发现传统医药免疫调节作用的检测及筛选平台的制作方法

文档序号:6128040

专利名称::发现传统医药免疫调节作用的检测及筛选平台的制作方法发现传统医药免疫调节作用的检测及筛选平台
背景技术
传统医药如传统的中药的应用,可以追溯到五千多年前。历经多个世纪的研究和实践,传统医药医师发现数千种植物和其它的自然产物具有特殊的医疗效果。很多传统医药的原理是加强身体的免疫防御系统以攻克疾病或预防疾病的形成。传统中医理论相信,疾病发作是源于身理上某些欠缺的形成。所以,扶正治疗是TCM其中一个主要的原理,意为在各类疾病中"促进或加强自然宿主的防御机制"。近年来,传统医药在免疫系统方面的正面效果已得到证实。但是,根据传统的医疗实践,一种特定成分治疗一种特定的疾病的疗效,要待至病人服用了这个特定成分并对疗效结果进行分析后才能得知。因而应用于传统医药的检测及筛选方法将有助于医师在给病人服用特定成分之前就能了解该成分的疗效。蛋白组学是指研究一个细胞/组织/器官内所有蛋白质的特性,如表达水平、翻译后修饰、蛋白与蛋白相互作用等,从而获得一个完整和综合的蛋白质水平的疾病过程、细胞过程和网络的概念。研究蛋白组学的目的是了解细胞或组织来源的蛋白质。可以通过对患病和健康样本进行比较而进行。目前分析蛋白组分两个阶段进行第一,对"正常"状态下的特定有机体、组织或细胞表达的蛋白质进行鉴定,和其在双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D)的定位;第二,测定在对应生理/疾病状态发生变化时蛋白组的变化。在现有技术中,蛋白组学已经应用于提供一个细胞或组织的蛋白质谱,可以比较健康和疾病状态的蛋白质之间的区别用于寻找药物或药物靶标。蛋白组学也已经用作分析药物候选物的潜在用途。肿瘤坏死因子(TNF-a)于1975年被MemorialSloan-KetteringCancerCenter的LloydOld及其同事们发现并被确认为是一种具有抗癌活性的活性成分。TNF-a的主要细胞来源是LPS激活的单核吞噬细胞。TNF-a引起肿瘤体外出血性坏死并表现出体外抗癌细胞的细胞毒性。TNF-a其他的生物学功能包括能够引起内皮细胞表达新的表面受体,该受体使内皮细胞表面变得对白细胞具有粘附性,先是对嗜中性粒细胞之后是对单核细胞和淋巴细胞具有粘附性,并激活炎性白细胞杀死细菌和激活嗜中性粒细胞,以及刺激其它的单核吞噬细胞产生细胞因子,如IL-1、IL-6、TNF-a和趋化因子。千扰素(IFN)是一种众所周知的具有高效力的细胞因子,具有免疫系统之内和之外的多种生理功能。IFN-y是由胸腺来源(T)细胞在激活状态下分泌的,IFN-y也可以由自然杀伤细胞分泌而来。IFN已知能够诱导酶的合成,该酶直接导致大量活性氧离子的爆发,使巨噬细胞杀死肿瘤细胞。IFN-y其他性能包括,它是单核吞噬细胞有效力的激活剂、增加I级MHC分子的表达、促进细胞和体液体内免疫反应、直接作用于T-和B-淋巴细胞促进分化、促进CD4+T细胞的分化、成为用于CD8+CTLs成熟作用的细胞因子之一,和激活嗜中性粒细胞。一氧化氮(NO)是存在于多种哺乳动物细胞内的一种多功能分子,参与广泛的生理学和病理生理学过程,如血管舒张、神经传递、杀肿瘤和细菌活动和免疫抑制。一氧化氮是被称为一氧化氮合成酶(NOS)的酶家族使用精氨酸作为底物合成的。细胞因子可诱导的形式,iNOS,是由许多免疫系统产生的刺激而激活的,如IFN-y、TNF-a和LPS,并且催化可以成为细胞毒素的NO的大量生成。以前的工作表明巨噬细胞释放出的NO是杀细菌和杀肿瘤活动的介体。NO显示与几种诱导凋亡的信号转换机制有关,例如,iNOS的诱导导致NO的积聚,引起凋亡典型的形态学和生物化学上的改变,包括半胱天冬酶-3的激活和多ADP-核糖聚合酶(PARP)的退化。具有免疫调节作用的医用品和/或药物候选物能够刺激抗肿瘤因子如IFN-y、TNF-a、iNOS的生成。按照传统医药的体外应用,确定和检测这种细胞因子能够建立将所述药物作为一种抗肿瘤工具的潜在用途。本发明者在此认为蛋白组学的方法和工具在传统医学上的应用,可开发有效力的传统医药的检测及筛选平台。这种检测平台通过所提供的确切的活性作用机制的信息,有助于对特殊天然原材料的理解。
