技术，把链霉亲和素基因和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白基因拼接后 克隆于表达载体，可以在大肠杆菌内表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的融 合蛋白，直接实现链链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的连接，而不需要通过化学交 联等方法来实现链霉亲和素标记。藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。藻蓝蛋白类 荧光蛋白质具有优良的荧光性质，通过直接实现链链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白 的连接，可用于生物学检测以及医疗检测领域。本发明为藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料 应用于医药和生物工程领域，特别是检测领域奠定了基础。发明内容本发明的目的在于提供分子设计制备新型链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法。它是应用betal55裂合酶催化PCB与链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，从而制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。将含有betal55裂合酶基因、链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接的基因、PCB生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过如此设计的基因工程菌生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。为实现上述发明目的，本发明的技术方案是这样的 一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，包括下述步骤(1) 采用基因工程方法，将betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中， 得到beta裂合酶表达质粒；(2) 用基因工程方法将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因和链霉亲和素基因 拼接后克隆于第二个表达载体中，可以表达链霉亲和素和藻蓝蛋白的融合蛋白，得到链霉 亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；(3) 用基因工程方法将PCB生物合成酶基因力o7和pc/力或其同源基因同时克隆于第 三个表达载体中或分别克隆于第四个表达载体中，得到PCB合成质粒；(4) 将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合 成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌， 应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋 白类荧光蛋白质。上述的制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法中所述的宿主菌为大肠 杆菌。所述的betal55裂合酶基因是指与^7a6ae/ a sp. PCC7120中a〃5JJ9基因同源的 基因。所述的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指与^7s6ae朋sp. PCC7120或尨7a/w'/70犯ssp.PCC7603中c/7c5基因同源的基因。本发明与现有技术相比，具有以下优点1、 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白 质，大肠杆菌繁殖快，可以大大縮短周期；2、 与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；3、 通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质 类似的蛋白，提取方便；4、 方便进行藻胆蛋白分子设计，有利于发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料。
图1为本发明中A115339催化下生成的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的吸 收与荧光光谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
具体实施方式
下面以实例对本发明作进一步详细地说明。 实施例1(1) 从GeneBank中可以查到，藻种力朋te， sp.PCC7120的全序列已经测定完成， 必7aw'/70S"s sp. PCC7603部分序列已经测定。^朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，脱sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋力ae朋sp.PCC7120中的 a^5J^9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-aWMJ9，在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^7a6ae朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5和链霉亲和素基 因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-^-c/ c& 链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。 链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o/-pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因幼在pET30中在vr/wl和《^n两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基因c; ^9是在fcoRV和两个酶切位点之间；裂合酶基因a775JJ9在pCDFDuet中，处 于第二个多克隆位点，酶切位点是AWn和WoI ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pcj^)， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I禾口尸sH之间， pc州在第二个多克隆位点，在yWe I和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-a^5^3义pET30-sa^cpc5和pACYCDuet-/ o卜pcj^转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37"C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l鹏ol/L， 20。C至37'C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体 细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可提纯得到相应 的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。其吸收与荧光光谱见 附图1所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下
从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养基， 37。C振荡培养过夜；取100pL饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37。C振荡培养至 0D6。。=0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10min;离心lmin (10000g， 4""C)弃去上清，收集沉淀菌体；用lmL预冷的0. lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体，离心 30s(10000g， 4。C)去上清，菌体沉淀用100pL预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰上， 加入一定量的构建好的质粒，混匀后冰浴放置30min， 42。C热休克90s，冰浴5min后加入 300pL LB培养基，37。C低速振荡培养45min，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基平 板上，倒置于37'C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。
提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和；
分别从中取100^iL转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37。C振荡培养至OD6。。二0. 5-0.7
时，冰浴约30min，加入IPTG诱导表达；避光、2CTC、 150转/分，表达约12小时。离心
收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株进行大量表达。 实施例2
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种勘a6ae/ a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 7柳i/7os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。勘aAge朋sp. PCC7120在GeneBank中编号
为BA000019，y(/. ^/w'/ owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^/7a6se朋sp.PCC7120中的 a^5^^^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a7J5^3义在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^7a6ae朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5 (C84S)和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-^-^ci9(C84S)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(Z W和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o/-pc;^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即链霉亲和素基因sa在pET30中在fpy71和5^1I两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基 因cpc戲C84S)是在feoRV和J7w I两个酶切位点之间；裂合酶基因a7J5JJ9在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是^^n和iZwI ; PCB合成酶基因是2个(力o7和 pc州)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在辰ol和尸" I之间，pc^在第二个多克隆位点，在MyeI和屈oI之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，
