专利名称：：复合保护剂及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于胶体金免疫检测试纸产品保藏的辅助剂范围，特别涉及一种用于氯霉素速测金标试纸条的复合保护剂。
背景技术：
：金免疫层析技术是胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以微孔滤膜为载体的快速固相膜免疫分析技术，现已广泛应用于生物医学、动植物检疫、食品安全监督等诸多领域。20世纪90年代以来，胶体金免疫层析快速诊断试纸条(简称金标试纸条)的研究发展迅速，大多用于检测各种病原菌、人体微量蛋白、抗体等生物大分子物质，也有一些用于检测小分子物质，如滥用药物、毒品、兴奋剂等。此外，金标试纸条以其简便、快速、准确和无污染的特点，在农产品安全质量监控领域中日益发挥出显著优势，它不仅适用于专业人员大规模地对农产品中药物残留进行现场监测和筛检，也适用于农产品行业个体户、企业乃至家庭进行自检，可见有着广阔的应用前景。目前，市售兽药、农药残留检测的金标试纸条比较少见，究其原因主要有胶体金免疫层析分析作为一种新型的快速诊断技术，用于检测兽药、农药小分子化合物的研究尚且不多；出于商业保密，国内外对金标试纸产品保藏的辅助剂报道也较少；金标试纸条的可靠性和持效性，涉及到膜固相上结合的蛋白质类物质的稳定性问题，这也是该类检测产品商业化发展的主要瓶颈之一。近些年来，随着蛋白质制品的稳定性研究逐步深入，国内外报道指出常见的蛋白质保护剂有以下几类多羟基化合物、糖类、氨基酸、聚合物、异源蛋白质及表面活性剂。这些保护剂对蛋白质的稳定机制比较复杂，目前报道较多的是关于它们在蛋白质冷冻干燥过程中保护作用的机制研究。尤其在干燥及贮藏过程中，环境条件易引起蛋白质变性失活，添加一些辅料可稳定蛋白质结构。用来解释此干燥保护机制的假说主要有两种"玻璃态"假说和"水替代"假说，其推论依据都是基于药液实现了部分或全部玻璃化固定，且辅料分子与蛋白质药物形成氢键，使其在缺水状态下仍能维持活性结构。一个优良的蛋白质保护剂应具备多种保护特性，如玻璃化温度高、吸湿性差、结晶率低和不含还原基，但任何单一保护剂都不可能包含所有的保护特性，因此要使用两种或多种保护剂才能获得更显著的保护效果。当前，氯霉素残留问题仍受到人们的高度重视，研发稳定可靠、灵敏度高的氯霉素速测金标试纸条有着深远的实际意义。氯霉素属小分子化合物，采用竞争性金免疫层析法进行诊断，故检测试纸条上含有的主要生化试剂是结合垫上包被的抗氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物(简称金标抗体)，硝酸纤维素膜(NC膜)测试带(T带)上包被的氯霉素-卵清蛋白偶联物和质控带(C带)上包被的羊抗鼠IgG。这些物质尤其是抗体分子的稳定性，很大程度上决定了试纸条的货架寿命。抗体属热敏性蛋白，其失活速度直接决定于暴露温度，因而研究稳定蛋白的方法和测量试纸条的货架寿命，即保持最初活性90%的持续时间，很是重要。对该试纸条添加辅助剂，即是改善上述三类蛋白质的稳定性能，以保护各自在膜固相上的活性结构，从而解决氯霉素金标试纸条的保存期问题。目前现有的氯霉素速测金标试纸条在04'C保存期一般为312个月，尚不能完全满足生产的需要。关于氯霉素金标试纸条研制的专利已有一些，但都未涉及产品保护剂的内容；其次，在小分子化合物速测金标试纸的同类产品中，尚未对保护剂问题进行报道；再者，国外有学者提出单一保护剂用于大分子物质诊断的金免疫测试条，但对于不同保护剂组合的协作效应没有指明。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种成本较低、使用方便的复合保护剂，使用该复合保护剂能使氯霉素速测金标试纸条在0-4。C保存期延长至2年以上。