专利名称：定量测定人体α－淀粉酶活性的干化学试纸的制作方法
技术领域：
本发明属于体外临床诊断试剂技术领域，具体涉及一种适用于测定人体血液、尿液等的α-淀粉酶活性、胆碱酯酶等生化指标的干化学试纸。
背景技术：
急性胰腺炎是临床上常见的急腹症之一，多见于青壮年。死亡率达5-10％，误诊率也高达60-90％。当发生急性胰腺炎时，胰腺中的淀粉酶进入血液当中，引起血液淀粉酶的升高。一般急性胰腺炎发作后8-12小时，血液中的淀粉酶显著升高。升高持续24-72小时。血液淀粉酶达到正常值3倍以上有诊断价值。尿液中的α-淀粉酶升高较迟，在12-24小时后，持续时间3-5天，达到正常值的2倍以上有诊断意义。尽管测定α-淀粉酶缺乏特异性，但临床上仍然把测定α-淀粉酶的活性作为诊断急性胰腺炎的重要定性指标而普遍应用。
目前测定α-淀粉酶的方法按试剂类型可以分为液体试剂和干化学试剂两种方法。干化学试剂主要应用于急诊室。同液体试剂相比，干化学试剂具有方便、灵活、污染小、操作方便等特点。
目前，临床急诊生化所使用的干化学产品都为国外公司生产，有三种类型的产品。一种是强生公司为代表的多涂层薄膜干片的干化学技术，利用感光胶片的涂层技术将扩散层、反射层、试剂层等试剂涂在透明的支持层上，从支持层的反面测定光密度的变化。
第二类为日本京都公司的干化学技术，其组成为一塑料支持层，一端为反应区包括样品层和试剂层，试剂层为某种织物作为试剂的载体。加样和测试同在上部进行。
第三类为罗氏公司的干化学产品，U.S Pat.No4,604,264它将试剂涂层在多丝的纤维或织物上，全血通过玻璃纤维横向过滤后与上试剂层接触反应，通过上部覆盖一透明的薄膜测定光密度的变化。U.S Pat 6,036,919发明了测定全血的干化学试纸，在一透明的支持层上涂上试剂层和反射层，最上部覆盖一层合成纤维网布作为加样层。
上述这些产品，有的生产工艺复杂，对材料设备要求高，有的可能产生某些缺陷，如在加样端容易产生一定的气泡、过量液体等，加样和测定在同一侧样品可能造成干扰。而且目前应用的干式生化测定仪为大型设备，将所有的生化项目集中在一台机器上测定。如强生VITROS系列(VITROS-250，VITROS-950)半自动及全自动干式生化仪及生化试剂；VITROS-250，950在医院应用较多。当送检的样本数量少时开机不方便。而急诊项目如急腹症需要马上测定，如果有单独的小型机和试纸可以满足急需。这对一些缺乏大型干式生化仪的中小医院意义更大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可减少测量干扰，使用方便的定量测定人体α-淀粉酶的干化学试纸及定量测定设备。
本发明提供的定量测定人体α-淀粉酶的干化学试纸，为长条形，一端为手持区，另一端为测试区，其结构如图1、图2、图3所示。它由上支持层1、下支持层2、扩散层4、试剂层6组成。其中，上支持层1和下支持层2通过自带的胶层粘合在一起；在测试区上支持层1开有加样孔3，下支持层2的对应位置开有测试孔7；扩散层4和试剂层6迭合，设置于加样孔3和测试孔7处的上支持层1和下支持层2之间。
上述结构的干化学试纸，主要用于样品为血清或尿样的测定。如果是全血样品，则在上述的扩散层4和试剂层6之间还设置一过滤层5，以便滤去红细胞。
本发明中，上支持层和下支持层可采用高分子聚合材料，如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯纤维等。其中以聚酯材料为最好。单片支持层的厚度为50-300μm。上下两层规格相同为40×8mm-120×12mm。上、下支持层上的加样孔和测试孔可为圆形孔，直径相同，直径大小为4-10mm。加样孔3用于滴加样品，测试孔7可用于观察测试区颜色的变化和测定光密度的变化。
本发明中，通过加样孔3可将样品直接加到扩散层4中。扩散层4的作用是将测试的样品均一的渗透到下一层中去。适合做扩散层的材料包括各种滤纸、玻璃纤维、无纺布、尼龙膜、合成纤维等。优选合成纤维材料。其中最合适的材料为聚酯纤维或尼龙纤维材料。扩散层4做成网布形式，网布的孔径大小为50-200目，纤维直径为50-400μm。扩散层的材料一般为亲水性质的，这样有利于样品的扩散，也可用表面活性剂进行预处理。