利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-W^^3久pET30-sa~c/ c5 (C84S)和pACYCDuet-力o7-pc_M转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0
的LB培养基中，37t:振荡培养至0"。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside,简称IPTG)至终浓度为lmraol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例3
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种力/3a6a謹sp.PCC7120的全序列已经测定完成， 必h/z i"os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。j/7a力ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，尨^yzu'"osiASsp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254, 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7sZ^e/7S sp.PCC7120中的 a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a775J3义在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将脱Ja肌'/7o幼s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5和链霉亲和 素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-sa-c/^S，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能 表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基 蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和/7C州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pc州，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即链霉亲和素基因5a在pET30中在《p/71和^^n两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基
因cpcS是在5boRV和两个酶切位点之间；裂合酶基因a^M滞在pCDFDuet中，处
于第二个多克隆位点，酶切位点是^^II和i7 o1 ; PCB合成酶基因是2个(力W和pc州)，
它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o/处于第一个多克隆位点，在Afcol和尸"I之间，
pc州在第二个多克隆位点，在7fcfe I和i7 o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-aW5^J;9、 pET30-^"cpcS和pACYCDuet_/ o7-pcy力转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37-C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1腦1/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体 细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可提纯得到相应 的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例4
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^aZwe/ a sp.PCC7120的全序列已经测定完成， M 7a/w'/70犯s sp. PCC7603部分序列已经测定。^7a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，差/柳i/ owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋tee朋sp.PCC7120中的 a^53朋基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a^5M9，在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将M 7a/w'加仰s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5 (C84S)和 链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒 叫pET30-sa-cpc5 (C84S)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大 肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标 记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-/ o7-pcy/！，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因幼在pET30中在A>/71和^^1I两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基 因cpc万(C84S)是在fcoRV和两个酶切位点之间；裂合酶基因W^5^J9在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是^WlI和^wI ; PCB合成酶基因是2个(Zw7和 pcj^)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力W处于第一个多克隆位点，在yVco I和尸" I之间，pc^在第二个多克隆位点，在Wel和i^I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-a"5^滞、pET30-stcpcS (C84S)禾tl pACYCDuet-/ o卜pc州转入大 肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0 的LB培养基中，37。C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2CTC至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:r亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例5
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种勘a力朋朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必Z3肌'/ os"s sp. PCC7603部分序列己经测定。^73&e/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M ^/w'/7os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋6ae朋sp. PCC7120中的 a7753，效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a775J3A在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相
应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^7a6朋朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5和链霉亲和素基
因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pC0LADuet中，所得质粒叫pCOLADuet-幼-c/x^，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌 中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-Z o7-; 《W，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即链霉亲和素基因^和脱辅基蛋白基因cp^拼接后连接到pCOLADuet的￡boR I和 尸"I之间；裂合酶基因3W5^J9在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是 份/II和J/wI ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pcy力)，它们在同一个载体pACYCDuet-l 中，力o7处于第一个多克隆位点，在AfcoI和尸"I之间，pc^在第二个多克隆位点，在 肠I禾口勘I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a^5JJ久pCOLADuet-s『cpc5和pACYCDuet-Z o7-; cy/1转入大肠杆 菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB 培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1腸1/L， 2(TC至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体 细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应 的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例6
