专利名称：一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法
技术领域：
本发明涉及物种内的鉴别技术，尤其是涉及一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法。
背景技术：
泥蚶(:Tegi'"srcs ^"a/7oss Linnaeus)俗称血蚶、宁蚶、花蚶、粒蚶，属于 软体动物门(Mollusca),瓣鳃纲(Laraellibranchia)，列齿目(Taxodonta)，蚶科 (Aixidae)动物，主要分布于西太平洋、印度洋和大西洋海域的中国、韩国、泰 国、菲律宾以及马来西亚等国家。在我国分布在山东半岛以南沿海。泥蚶作为水 产业主导经济养殖贝类之一，味道鲜美、营养价值高、深受人们的喜爱，市场需 求量较大，但是不同产地的泥蚶的味道和价格不同，如奉化和乐清的泥蚶血色鲜 红、较淡，而荣成的泥蚶血色红，而广西北海、广东阳江和湛江泥蚶血色暗红， 较深；并且乐清的泥蚶的味道比较鲜美，价格相应较高。
泥蚶雌雄异体，2龄性成熟，成熟后的泥蚶在壳长与壳高的比值上，讪头泥蚶、 湛江泥蚶、韩国泥蚶和荣成泥蚶都相似，在壳表纵肋条数方面它们之间也未见显著性 差异，奉化泥蚶、乐清泥蚶和福鼎泥蚶之间也在壳长、壳高和壳表纵肋条数无显著性差 异，因此单从形态学是很难区分汕头泥蚶、湛江泥蚶、韩国泥船和荣成泥蛇，也难以 区别奉化泥蚶、乐清泥蚶和福鼎泥蚶。另外当受精卵发育为稚贝时，各地的泥蚶的稚 贝基本相似，很难从形态学加以区分，因此给泥蚶的养殖种类的鉴别带来不便。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法，该方法能充 分区别不同海区的泥蚶的种类。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为 一种不同海区泥船的指纹鉴别方 法，特点是通过由所述泥蚶的消化腺组织的特异性蛋白(酶)和由所述的泥蚶的特异性 的DNA序列来鉴别。
对所述的特异性蛋白用下述步骤进行标定
a、选取组织随机选取所述的泥蚶的消化腺组织并称重；
b、 提取酶液把所述的泥蚶的消化腺组织放入玻璃匀浆器中，然后加入重量是所 述的泥蚶的消化腺组织的3倍的0.05%巯基乙醇水溶液，在冰浴条件下制成匀浆液；把 所述的匀浆液放入温度为4。C的冷冻离心机中，用12000 r pm离心30 min，取得上清液， 即为酶液。
c、 电泳在上述酶液加入适量的溴酚兰指示剂，然后用浓度为7 7.5%的聚丙烯 酰胺凝胶电泳，电泳时间为3h 5h。
d、 显色将所述的聚丙烯酰胺凝胶置于染色液中，放在37X:恒温箱中，在所述的 聚丙烯酰胺凝胶上形成显色的条带，随时观察所述的条带的显色结果，至所述的条带显 色清晰为止，然后用7.5%的乙酸固定所述的条带，即为酶带。
所述的特异性蛋白为苹果酸脱氢酶(MDH)，所述的苹果酸脱氢酶的染色液组成为 NAD+ (辅酶I) 16mg、 NBT (四氮硝基唑蓝)16mg、 PMS (酚嗪甲硫酸盐)1,5 mg、 pH 7.0的1M的苹果酸钠5ml、 pH 7.1的0.5M的Tris-HCl溶液(三羟甲基安基甲烷-盐 酸)8ml，用蒸馏水定容至50ml。
所述的特异性蛋白为超氧化物岐化酶(SOD酶)，所述的超氧化物岐化酶的染色液 组成为NBT22mg、 VB20.005g、 Na2-EDTA (乙二胺四乙酸)12 mg和pH8.0的0.05 M的Tris-HCl溶液8ml，用蒸馏水定容至50ml。
对所述的特异性的DNA序列用下述步骤进行标定
e、 取样取所述的泥蚶足部的肌肉组织，剪碎所述的肌肉组织；
f、 提取DNA:用常规方法从剪碎的所述的肌肉组织中提取DNA;
g、 PCR反应扩增用特异性引物对提取的所述的DNA进行PCR反应扩增，得到 所述的PCR反应扩增的产物；
h、 电泳用P/。 1.5。/。的琼酯糖凝胶对所述的PCR反应扩增的产物进行电泳10 20min，在所述的琼酯糖凝胶中加入溴化乙锭，从所述的琼酯糖凝胶中得到特异性谱带；
i、 测序在所述的特异性谱带上测得所述的泥蚶的特异性的DNA序列。 所述的特异性引物为
F: 5' -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3';
R: 3， -GGGTCGATGAAGAACGCAG-5';从上海生工生物工程技术服务有限 公司购得。