发明内容为了使读者在此了解本发明,本发明者提议;本发明的目的是开发一种用于传统医药的检测及筛选平台,本发明通过利用生物标记,包括但不局限于IFN-Y、TNF-a、iNOS,和利用蛋白组学领域的方法和工具来达到目的,还要达到其它的目的和获得不同的方法,如克服现有技术中存在的缺陷和问题。以上所述不是作为对本申请的限制,而是总体上包含在本申请之中。本发明设备和方法的特性、内容和优势将由以下描述、权利要求和附图而得到更好的理解,在附图中图l表示根据本发明确定一种传统医药是否具有抗肿瘤特性的方法。图2为按照本发明的方法分离出的脾细胞的影像,用于实例。图3A、3B和3C为用Rgl,一种来自多种草药如人参的皂苷,对脾细胞的刺激作用之后,对TNF-a、IFN-Y、iNOS的Western印迹结果,用于实例。图4表示经过和未经过Rgl(5pg/mL)处理的脾细胞分泌IFN-Y和TNF-a含量的时长。图5为脾细胞在Rgl存在或缺失情况下差异蛋白的表达,用"二合一"凝胶进行比较,用于实例。图6为通过总结Rgl对脾细胞蛋白质表达和可能的调节机制,表明Rgl对脾细胞蛋白质表达的影响,用于实例。以下对示范性实施例的描述本质上仅是作为示范,而不是用来限制本发明、其应用或用途。通篇描述所使用的术语"脾细胞"是指所有从脾脏分离出来的白血细胞。术语"生物标记指示物"为能够被检测和/或测定的指示物,这种指示物一般通过生物学方法而产生。现在专门描述图l-6。图l为本发明的实施方法,包括如下步骤,获取脾细胞101,刺激脾细胞103,和测定免疫调节作用105。该方法结合脾细胞的使用和特定蛋白质的分析,在检查超过100种蛋白质的同时表达时,确定一种特定活性剂的效果。该方法因而可以对众所周知的传统医药的天然原材料进行大规模检测。获取脾细胞101脾细胞可以通过本领域已知的实验方法而获得,所述实验方法包括如下步骤,获取一个脾脏,切碎该脾脏,用已切碎的脾脏制备悬浮液,孵育由悬浮液而来的细胞,分离脾细胞,以及收集脾细胞。脾脏可以取自任何适于用作药物检测的哺乳动物,如大鼠、狗、猫、小鼠、豚鼠、牛、鹿、猴子,等等。脾脏移除可通过已知的脾切除术来完成,如剖腹术切除、腹腔镜切除、无菌切除等。所获得的脾脏然后用切开、碾磨、捣碎脾脏和将脾脏切成薄片等方法切碎。其它的工具如筛子,也可用来切碎脾脏。制备脾脏悬浮液,如单个细胞的悬浮液,然后进行孵育。孵育的方法可用已知的实验室法进行,包括培养皿、琼指平板、微量滴定板和利用发酵罐的批量处理法。孵育可以在包括如下生长因素的环境中进行,如琼脂、营养物、盐、氨基酸、糖或抗生素;所述环境包括一到多个用于互相结合的生长因素。在一项实施例中,孵育在包括1000U/mL青霉素、链霉素(PS)和5%柠檬酸葡萄糖的环境中进行。在孵育之后,可以通过很多方法将脾细胞从培养物分离出来,如离心、梯度离心、滤压、机械压、旋转式过滤、立轴分离器离心(verticalspindleseparatorcentrifugation)、臣卜式虫累方定离A、(horizontalbowlcentrifugation)、沉淀和絮凝。在一项实施例中,脾细胞是通过使用梯度离心而被分离。然后收集被分离的脾细胞。为保证脾细胞沉淀物中没有红细胞,可以在沉淀物中加入溶细胞素。加入溶细胞素可以用机械、微生物学或化学的方法加入。红细胞裂解还可以通过一种或多种的方法进行,如升高温度、极端pH、冷冻沉淀物、渗压休克、添加细胞毒素化学药品如氯,或添加试剂如青霉素、季铵湿润剂,或蛋白酶。在一项实施例中,红细胞裂解是通过往沉淀物中加入冰冷的NH4C1溶液而完成的。在此之后洗涤脾细胞。洗涤可以通过使用培养基,如基本培养基,如1000U/mLPS加上2g/L的碳酸钠。在一项实施例中,所得脾细胞应被洗涤一次以上,如用基本培养基洗涤则应有两次或三次以上。刺激脾细胞103在获得脾细胞101之后,脾细胞用具有潜在活性成分溶液进行刺激。该溶液由一种获自天然原材料的有活性的成分组成,所述天然原材料历史上一直被作为一种预防疾病或治疗疾病的传统医药,包括草药、动物身体一部分或是矿物质。"历史上"是指天然原材料在大约150年到5000年之前被用于药品。"传统"是指在现代医学时代出现之前依赖于发展了数个世纪的医学知识。传统医药包括如下领域,传统中药(TCM)、印度草医学、草药、同治法、细胞疗法(pytotherapy),等。