(1)从GeneBank中可以查到，藻种sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必Z97W'/ os〃s sp. PCC7603部分序列已经测定。A a6朋朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必7a/w'/Jos"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^a6se/7a sp. PCC7120中的 a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a775JJ9，在大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将力朋6ae朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^ (C84S)和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得质粒 叫pCOLADuet-^-cp^ (C84S)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后， 在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和 素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o卜pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即链霉亲和素基因^和脱辅基蛋白基因cpc沃C84S)拼接后连接到pCOLADuet的^boR I和/^tl之间；裂合酶基因a^5J^^在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位 点是^ 711和Z力o I ;PCB合成酶基因是2个(/w7和pcj^)，它们在同一个载体pACYCDuet-l 中，力o7处于第一个多克隆位点，在AfcoI和尸Wl之间，pcj^在第二个多克隆位点，在 肠I禾口 Z/ 。I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-aWSJJA pCOLADuet-sa~cpc5 (C84S)和pACYCDuet-力o7-pcj^转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH 7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离
心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Nr亲和层析，可提
纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例7
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种力朋tee朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必7a历i"os〃s sp. PCC7603部分序列已经测定。如a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M ^肌'/7omssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7atee朋印.PCC7120中的 a^5"JJ9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a7^5^J9，在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将Z9/w'/7ows sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^和链霉亲和 素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pC0LADuet中，所得质粒叫 pC0LADuet-^-c/^5，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌 中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-/ o/，cy/),在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即链霉亲和素基因幼和脱辅基蛋白基因cpc5拼接后连接到pC0LADuet的fcoR I和 尸stl之间；裂合酶基因在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是 5g711禾卩J/ o I ; PCB合成酶基因是2个(力W和/ cW)，它们在同一个载体pACYCDuet-l 中，力W处于第一个多克隆位点，在AtoI和尸Wl之间，； cW在第二个多克隆位点，在 肠I禾口勘I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a^5^J久pC0LADuet-s『cpc5和pACYCDuet-力o7-pc/力转入大肠杆 菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体 细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应 的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例8
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种勘a/^e朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， #. 7朋7i/7oms sp. PCC7603部分序列已经测定。勘Wae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必J柳j'/7^iASsp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7s6ae朋sp.PCC7120中的 a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-aJ75JJft在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将必7aw'/7o幼s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5 (C84S)和 链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得 质粒叫pCOLADuet-幼-cp^ (C84S)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接 后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉 亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc/力)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-Zw7-p《W，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpc沃C84S)拼接后连接到pCOLADuet的fcoR I和尸"I之间；裂合酶基因a"5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位 点是^g^II和i7 o I ; PCB合成酶基因是2个(力W和pcj^)，它们在同一个载体pACYCDuet-l 中，力o7处于第一个多克隆位点，在AfcoI和Atl之间，pc^在第二个多克隆位点，在 顺I禾口勘I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-s^5"JJ久pC0LADuet-sa~cpc5 (C84S)和pACYCDuet-力o7-转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lramol/L, 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例9
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种Z朋6ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， 7a/w'/70幼s sp. PCC7603部分序列已经测定。勘sfee朋sp. PCC7120在GeneBank中编号
为BA000019，M 7柳i/ os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将J朋力朋朋印.PCC7120中的 a775^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-W753J仏在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将」朋6朋朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c; cS和链霉亲和素基 因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-幼-cpcA 链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和 素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc/A在大肠杆菌中能表达PcyA。即脱辅基蛋白基因wcS在pET30中是在fcoRV和J力o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因m在yfp/ I和^"7II两个酶切位点之间；裂合酶基因a775^J9在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是5^711和J/wI ;PCB合成酶基因是2个(力o7和pcy力)， 力o/在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸W I之间，pc/力在pETDuet-1 中第二个多克隆位点，在y\we I和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-377M滞、pET30-5^c; c5和pACYCDuet-力o厶pETDuet-/ c/力转入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37。C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Nr亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例10