为了解决上述技术问题，本发明提供一种复合保护剂，是由糖类、高分子聚合物、蛋白质和防腐剂溶解在缓冲溶液中形成的溶液，糖类、高分子聚合物、蛋白质和防腐剂在所述溶液中的浓度分别是l20g/100mL、0.05~2.0g/100mL、0.1-2g/100mL禾口0.0050.1g/100mL。作为本发明的复合保护剂的改进糖类为蔗糖和海藻糖中的至少一种，高分子聚合物为聚乙烯吡咯烷酮(PVP，40000)、聚乙二醇(PEG，20000)和吐温(Tween20)中的至少一种，蛋白质为牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)中的至少一种，防腐剂为叠氮钠和硫柳汞中的至少一种。作为本发明的复合保护剂的进一步改进，是由蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙二醇、吐温、牛血清白蛋白和叠氮钠溶解在缓冲溶液中形成的溶液，蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙二醇、吐温、牛血清白蛋白和叠氮钠在溶液中的浓度分别是210g/100mL、1~5g/100mL、00.5g/100mL、0~0.3g/100mL、0.05~0.2g/100mL、0.5~2g/100mL和0.01~0.1g/100mL。作为本发明的复合保护剂的进一步改进，是由蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐温、牛血清白蛋白和硫柳汞溶解在缓冲溶液中形成的溶液，蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐温、牛血清白蛋白和硫柳汞在溶液中的浓度分别是210g/100mL、1~5g/100mL、0~0.5g/100mL、0~0.3g/100mL、0.05~0.2g/100mL、0.5-2g/100mL和0.01~0.1g/100mL。作为本发明的复合保护剂的进一步改进，缓冲溶液为由磷酸二氢钾(KH2P04)、无水磷酸氢钠(NaHP04)、氯化钠(NaCl)和氯化钾(KC1)溶解在蒸馏水中形成的磷酸盐缓冲液(PBS)，磷酸二氢钾、无水磷酸氢钠、氯化钠和氯化钾在所述磷酸盐缓冲液中的浓度分别是0.27g/L、1.14g/L、8.00g/L和0.20g/L。本发明还提供了上述复合保护剂的用途用于保护氯霉素速测金标试纸条。具体制作方法如下1)、将一定量的金标抗体溶解在一定量的复合保护剂中形成溶液，在结合垫上喷洒该溶液、或者将结合垫浸渍于溶液中，要求能使结合垫浸透溶液；再将上述浸透溶液的结合垫真空冷冻干燥、或晾干、或低温(不超过60'C)烘干，以达到保护固定在结合垫上的金标抗体的目的；2)、将人工抗原和二抗溶解在缓冲溶液中，划线于NC膜上后晾干或低温(不超过6(TC)烘干后，通过层析的方法使复合保护剂均匀分布于NC膜上，再晾干或低温(不超过6(TC)烘干(lh)，以达到保护固定在膜上的人工抗原和二抗的目的。3)将上述结合垫及NC膜等切条组装成试纸条。为了证明本发明的复合保护剂具有保护氯霉素速测金标试纸条的功能，发明人对上述经复合保护剂处理后的试纸条作了如下验证实验将上述试纸条分别置于37。C和6CTC下干燥贮存一定的时间，考査试纸条的有效颜色信号及检测灵敏度。结果表明，经本发明的复合保护剂处理后的氯霉素金标试纸条能保持有效颜色信号分别达30天和10天，且检测灵敏度不变。因此，可据此推算该试纸条在0~4'C保存期至少为2年。在上述同样的实验条件下，常规的氯霉素金标试纸条(即没有经过复合保护剂处理的)能保持有效颜色信号分别只有3天和1天；在相应的30天或10天后检测，试纸条已经完全失效。因此，本发明的复合保护剂用于氯霉素速测金标试纸条，能实现对氯霉素金标试纸条上的抗原、抗体的保护，可有效地延长试纸条在04'C干燥条件下的保存期。