本发明中，过滤层5的作用是过滤红细胞并避免溶血，其材料可以是各种过滤性的膜、高分子材料等，例如各种玻璃纤维材料和专用滤血膜。优选非对称性合成膜，膜的孔径为0.15-10μm。
本发明中，试剂层6称为反应层。加样后，样品中的α-淀粉酶渗透到试剂层发生反应而逐渐显色。适合做试剂层的材料有各种滤纸、无纺布、合成膜或纤维织物。膜类以非对称的膜系列为好。α-淀粉酶分解底物释放的色原标记物直接渗透到膜的测试孔7一侧，在测试孔7一侧进行测定。
本发明中，试剂层6中的试剂包括缓冲体系、底物、辅助酶、激活剂、保护剂、稳定剂等。通常，缓冲体系为HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液，浓度为0.05-1.0M。底物可选用麦芽七糖衍生物，优选人工合成的限定性麦芽七糖衍生物，标记有对硝基苯酚(PNP)，非还原端进行了封闭。底物浓度为1-20mM。添加的辅助酶为α-糖苷酶和/或糖化酶，浓度为0.5-10.0万IU/L。添加的激活剂为氯离子或钙离子，氯离子的浓度为70-150mM，钙离子的浓度为1-10mM。酶的稳定剂为各种多糖类或双糖类，如蔗糖、海藻糖等，重量浓度为0.5-2.0％。保护剂为海藻胶，重量浓度为0.5-2.0％。
为定量测定α-淀粉酶的活性，发明人还研制了反射式分光光度计(另案申请专利)，与本发明干化学试纸配套使用。用该光度计测定试纸反应后在405nm波长下反射光密度的变化。该仪器可以将反应温室内的温度控制在37±0.3℃。计算方法采用速率法，测定在180秒内完成。自动报告和储存实验结果，并打印。
本发明根据淀粉酶作用于底物生成小分子产物对硝基苯酚PNP的特点，采用不对称的膜作为反应层，在孔径大的一端加样，在相反的一面测定，显色的强度高、均匀度好，减少了加样端测定产生的气泡、过量液体、浊度等而造成的干扰，同时制作工艺又比较简单。试纸单独配备一台小型反射式分光光度计，方便测定，适合急诊应用。
图1为本发明的干化学试纸图示。
图2为本发明的干化学试纸剖面图示(测血清或血浆)。
图3为本发明的干化学试纸剖面图示(测全血样本)。
图4为实施例1的测定结果的回归直线方程。
图5为实施例2的测定结果的回归直线方程。
图6为实施例6的测定结果的回归直线方程。
图中标号1为上支持层，2为下支持层，3为加样孔，4为扩散层，5为过滤层，6为测试层，7为测试孔。
具体实施例方式
实施例1上、下支持层采用PVC片，用打孔机打出加样孔3和测试孔7，孔直径为4mm，孔距为8mm，扩散层4采用尼龙网布，试剂层6采用纤维织物，宽度均为8mm，将扩散层4和试剂层6分别粘贴在两块PVC片上，位于加样孔3和测试孔7的处，然后将两块PVC片对合粘贴在一起，加样孔和测试孔的位置对准。将配制好的试剂(酶反应液)用BIO-DOT喷点仪点样，每孔6μl。
酶反应液试剂的配方如下HEPES缓冲液 0.5mM麦芽七糖衍生物10mM
α-糖苷酶5000IU/LNaCl 70mMCa2+5mM海藻胶 2％蔗糖 0.5％将喷点后的试纸放入35-45℃干燥箱中，30-35分钟后取出。用滚刀机将试纸切成8mm宽的纸条，即可用于测定。加样孔3处于试纸的中间位置，测定的样品为用人胰淀粉酶配置的标准品。使用反射式分光光度计进行测定，以反应的斜率回归直线方程，考察线性范围。
所得直线回归方程为Y＝89788x-128.16，R2＝0.9913，在79-1250IU/L之间呈线性。如图4所示。
实施例2上、下支持层采用PET塑料片，用实例1同样方式打出加样孔和测试孔，孔直径为4mm，孔距为8mm，扩散层4采用聚酯网布，试剂层6采用滤纸材料，宽度均为8mm，将它们分别粘贴在两块PET片上，然后两块PET片对合粘贴在一起，加样孔和测试孔位置对准。将事先配制好的试剂(酶反应液)用BIO-DOT喷点仪点样，每孔6μl。
试剂的配方如下磷酸盐缓冲液 0.2mM麦芽七糖衍生物10mMα-糖苷酶 5000IU/L糖化酶10000IU/LNaCl 150mMCa2+5mM海藻胶0.5％蔗糖 2％
将喷点试剂后的试纸放入40℃真空干燥箱中，20分钟后取出。用滚刀机将试纸切成8mm宽的纸条即可用于测定。加样孔位于纸条的中间位置。测定的样品为用人胰淀粉酶配置的标准品，用稀释液倍比稀释。使用反射式分光光度计进行测定。以反应的斜率回归直线方程。