传统医学往往沉浸于社会文化中,在那里医疗方法得到发展,例如,传统的中药在治疗上有赖于中国的文化;印度医学与印度文化密不可分,并在印度得以发展。传统医药领域的治疗目的是为了加强机体的免疫防御系统,从而可以治疗疾病或预防疾病的发生。随着机体免疫系统的强化,免疫系统因而可以对疾病进行攻击。传统医药与现代医药不同的是,现代医药需要通过施用药品和给药来治疗疾病而不是增强免疫系统。现代医用药品的实例包括抗代谢物、垸化剂、抗肿瘤试剂、生物碱类和激素。传统医药与现代医药还有一点不同在于它们有不同的开处方的方法。一般来说,传统医药是将药物施用给病人,然后观察该治疗对健康所起的效果。通常,传统医药是以散弹猎枪式开处方,即,一次给出几种天然原材料,认为一种成分可以发挥效力,或者各种成分协同起作用。传统药物的选择基于医师对天然原材料历史记载的理解。与之不同的是,现代医学是先详细研究确定药物的有效性,如进行临床研究,然后以严格控制和特定的方式给病人用药,g卩,一种药物针对一种特定的疾病。这种区别可能是由于现代医药的精确和其杀死健康细胞和正常细胞的副作用如化疗的缘故。在为病人制备天然原材料时,通常依赖于非化学变化的手段,如煮沸、晒干、加工天然原材料,等等。天然原材料在用药前未发生化学变化。来自天然原材料的活性成分含有皂苷、生物活性多糖、免疫刺激剂等。传统医药中的活性成分可以通过如下的方法获得,混合/浸泡天然原材料、加热/激活天然原材料,离心、冻干法、沉淀、分离、分馏和测定所获得的活性成分。近年来,通过分析活性成分和体外和体内敏感性测试方式,已经阐明了天然产物对免疫系统和癌细胞生长的正面效应。传统的中药免疫调节作用可能来自它们对多糖成分的免疫刺激。所述活性成分来源的实例包括拳参(及/2/zoma6/MoWae),夏枯草(<S//ca/^wwe〃ae),鬼牵十草(i/er6a6zWew"sZ)z》/wwa^e),大青卩十(_Fo//i/m/sflfhW/s),i/2/zo附asww/ac/sg/a6n2e,苦参(及acz'x■sop/zorae7"v^ce欣i),牛黄6ov/s),i/^zcw"c"//7'必,板蓝根/wc/成雪莲花(Z/er6"sawMwmae/wvo/wc尸atoe),Jb"o/se//os^-ow,海龙,冬虫夏草(Co/^jKce/w),卩可胶(Co//acoWz'as/m'),紫可车(尸/ace"to/zom/m's),》呈羊藿(Z/erZ)fl(e//wed/0,无花果(F/ci/scaWca),〖可首乌(i^acfecpo(ygomww/^/7oW),当jl3(i"d/xfl"ge/z,cfles/we/wk),巴草戈天(ia^focwzor/wdae,丰土《中广Cor/^xewcow/w/aeJ'海马,灵芝(G7ossy),禾口甘草(丄/《wor/ceraof)。活性成分的其它来源包括真菌,如茯苓(Poriacocos),猪苓(Polyporusumbellatus),真菌赤芝(Ganodermalucidium),紫芝(G.japonicum),Cordecepsophigoglossoides,采革绒盖菌(Polyporusversicolar),Omphalialepidescense,长裙竹荪(Dictyphoraindusiata),裂褶菌(Schizophyllumcommune),禾口Sclerotiumglucancium;植物,如Abelmoschusglutinotextilis,黄蜀葵(Abelmoschusmanihot),刺五力口(Acanthopanaxsenticosus),Aconitumcamichaellii,药蜀葵(Althaeaofficinalis),蜀葵(Althaearosea),Angelilcaacutiloba,牛蒡(Arctiumlappa),Artemisiapriniceps,Aucanacuacarmizulis,湾丰艮(Bryoniaalba),Bryoniadiocia,Codonopiaispilosula,叻口啡属(Coffeesp.),薏该(Coixlachrymajobivarmayuen),秋水仙(Colchicumautumnale),Cucumismelocantalupencic,紫草(Lithospermumeuchromum),烟属(Nicotianasp.),旱稻(Oryzasativa),人参(Panaxginseng),三七(Panaxnotoginseng),松树(Pinussp.),车前草(Plantagomajor),酸模(Rumexacetosa),甘蔗(Saccharumofficinarum),一枝黄花(Solidagosp.),绣线菊(Spiraeaulmaria),红三叶(Trifoliumpretense),Yuccaschidegera,红麥(Zizyphusjujube);药用植物,如库洛胡黄连(Pi謹hizaku廳),印度娃儿藤(Tylophoraindica),Anonitumheterophyllum,止泻木(Holarrhenaantidysenterica),宽筋藤(Tinosporacordifolia)禾口丁香罗勒(Ocimumgratissium),印度菝葜(Hemidesmusindicus),Psedustellariaheterophylla;和植物混合物,如(用拼音表示(音译))小柴胡汤(xiao-chai-hi-tang),葛根汤(ge-gen-tang),乌苳汤(wu-ling陽tang),猪苳汤(zhu-ling-tang),补中益气汤(bu-zhong-yi-qi-tang),十全大补汤(shi-quan-da画bu國tang),以及人参养容汤(ren-shen-yang-rong-tang)。从天然原材料获得的活性成分的实例包括来自香菇(Lentinusedodes)的P(1,3)-葡聚糖、裂褶菌(Shizophyllumcommune)的schizophyllon、Criolusversicolor的多'糖K、人参(Panaxginseng)的GZ、孑亥儿参(Pseudostellariaheterophylla)的PH-1、Benincascerifera的BCM、Angelicaacutilaba的Angelica免疫朿U激多糖、蒙古黄甚(Astragalusmembranaceaus)的Fraction3、花燕(Lentinusedodes)的蘑恭多糖、孩儿参(Pseudostellariaheterophylla)的PH-1C和来自人参(Panaxginseng)的Rg-l。在本方法中,用于活性成分溶液的活性成分的量为大约5pg/mL至大约20|Jg/mL。在一项实施例中,活性成分的用量为5lJg/mL。在另一项实施例中,Rgl为一种活性成分。活性成分溶液还包含盐水溶液,如磷酸缓冲生理盐水(PBS)、半量生理盐水、生理盐水、四分之一量生理盐水或含糖生理盐水。脾细胞103的刺激作用通过将活性成分溶液添加到所获得的脾细胞101在盘中进行,所述的盘为平底盘、滴定盘等,并将盘优选地置放于孵育器中。将孵育器设定到一定的温度、湿度或C02水平。在一项实施例中,孵育器(^02的浓度控制在3%和7%。在一项优选实施例中,孵育器中C02为5M,温度为37t:。孵育时间在12和72小时之间。测定免疫调节作用105通过活性成分溶液对脾细胞进行刺激作用之后,对生物标记指示物肿瘤坏死因子a(TNF-a)、干扰素Y(IFN-Y)和可诱导的一氧化氮合成酶(iNOS)进行确定和测定。确定和测定免疫调节作用包括使用不同的分析方法,如BmdfordProteinAssay、改良的BradfordProteinAssay、ELISAAssay,检测抗体反应,包括兔抗鼠iNOS、兔抗鼠TNF-a、兔抗鼠IFN-y、单克隆抗鼠IFN-y、单克隆抗鼠TNF-a、生物素化单克隆抗鼠IFN-Y、生物素化单克隆抗鼠TNF-a,或其它的方法,如双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2DE),染色如银染和Westem印迹。该确定和测定方法可以单独使用,或两个或更多个结合起来以组合或有序的方式使用。BradfordProteinassay(Bradford法库于Bio-Rad(Bio-RadLaboratory,U.S.A)制造商推荐的一种方法。该方法包括将酸性染料coomassiveblue添加到蛋白质溶液,然后用分光光度计测定。