复合保护剂中的防腐剂具有阻止霉菌等微生物的滋长的功能。本发明的复合保护剂可望在兽药、农药小分子化合物的胶体金免疫层析快速检测及产品开发中得到推广应用。具体实施方式实施例l、一种复合保护剂，按照以下步骤制得-(1)、PBS缓冲溶液的配制KH2P04:0.27g、无水NaHP(V.1.14g、NaCl:8.00g禾HKCl:0.20g，以蒸馏水溶解并定容至1L。(2)、复合保护剂的配制蔗糖10.00g，海藻糖5.00g，PEG(20000):0.05g，BSA:l.OOg，Tween-20:0.05g，叠氮钠O.Olg，以PBS缓冲溶液溶解并定容至100mL。将上述复合保护剂用于保护氯霉素速测金标试纸条，具体制作方法如下(1)氯霉素金标抗体的处理取5mL经处理的胶体金液，加入250(ig氯霉素单克隆抗体，混匀，多次离心、洗涤纯化后，分离得到金标抗体沉淀物。取复合保护剂lmL，重悬该氯霉素金标抗体，得到金标抗体浓缩液。将预先处理好的结合垫浸渍在上述金标抗体浓缩液中，再将上述浸透溶液的结合垫迅速真空冷冻干燥后备用；(2)NC膜的处理将人工抗原和二抗溶解在缓冲溶液中，划线于NC膜上后晾干或低温(不超过60'C)烘干；将上述划有T线(人工抗原)和C线(二抗)的NC膜黏附在PVC背衬底板上，在T带和C带上分别包被好氯霉素半抗原--卵清蛋白偶联物(或氯霉素半抗原一牛血清蛋白偶联物)和羊抗鼠IgG后，晾干，再将NC膜的T端浸入复合保护剂中(NC膜浸入液体中不超过2mm)，通过层析的方法使复合保护剂均匀分布于NC膜上，待膜上层析液的上沿超过膜的C线后，取出NC膜，晾干或低温(不高于60。C)下烘干(lh)。(3)试纸条的组装将上述结合垫、预先处理好的样品垫、吸水垫等按常规金标试纸条的组装方法粘贴于NC膜的PVC衬板上，切成2-3mm的条状，即制备得到氯霉素金标试纸条。将制备得到的氯霉素金标试纸条，进行如下加速贮存试验，具体如下将本发明的氯霉素金标试纸条置于37'C和6(TC下恒温干燥贮存；同时，以新制备的未经本发明复合保护剂处理的金标试纸条作为对照。间隔一定的时间后测定试纸条的活性(以显色程度及检测灵敏度表示)，结果见表l、表2。表l、氯霉素金标试纸条加速贮存试验<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注显色线红色深浅用"*"多少表示强弱，"/"表示几乎不显红色，另外C线不显红色表示试纸条失效。表2、氯霉素金标试纸条检测灵敏度试验试纸条氯霉素标准溶液浓度(ng/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注氯霉素标准溶液浓度分别为0，1，2，4，8ng/mL，以PBS缓冲溶液配制。检测结果阴性(用"-"表示)T带颜色与C带颜色接近；阳性(用"+"多少表示强弱)T带颜色明显浅于C带颜色，强阳性为T带不显红色。通过加速贮存试验说明，经添加复合保护剂的氯霉素金标试纸条在37'C和6(TC下分别恒温干燥存放30天和10天后，仍能保持原来的活性，显色基本不变，且氯霉素金标试纸条的检测灵敏度试验前后没有变化。未经保护剂处理的的试纸条，在37'C和6(TC下分别恒温干燥存放3天和1天，显色变弱，30天和10天后已经失效。实施例2、一种复合保护剂，按照以下步骤制得-(1)、PBS缓冲溶液的配制KH2P04:0.27g，无水NaHP04:1.14g，NaCl:8.00g，KC1:0.20g，以蒸馏水溶解并定容至1L。(2)、复合保护剂的配制蔗糖5.00g，海藻糖2.00g，BSA:0.50g，PVP(40000):0.25g，Tween-20:0.05g，叠氮钠O.Olg，以PBS缓冲溶液溶解并定容至100mL。