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种sp.PCC7120的全序列已经测定完成， # 〗細i/ os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。勘atee朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，;K sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^73&朋a印.PCC7120中的 a^5^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a725^JA在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^7a力朋"a sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c/ c^ (C84S)和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-wc/^5(C84S)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达HOl。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得质 粒叫pETDuet-pc州，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因c/x^(C84S)在pET30中是在fcoRV和i7 o I两个酶切位点之间， 链霉亲和素基因sa在和^^1I两个酶切位点之间；裂合酶基因a775^J9在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是5^II和化ol ; PCB合成酶基因是2个(力oJ和 pc州)，Z o7在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Afco I禾P尸st I之间，/ c州在 pETDuet-1中第二个多克隆位点，在y^/e I和i7 o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a^5^J义pET30_sa~c/ c5(C84S)和pACYCDuet-/ o7、 pETDuet-pcyZ 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至OD6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖 苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例11
(1)从GeneBank中可以査到，藻种sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 尨7柳i/ osiAS sp. PCC7603部分序列已经测定。^朋6a朋a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必7a啦'"o幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋6朋朋sp.PCC7120中的 a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-W7533义在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将M 7a/w'/7os"s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c;xW和链霉亲和 素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-^-c/x^，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能 表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基 蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达HOl。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc州，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cp"在pET30中是在fcoRV和屈o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在《p/71和^711两个酶切位点之间；裂合酶基因a^5"9在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是和J/w I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc州)， 力W在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Afcol和尸st I之间，pc;^在pETDuet-l 中第二个多克隆位点，在AWe I和i7 o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a"5^3R pET30-sa^c/x^和pACYCDuet-力o厶pETDuet-pcj^转入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH 7. 0 的LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例12
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种j朋&e朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必^肌'/7o^as sp. PCC7603部分序列已经测定。sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必^3肌'/ os〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7s/^e/7s sp.PCC7120中的 W75"JJ^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a7J5"JJA在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将M Ja迈i，s〃s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^ (C84S)和 链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒 叫pET30-w(C84S)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大 肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标 记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc州，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5(C84S)在pET30中是在fcoRV和J/ o I两个酶切位点之间， 链霉亲和素基因m在A^"I和《g7II两个酶切位点之间；裂合酶基因aW5339在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是^ 7II和; PCB合成酶基因是2个(力W和 / c^)， Z o7在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在vVco I和尸W I之间，pc州在 pETDuet-l中第二个多克隆位点，在AWe I和J/ o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-a"55M、 pET30-stc/ Ci9(C84S)和pACYCDuet-力o入pETDuet-pc^ 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至OD6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N广亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例13
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种勘a力ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， i/. 2柳i/ os〃s sp. PCC7603部分序列已经测定。J/7a6aey7a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，J/. h加'加s"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋6a朋s sp.PCC7120中的 a^5^^^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a^5^JA在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^7a力a朋asp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c/x^和链霉亲和素基 因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pC0LADuet中，所得质粒叫 pC0LADuet-sa-cpc必链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌 中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pc/A在大肠杆菌中能表达PcyA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因c/ c^拼接后连接到pCOLADuet的fcoR I和 尸"I之间；裂合酶基因s775^39在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是 A^II和i7wl ; PCB合成酶基因是2个(力o/和； ci^)，力o7在pACYCDuet-1中，处于第 一个多克隆位点，在Afco I和尸"I之间，在pETDuet-l中第二个多克隆位点，在AWe I和之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1
混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，
利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-a"5^J义pC0LADuet-^3~cpci9和pACYCDuet-力o厶pETDuet-/ c/j 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至OD6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 2(TC至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例14