所得直线回归方程为y＝96342x+21.7，R2＝0.9959，线性范围在76-1205IU/L，如图5所示。
实施例3全血样品的测定。选择底板材料及加工规格同实例1。将试剂层材料和滤血材料玻璃纤维按实例1的规格和方式粘贴。两支持层贴好后在玻璃纤维端的加样孔上方的外侧贴扩散层材料尼龙网布。尼龙网的宽度为15mm，两端宽各3mm用聚乙烯胶布贴于支持层上，使网布中央位于加样孔正上方。全血样品在加样孔网布处加入。试剂的配方及试条的加工同实例1。
取定值的高值(2645IU)临床全血样品，用稀释液倍比稀释，每次加样量为12μl，测定反应斜率，计算直线回归方程。
所得直线回归方程为Y＝173571X-224.31，R2＝0.9952.在166-2645IU/L范围内呈线性。如图6所示。
权利要求
1.一种定量测定人体α-淀粉酶活性的干化学试纸，为长条形，一端为手持区，另一端为测试区，其特征在于由上支持层(1)、下支持层(2)、扩散层(4)、过滤层(5)、试剂层(6)组成，其中，上支持层(1)和下支持层(2)通过自带的胶层粘合在一起；在测试区上支持层(1)开有加样孔(3)，下支持层(2)的对应位置开有测试孔(7)；扩散层(4)和试剂层(6)迭合，设置于加样孔(3)和测试孔(7)处的上支持层(1)和下支持层(2)之间。试剂层(6)中的试剂包括缓冲体系、底物、辅助酶、激活剂、保护剂、稳定剂；其中，缓冲体系为HEPES或磷酸盐缓冲液，浓度为0.05-1.0M；底物为麦芽七糖衍生物，还原端标记有对-硝基苯酚，非还原端进行了封闭，底物浓度为1-20mM；辅助酶为α-糖苷酶和/或糖化酶，浓度为0.5-10.0万IU/L；激活剂为氯离子或钙离子，氯离子的浓度为70-150mM，钙离子的浓度为1-10mM；稳定剂为多糖类或双糖类，重量浓度为0.5-2.0％。保护剂为海藻胶，重量浓度为0.5-2.0％。
2.根据权利要求1所述的定量测定人体α-淀粉酶活性的干化学试纸，其特征在于所述的扩散层(4)与试剂层(6)之间还设有过滤层(5)。
3.根据权利要求1或2所述的定量测定人体α-淀粉酶活性的干化学试纸，其特征在于所述的上、下支持层材料为聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯，长条形，厚度为50-300μm，两支持层规格相同，长40-120mm，宽8-12mm；所述加样孔(3)和测试孔(7)为圆孔，直径相同为4-10mm。
4.根据权利要求1或2所述的定量测定人体α-淀粉酶活性的干化学试纸，其特征在于扩散层(4)的材料为尼龙膜、无纺布、玻璃纤维、滤纸或合成纤维材料。
5.根据权利要求4所述的定量测定人体α-淀粉酶活性的干化学试纸，其特征在于所述的扩散层(4)采用合成纤维网布形式，网布的孔径为50-400μm，纤维直径为50-400μm。
6.根据权利要求1或2所述的定量测定人体α-淀粉酶活性的干化学试纸，其特征在于所述的试剂层(6)材料为滤纸、纤维织物、无纺布或非对称性合成膜。
7.根据权利要求2所述的定量测定人体α-淀粉酶活性的干化学试纸，其特征在于所述过滤层(5)的材料为玻璃纤维或滤过膜。
8.根据权利要求1或2所述的定量测定人体α-淀粉酶活性的干化学试纸，其特征在于所述的底物采用人工合成的限定性麦芽七糖衍生物。
全文摘要
本发明属于体外临床诊断试剂技术领域，具体为一种定量测定人体α－淀粉酶活性的干化学试纸。试纸由长条形的上下两支持层及中间各测试层组成，分为手持区和测试区。测试区从上至下依次为扩散层、过滤层、试剂层。扩散层可选用各种合成纤维材料的网格材料，过滤层可选用各种滤血的滤过性材料，试剂层可选用非对称性的合成膜。上支持层上开一加样孔，样品从加样孔进入扩散层后渗透进过滤层和试剂层，在试剂层发生化学反应而发生颜色的改变，通过下支持层的测试孔即可测定反应过程的光密度的变化。该试纸用于定量测定人体样品中的α－淀粉酶活性，为急性胰腺炎的诊断提供依据。
文档编号G01N21/78GK101082622SQ20071004346
公开日2007年12月5日 申请日期2007年7月5日 优先权日2007年7月5日
发明者朱世成, 王缦, 田漪 申请人:上海科华生物工程股份有限公司