将上述复合保护剂用于保护氯霉素速测金标试纸条，具体制作方法同实施例1。将制备得到氯霉素金标试纸条，进行加速贮存试验，试验方式同实施例1。具体结果见表3、表4。表3氯霉素金标试纸条加速!fc存试验<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注显色线红色深浅用"*"多少表示强弱，"/"表示几乎不显红色。另外c线不显红色表示试纸条失效。表4氯霉素金标试纸条检测灵敏度试验<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注氯霉素标准溶液浓度分别为0，1，2，4，8ng/mL，以PBS缓冲溶液配制。检测结果阴性(用"-"表示)T带颜色与C带颜色接近；阳性(用"+"多少表示强弱)T带颜色明显浅于C带颜色，强阳性为T带不显红色。通过加速贮存试验说明，经添加复合保护剂的氯霉素金标试纸条在37'C和60'C下分别恒温干燥存放30天和IO天后，仍能保持原来的活性，显色基本不变，且氯霉素金标试纸条的检测灵敏度试验前后没有变化。未经保护剂处理的的试纸条，在37'C和6(TC下分别恒温千燥存放3天和1天，显色变弱，30天和IO天后己经失效。实施例3、一种复合保护剂，按照以下步骤制得(1)、PBS缓冲溶液的配制KH2P04:0.27g，无水NaHP04:1.14g，NaCl:8.00g，KC1:0.20g，以蒸馏水溶解并定容至1L。(2)、复合保护剂的配制蔗糖10.00g，BSA:0.25g，PVP(40000):0.10g，PEG(20000):0.05g，Tween-20:0.2g，叠氮钠0.005g，以PBS缓冲溶液溶解并定容至100mL。将上述复合保护剂用于保护氯霉素速测金标试纸条，具体制作方法同实施例1。将制备得到氯霉素金标试纸条，进行加速贮存试验，试验方式同实施例1。具体结果见表5、表6。表5氯霉素金标试纸条加速贮存试验<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注显色线红色深浅用"*"多少表示强弱，"/"表示几乎不显红色。另外c线不显红色表示试纸条失效。表6氯霉素金标试纸条检测灵敏度试验<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注氯霉素标准溶液浓度分别为0，1，2，4，8ng/mL，以PBS缓冲溶液配制。检测结果阴性(用"-"表示)T带颜色与C带颜色接近；阳性(用"+"多少表示强弱)T带颜色明显浅于C带颜色，强阳性为T带不显红色。通过加速贮存试验说明，经添加复合保护剂的氯霉素金标试纸条在37"C和6(TC下分别恒温干燥存放30天和IO天后，仍能保持原来的活性，显色基本不变，且氯霉素金标试纸条的检测灵敏度试验前后没有变化。未经保护剂处理的的试纸条，在37'C和6(TC下分别恒温干燥存放3天和1天，显色变弱，30天和10天后己经失效。实施例4、一种复合保护剂，按照以下步骤制得(1)、PBS缓冲溶液的配制同实施例l。(2)、复合保护剂的配制蔗糖2.00g，海藻糖3.00g,BSA:2g,PVP(40000):0.5g，PEG(20000):0.3g，Tween-20:0.lg，硫柳汞O.lg，以PBS缓冲溶液溶解并定容至100mL。将上述复合保护剂用于保护氯霉素速测金标试纸条，具体制作方法同实施例l。实施例5、一种复合保护剂，按照以下步骤制得(1)、PBS缓冲溶液的配制同实施例l。(2)、复合保护剂的配制蔗糖l.OOg，PVP(40000):2g，OVA:O.lg，硫柳汞0.05g，以PBS缓冲溶液溶解并定容至100mL。将上述复合保护剂用于保护氯霉素速测金标试纸条，具体制作方法同实施例l。实施例6、一种复合保护剂，按照以下步骤制得(1)、PBS缓冲溶液的配制同实施例1。