与现有技术相比，本发明的优点在于由于通过泥蚶的消化腺组织的特异性蛋白和泥 蚶的特异性的DNA序列来鉴别泥蚶的产地，由于不同海区的泥蚶的消化腺组织内的特异
性蛋白即SOD酶或MDH酶的酶带各有异同，另外不同海区的泥蚶的特异性的DNA序列 也各有其特异性，因此从泥蚶的消化腺组织的特异性蛋白和泥蚶的特异性的DNA序列就 能鉴别泥蚶的产地，便于识别和养殖味美价高的泥蚶。
图1为不同海区的泥蚶的MDH酶带谱表； 图2为不同海区的泥蚶的SOD酶带谱表。
具体实施例方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 实施例1
一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法，随机分别取各海区的泥蚶，然后对每个海区的
泥蚶分别作下述步骤的处理
a、 选取组织随机选取10个浙江乐清泥蚶，分取每个泥蚶的消化腺组织并称重， 得到lg组织；
b、 提取酶液把每个泥蚶的消化腺组织分别放入玻璃匀浆器中，然后加入0.05% 巯基乙醇水溶液3ml，在冰浴条件下制成匀浆液；把匀浆液放入温度为4'C的冷冻离心 机中，用12000 rpm离心30 min，离心结束后提取上清液，上清液即为酶液；
c、 电泳将酶液分成两份，在每份酶液中分别加入适量的溴酚兰指示剂，然后各 自用浓度为7 7.5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳时间为4h,在聚丙烯酰胺凝胶上形成 条带；
d、 将其中一份的聚丙烯酰胺凝胶置于由NBT22mg、 VB20.005g、 Na4-EDTA12mg 和pH8.0的0.05 M的Tris-HCl溶液8ml混合配制，用蒸馏水定容至50ml的染色液中， 放在37'C恒温箱中显色，随时观察条带的显色结果，至条带显色清晰，用7.5%的乙酸 固定条带，IO个浙江乐清泥蚶得到基本相同的SOD酶带；同样方法分别可以得到浙江 奉化泥蚶、福建福鼎泥蚶、山东荣成泥蚶、韩国釜山泥蚶、广东仙头泥蚶和广东湛江泥 蚶等的SOD酶带，综合比较各海区泥蚶SOD酶带，得到图1的各海区泥蚶SOD酶带 的谱表，从图1的各海区泥蚶SOD酶带的谱表中可以看出浙江奉化泥蚶8、浙江乐清泥 蚶5、福建福鼎泥蚶2、山东荣成泥蚶14、韩国釜山泥蚶ll、广东汕头泥蚶3和广东湛 江泥蚶9的SOD酶带各有异同，泥蚶的SOD酶带一般由4-7条，其中湛江和汕头的泥 蚶的SOD酶谱表型较一致，由7条酶带组成，而其他的泥蚶的SOD酶谱表型一致，均 由4条酶带组成，从中就可区分开湛江和油头的泥蚶与荣成和韩国泥蚶的区别；图l中 还有杂交泥蚶的SOD酶带1、 4、 7、 10、 13，广西泥蚶的SOD酶带12、 15和广东阳江 泥蚶的SOD酶带6。
将另一份的聚丙烯酰胺凝胶置于由NAD+16mg、 NBT16mg、 PMS 1.5mg、 pH 7.0 浓度为1M的苹果酸钠5ml和pH 7.1浓度为0.5M的Tris-HCl 8ml混合配制，用蒸馏水 定容至50ml的染色液中，在37i:恒温箱中过夜，使条带显色，随时观察条带的显色结 果，至条带显色清晰为止，次日先用50%的乙酸脱色，然后用7.5%的乙酸固定显色的 条带，从10个浙江乐清泥蚶中得到基本相同的MDH酶带；同样方法分别可以得到浙 江奉化泥蚶、福建福鼎泥蚶、山东荣成泥蚶、韩国釜山泥蚶、广东汕头泥蚶和广东湛江 泥蚶的得到SOD酶带，综合比较各海区泥蚶MDH酶带，得到图2的各海区泥蚶的MDH 酶带的谱表，从图2中各海区泥蚶MDH酶带的谱表中可以看出浙江奉化泥蚶3、浙江 乐清泥蚶4、福建福鼎泥蚶5、山东荣成泥蚶2、韩国釜山泥蚶l、广东汕头泥蚶6和广 东湛江泥蚶7的MDH酶带各有异同，其中各地的泥蚶一般有酶带4条，即酶带a、 c、 d和e，油头和湛江群体的酶带d、 e活性明显高于其它群体，讪头泥蚶多出酶带f，而 湛江泥蚶多出酶带f和b，从中可以区分开汕头泥蚶与湛江泥蚶。
另外用下述步骤对浙江乐清泥蚶、福建福鼎泥蚶、山东荣成泥蚶、韩国釜山泥蚶和 广东湛江泥蚶的特异性的DNA序列进行标定
e、 取样随机选取浙江乐清泥蚶5个，分别取每个泥蚶的足肌肉组织100mg，剪碎；
f、 提取DNA:用常规方法从剪碎的肌肉组织中提取DNA;