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种肋a6ae/7a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M h/M'/K^iAS sp. PCC7603部分序列已经测定。/l朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必^肌'/70SiAs sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将力/7a/^e;73 sp.PCC7120中的 a775^39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-aL 5^3A在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将力朋6朋朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5 (C84S)和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得质粒 叫pCOLADuet-幼-cpc^ (C84S)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后， 在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和 素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01 。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc^，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即链霉亲和素基因ss和脱辅基蛋白基因cpcS(C84S)拼接后连接到pCOLADuet的￡boR I和尸WI之间；裂合酶基因aW5^J^在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位 点是)fe^n禾t] J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力W和； c州)，力o7在pACYCDuet-1中，处 于第一个多克隆位点，在yVcoI和尸stl之间，pcy/!在pETDuet-1中第二个多克隆位点， 在WeI和之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet—aWM朋、pC0LADuet-sa~ c; c5 ( C84S )禾Q pACYCDuet-力oA pETDuet-;x;/力转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此 工程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫 代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20'C至37'C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素 -藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni" 亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋 白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例15
(1)从GeneBank中可以查到，藻种勘a6ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M 7柳i"os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。J朋力ae"a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M h肌'/7o^vs sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋Z^朋a印.PCC7120中的 a7^5^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a^5"J3ft在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将M 7a历i加stA9 sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^和链霉亲和 素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pC0LADuet中，所得质粒叫 pC0LADuet-幼-cpc5，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌 中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-z c^，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcS拼接后连接到pC0LADuet的￡boR I和 尸WI之间；裂合酶基因aW5^J^在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是 5^HI禾Q ; PCB合成酶基因是2个(力W和/ c/力)，/ o7在pACYCDuet-l中，处于第
一个多克隆位点，在I和尸"I之间，pc/力在pETDuet-l中第二个多克隆位点，在We I禾口勘I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-aJ75JJ9、 pCOLADuet-sa~c/x^和pACYCDuet-力o厶pETDuet-pcj^
转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖 苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 2CTC至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例16
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种j朋6雄a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 尨Ja/w'/ os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。j/7a/^e/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必^/w'/70s^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将/I朋tee朋sp.PCC7120中的 aW5^39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a^5J3A在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将;K Ja肌'/JO犯s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5 (C84S)和 链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得 质粒叫pCOLADuet-sa-c; c5 (C84S)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接 后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉 亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pcyA在大肠杆菌中能表达PcyA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cpcMC84S)拼接后连接到pCOLADuet的fcoR I和P"I之间；裂合酶基因aL 5"J^^在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位 点是和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc;^)，力o7在pACYCDuet-1中，处 于第一个多克隆位点，在yfeol和尸"I之间，pcy/I在pETDuet-1中第二个多克隆位点， 在yVofel和之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-a^5^J9、 pCOLADuet-( C84S )禾。pACYCDuet-力o7 、 pETDuet-z^j^转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此 工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至ODe。。为0. 5至0.8，加入异丙基硫 代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37t:振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素 -藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni" 亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋 白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 上述制备方法适用于釆用各种蓝藻中的betal55裂合酶、藻蓝蛋白类脱辅基蛋白、藻 蓝胆素生物合成酶基因或其同源基因以及链霉亲和素基因及其同源基因来制备链霉亲和 素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开的问题，本发明只选用了 GenBank中己公开全序列的蓝藻力朋6朋朋sp. PCC7120和已经部分测序的yK 7柳y/ os"s sp. PCC7603为例对本发明方法加以说明，本领域的技术人员可以根据上述公开的内容采用其 它原料实施本发明。
权利要求
1.一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于包括下述步骤(1)采用基因工程方法，将beta155裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta裂合酶表达质粒；(2)用基因工程方法将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因和链霉亲和素基因拼接后克隆于第二个表达载体中，可以表达链霉亲和素和藻蓝蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；(3)用基因工程方法将PCB生物合成酶基因ho1和pcyA或其同源基因同时克隆于第三个表达载体中或分别克隆于第四个表达载体中，得到PCB合成质粒；(4)将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主菌为大肠杆菌。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的betal55裂合酶基因是指与 力朋6ae朋sp. PCC7120中aWMJ9基因同源的基因。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是 指与^ aZ^e朋sp. PCC7120或屈Ja/z J'/7oms sp. PCC7603中c;x^基因同源的基因。
全文摘要
本发明公开了一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，通过应用藻胆蛋白beta155裂合酶催化藻蓝胆素与链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。藻蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。
文档编号G01N33/52GK101408541SQ20071003077
公开日2009年4月15日 申请日期2007年10月9日 优先权日2007年10月9日
发明者佟顺刚, 明 周, 坤 夏, 赵开弘 申请人:广州天宝颂原生物科技开发有限公司;华中科技大学