(2)、复合保护剂的配制海藻糖20.00g，Tween-20:0.05g，BSA:1.5g，硫賴P荥O.lg，以PBS缓冲溶液溶解并定容至100mL。将上述复合保护剂用于保护氯霉素速测金标试纸条，具体制作方法同实施例l。将上述实施例46按照实施例1的方式进行加速贮存试验。通过加速贮存试验说明，经添加复合保护剂的氯霉素金标试纸条在37'C和6(TC下分别恒温干燥存放30天和10天后，仍能保持原来的活性，显色基本不变，且氯霉素金标试纸条的检测灵敏度试验前后没有变化。未经保护剂处理的的试纸条，在37。C和60。C下分别恒温干燥存放30天和10天后已经失效。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。权利要求1、一种复合保护剂，其特征为是由糖类、高分子聚合物、蛋白质和防腐剂溶解在缓冲溶液中形成的溶液，糖类、高分子聚合物、蛋白质和防腐剂在所述溶液中的浓度分别是1～20g/100mL、0.05～2.0g/100mL、0.1～2g/100mL和0.005～0.1g/100mL。2、根据权利要求l所述的复合保护剂，其特征是所述糖类为蔗糖和海藻糖中的至少一种，高分子聚合物为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和吐温中的至少一种，蛋白质为牛血清蛋白和卵清蛋白中的至少一种，防腐剂为叠氮钠和柳硫汞中的至少一种。3、根据权利要求2所述的复合保护剂，其特征为是由蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐温、牛血清白蛋白和叠氮钠溶解在缓冲溶液中形成的溶液，蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐温、牛血清白蛋白和叠氮钠在所述溶液中的浓度分别是210g/100mL、0~5g/100mL、00.5g/100mL、0~0.3g/100mL、0.05~0.2g/100mL、0.252g/100mL和0.005~0.1g/100mL。4、根据权利要求2所述的复合保护剂，其特征为是由蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐温、牛血清白蛋白和柳硫汞溶解在缓冲溶液中形成的溶液，蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐温、牛血清白蛋白和柳硫汞在所述溶液中的浓度分别是210g/100mL、0~5g/100mL、0~0.5g/100mL、0~0.3g/100mL、0.05~0.2g/100mL、0.252g/100mL和0.005~0.1g/100mL。5、根据权利要求3或4所述的复合保护剂，其特征是所述缓冲溶液为由磷酸二氢钾、无水磷酸氢钠、氯化钠和氯化钾溶解在蒸馏水中形成的磷酸盐缓冲液，磷酸二氢钾、无水磷酸氢钠、氯化钠和氯化钾在所述磷酸盐缓冲液中的浓度分别是0.27g/L、1.14g/L、8.00g/L和0.20g/L。6、如权利要求15中任意一种复合保护剂的用途，其特征在于用于保护氯霉素速测金标试纸条。全文摘要本发明公开了一种复合保护剂，是由糖类、高分子聚合物、蛋白质和防腐剂溶解在缓冲溶液中形成的溶液，糖类、高分子聚合物、蛋白质和防腐剂在溶液中的浓度分别是1～20g/100mL、0.05～2.0g/100mL、0.1～2g/100mL和0.005～0.1g/100mL。本发明的复合保护剂用于保护氯霉素速测金标试纸条，能使试纸条在0～4℃的保存期延长至2年以上。文档编号G01N33/53GK101118238SQ20071007101公开日2008年2月6日申请日期2007年8月29日优先权日2007年8月29日发明者朱国念,挺杨,王姝婷,王美英,郭逸蓉申请人:浙江大学;宁波市农业科学研究院