g、 PCR反应扩增用从上海生工生物工程技术服务有限公司所购的特异性引物F: 5， -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3'禾卩R: 3' -GGGTCGATGAAGAACGCAG-5'， 对每个泥蚶的提取的DNA进行PCR反应扩增；
h、 电泳用1。/。的琼酯糖凝胶对各自的PCR反应扩增的产物进行电泳1.5h，在琼 酯糖凝胶中加入溴化乙锭，在琼酯糖凝胶中得到特异性谱带；
i、 测序对约500bp的特异性谱带上进行测序，5个浙江乐清泥蚶的特异性的DNA 序列一致；同样方法可以得到福建福鼎泥蚶、山东荣成泥蚶、韩国釜山泥蚶和广东湛江 泥蚶的特异性的DNA序列，综合得到下述的特异性的DNA序列表中结果，从DNA序 列表中可以看出不同海区的泥蚶的DNA序列中碱基对有其特异性，从中就可以区分开 浙江乐清泥蚶、福建福鼎泥蚶、山东荣成泥蚶、韩国釜山泥蚶和广东湛江泥蚶。
这样通过泥蚶的MDH酶带特征、泥蚶的SOD酶带特征和泥蚶的特异性的DNA序 列特征就可以鉴别泥蚶的产地。
序列表
1、 DNA序列的测定由宝生物工程(大连)公司(TaKaRa)测序号为8G，测序样品位 PCR产物。
2、 测序反应试剂及测序仪
领ij序反应AB1 PRISM TM Terminator Cycle Sequencing Ready Rection Kit with AmpliTaq DNA Polymerase, FS (AppliedBiosystems) 测序仪AB1 PRISM TM 377XL DNA Sequencer
3、 测序使用引物
F Primer CM13-47) CGCCA GGGTT TTCCC AGTCA CGAC R Primer (RV-M) GAGCG GATAA CAATT TCACA CAGG T7 Promoter Primer TAATA CGACT CACTA TAGGG T3 Promoter Primer ATTAA CCCTC ACTAA AGGGA A SP6 Promoter Primer CATAC GATTT AGGTG ACACT ATAG
4、 结果
共测序5个样品，进行11次反应
5、 样品
ZG4448:山东荣成泥蚶；ZG4449:韩国釜山泥蚶；ZG4450:浙江乐清泥蚶； ZG4451:广东湛江泥蚶；
ZG4452:福建福鼎泥蚶。
样品ZG4449和ZG4452克隆后测序。
6、 DNA
山东荣成泥蚶
CGAGGTGGGTGAATTAATGTGAATTGGAGGACAGATTGAAGATCGATATCTTGAAGGCAC 60 ATTGCAGCTTCGGGTGACTCCCGGAGCAACGCCTGTCTGAGGGTGGGTTAAACAACCATG 120 GCAAAACGAATTGGTTTGCGCATAGAGGGTGTGGTGGTGTGGGG—GGGGTT---GTTTN 175 CGTCCGTAAAAAGGTCGGCCTAAGTATTTCGTGGAT—TCGGTGTGTGTTTTGTAGCAGT 233 GGGGATGTGCC—GGAGAGAGGTAGGTCG-GTGTATGTGGAGTCTTACGGTCTTTCGTGC 290 ATGCTCGCTTGGATGCTTGCGAAGAAATAGAGGATCAACAGCGATTACATCGGGAAANTA 350 AAAA-GTGGAAGAGGGGCTGGTCGTTTGT-GGAAAGGGGGGCACCGA--GACTTTATTTT 406 —TCTTGATCCGACGTGAGATCAGAGGAGATTAGGCGCTGAATTTAAGGATATGAGTAAG 464 CGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTGTCGTAGTAAGGG-------- 503
韩国釜山泥蚶
CCAGCTGGGTGAATTAATGTGAATTGCAGGACAGATTGAACATCGATATCTTGAAGGCAG 60
ATTGGAGGTTCGGGTCACTGGCGGAGCAAGGCCTGTCTGAGGGTCGGTTAAATAACCATC 120 GCAAAACGAATTGGTTTGCGCATAGAGGCTGTCGTGGTCTGGGG—CGGGA——CTTTG 174 GGCGCGTAAAAACGTCGCCCTAAGTATTTCGTCGAT—TCGGTGTGTGTTTTCTAGCAGT 232 GCCCATCTGGC--GGAGAGAGGTAGGTCG-GTGTATGTGGAGTCTTAGGCTGTTTCGTGC 289 ATGCTCGCTTGGATGCTTGCGAAGAAATAGGGGATCAACACCGATTACATCGGGCAAAAA 349 AAAA-GTGCGAGAGGGGCTCGTGGTTTGT-CGAGAGGGCGGCCCCGA-ACTTGTGATTTT 406 --TCTTGATCGGACGTGAGATCAGACGAGATTACGCGCTGAATTTAAGGATATCACTAAG 464 CGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCTCGTAGTAACGG------- 503
浙江乐清泥蚶
GGAGCTGCGTGAATTAATGTGAATTGCAGGACACATTGAACATCGATATCTTGAACGCAC 60 ATTGCAGGTTGGGGTCACTCCCGGAGGAAGGCCTGTCTGAGGGTGGGTTAAATAAGCATG 120 GGAAAAGGAATTGGTTTGGGCATAGAGGCTGTGGTGGTCTGGGG—GGGGA——GTTTC 174 CCGCCCTAAAAACGTCGCCCTAAGTATTTCGTGGAT--TCGGTGTCTGTTTTCTAGCAGT 232 GCCCATCTGGC--GGAGAGACGTAGGTCG-GTGTATGTCGAGTCTTACGCTCTTTCGTGG 289 ATGCTCGCTTGGATGGTTGCGAAGAAATAGGGGATCAAGACGGATTACATCGGGCAAAAA 349 AAAAAGTTGGAGAGGGGGTCGTCGTTTGT-CGAGACGGGGGGCCCGA-ACTTGTCATTTT 407 --TCTTCATGCGAGCTCAGATGAGAGGAGA丌ACGGGCTGAATTTAAGGATATCAGTAAG 465 CGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCTCGTAGTAACGG---------------------504
福建福鼎泥蚶
GGAGGTGGGTGAATTAATGTGAATTGCAGGAGACATTGAACATGGATATCTTGAACGCAC 60
ATTGGAGCTTGGGGTGAGTGCCGGAGCAAGGCGTGTGTGAGGGTCGGTTAAATAACCATG 120
GGAAAACGAATTGGTTTGCGCATAGAGGGTGTGGTGGTCTGGGGGGCGGGAGTTATTCCT 180
CCGGGTTAATTAGGTGGGCCTAAGTATTTGGTCGAT—TGGGTGTGTCTTTTCTAGCAGT 238
GGGGATCTGGG--GGAGAGACGTAGCTGG-GTGTATGTCGAGTCTTAGGGTGTTCGGTGC 295
ATGCTGGCTTGGATGGTTGCGAAGAAATAGGGGATCAACACGGATTAGATGGGGAAAAAA 355
--------CAAGAGGAGGTCGCCGTTTGT-GGAAAGGGCGGCCCCGAGAGTTGTGATTTT 406
CTTGGTCATCGGAGCTCAGATCAGACGAGATTACCGGCTGAATTTAAGCATATGACTAAG 466
CGGAGGAAAAGAAAGTAACCAGGATTGTCGTAGTAAGGG--------------------- 505
广东湛江泥蚶
CCAGCTGCGTGAATTAATGTGAATTGCAGGAGACATTGAAGATCGATATCTTGAACGCAG 60
ATTGGAGCTTCGGGTCAGTCGGGGAGCAACGCCTGTCTGAGGGTCGGTTAAATAACGATG 120
GCAAAACGAATTCGTTTGCGCATAGAGGCTGTCGTGGTCTGGGNGGCGGGAGTTATTCCT 180
GCCCCTTAATTACGTCGCCCTAAGTATTTCGTCGAT—TCGGTGTCTCTTTTCTAGGAGT 238
GCGCATCTGCG—GGAGAGACGTAGGTCG-GTGTATGTCGAGTCTTACGGTGTTCCGTGC 295
ATGCTCGCTTGGATGCTTGCGAAGAAATAGGGGATCAAGACGGATTACATCGGGAAAAAA 355
A-------CAAGAGGAGCTCGGGGTTTGT-GGAAACGGGGGCNGCGACAGTTGTCATTTT 407
CTTCTTCATCCGACCTGAGATCAGAGGAGATTACGCGGTGAATTTAAGCATATCACTAAG 467
CGGAGGAAAAGAAAGTAAGCAGGATTCTGGTAGTAACGG--------------------- 50权利要求
1、一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法，其特征在于由所述的泥蚶的消化腺组织的特异性蛋白和由所述的泥蚶的特异性的DNA序列来鉴别。
2、 如权利要求l所述的一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法，其特征在于对所述的 特异性蛋白用下述步骤进行标定a、 取样随机取所述的泥蚶的消化腺组织并称重；b、 提取酶液把所述的泥蚶的消化腺组织放入玻璃匀浆器中，然后加入重量是所述的泥蚶的消化腺组织的3倍的0.05%巯基乙醇水溶液，在冰浴条件下制成匀浆液；把 所述的匀浆液放入温度为4'C的冷冻离心机中，用12000 rpm离心30 min，取得上清液， 即为酶液；c、 电泳在所述的酶液中加入适量的溴酚兰指示剂，然后用浓度7 7.5%的聚丙 烯酰胺凝胶电泳，电泳时间为3h 5h;d、 显色将所述的聚丙烯酰胺凝胶置于染色液中，放在37'C恒温箱中，在所述的 聚丙烯酰胺凝胶上形成显色的条带，随时观察所述的条带的显色结果，至所述的条带显 色清晰为止，然后用7.5%的乙酸固定所述的条带，即为酶带。
3、 如权利要求2所述的一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法，其特征在于所述的特 异性蛋白为苹果酸脱氢酶，所述的染色液由NAD+16mg、 NBT16mg、 PMS 1.5 mg、 pH 7.0 浓度为1M的苹果酸钠5ml、和pH 7.1浓度为0.5M的Tris-HCl溶液8ml混合配制，用 蒸馏水定容至50ml。
4、 如权利要求2所述的一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法，其特征在于所述的酶 特异性蛋白为超氧化物岐化酶，所述的染色液由NBT22mg、 VB20.005g、 Na4-EDTAi2 mg和pH8.0的0.05 M的Tris-HCl溶液8ml混合配制，用蒸馏水定容至50ml。
5、 如权利要求l所述的一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法，其特征在于对所述的 特异性的DNA序列用下述步骤进行标定e、 取样从所述的泥蚶中摘取肌肉组织，剪碎所述的肌肉组织；f、 提取DNA:用常规方法从剪碎的所述的肌肉组织中提取DNA;g、 PCR反应扩增用特异性引物对提取的所述的DNA进行PCR反应扩增，得到 所述的PCR反应扩增的产物；h、 电泳用1。/。 1.5。/。的琼酯糖凝胶对所述的PCR反应扩增的产物进行电泳10 20min，在所述的琼酯糖凝胶中加入溴化乙锭，从所述的琼酯糖凝胶中得到特异性谱带;i、 测序在所述的特异性谱带上测定所述的泥蚶的特异性的DNA序列。
6、如权利要求5所述的一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法，其特征在于所述的特异性引物为F: 5' -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3'; R: 3' -GGGTCGATGAAGAACGCAG-5'。
全文摘要
本发明公开了一种不同海区泥蚶的指纹鉴别方法，由泥蚶的消化腺组织的特异性蛋白和由泥蚶的特异性的DNA序列来鉴别，由于不同海区的泥蚶的消化腺组织内的特异性蛋白，SOD酶和MDH酶的酶带各有异同，另外不同海区的泥蚶的特异性的DNA序列也各有其特异性，因此从泥蚶的消化腺组织的特异性蛋白和泥蚶的特异性的DNA序列就能鉴别泥蚶的产地，便于识别和养殖味美价高的泥蚶。
文档编号G01N21/25GK101173892SQ20071006770
公开日2008年5月7日 申请日期2007年3月19日 优先权日2007年3月19日
发明者李太武, 苏秀榕 申请人:宁波大学