Bradford法可用于确定细胞裂解物蛋白质浓度。根据该方法,在把Bradford试剂添加到标准溶液和蛋白质溶液后,标准溶液和蛋白质溶液在595nm处的吸收可用分光光度计法测得。改良的BradfordProteinassay涉及标准的Bradford方法,但包括将酸性染料添加到蛋白质溶液,然后用分光光度计在595nm处进行测定。确定样品中是否存在抗体或抗原的ELISAassays也可以在本发明中使用。在该方法中,ELISAassays可用于研究在活性成分溶液激活的脾细胞中IFN-Y和TNF-a的生成。在一项实施例中,ELISAassay如OptEIA顶大鼠IFN-y试剂盒和OptEIATMTNF-a试剂盒,二者都来自Pharmigen,USA,都可在本发明中使用。两种试剂盒的特征在于同时具有初级抗体和次级抗体,具体地说,针对IFN-Y试剂盒,单克隆抗大鼠的IFN-Y抗体可用作初级抗体,而生物素化单克隆抗大鼠IFN-Y可以用作次级抗体。或者,针对IFN-Y试剂盒,单克隆抗大鼠TNF-a抗体可作为初级抗体,而生物素化单克隆抗大鼠TNF-a可作为次级抗体。ELISAassays包括使用结合物,如亲和素-HRP和着色底物如2,2-吖嗪-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2國Azin-bis画3國thylbenzthiazoline画6隱sulfonicacid)。禾ll用ELISAassays进行观!j量是通过使用分光光度计法,通常是在405波长处用自动酶标仪测试。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)分析用于分析脾细胞的裂解物。双向聚丙烯酰胺电泳图谱(2D)可对一个特定器官、组织或细胞在"正常条件下"以及在生理条件发生变化的情况下蛋白质的表达进行双向比较。被进一步开发的2D电泳图谱可作为分析蛋白质表达发生变化的基础。2D电泳被选择作为分析细胞、组织和体液蛋白质的组成以及研究一系列效应物引起基因表达的全局状态变化的一种技术。在2D电泳技术中,根据等电点(pl)和分子量(Mw)将蛋白质分开。一旦2D电泳将蛋白质分开,那么蛋白质经过不同的染色方法如银染即可视,并且利用特异性图像分析软件对蛋白质点图谱进行分析。通过各种鉴定方法,对挑选出的目的蛋白质作进一步的测定/鉴定。在本方法中,脾细胞裂解物可以通过本领域众所周知的技术而获得,包括孵育、洗涤脾细胞、离心、用缓冲液裂解细胞、弃除上清液、收集洗涤过的细胞和结合来自不同动物的细胞裂解物这些步骤。蛋白质可以根据它们的p调固定pH梯度(IPG)(pH3.9-5.1,4.7-5.9,3-6,5.5-6.7,6.3-8.3,5-8,7-10)胶条被分离。首先,脾细胞裂解物可用于IPG胶条。用于等电聚焦(IEF),胶条IPG再水合与添加样品同时进行,IEF是指根据所带电荷的不同,将不同分子的分离的技术。IEF在2(TC和27nC之间50-60V下进行14到18个小时。可以使用等电仪,包括但不局限于MultiphorTM、IPGphore(GeneralElectric,U.S.A)和ProteanIEFTM(Bio-RadLaboratories,U.S.A)。IEF可以在由以下电压组成的组中选择,500V、l,OOOV、4,000V,8,000V和10,000V,在1到2个小时之间进行。首先,用于IEF的胶条被平衡化。适用于平衡胶条的缓冲液含有50mM的Tris-HCL平衡溶液,pH6.8,含有1%(w/v)DTT,6-9M尿素,30%V/V丙三醇,2%w/vSDS和痕量溴苯酚兰。根据分子量,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),溶解和分离IEF聚焦蛋白质。在IEF之后,用诸如ProteanmTM垂直凝胶电泳系统或Protean1¥,电泳槽这样的仪器进行电泳。可在30到80mA电流的条件下电泳6-16个小时。在2D凝胶上用银染测定蛋白质。通过银染,在裂解物中的蛋白质可以被检测到。银染法还可以被修正到与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)相容。MALDI-TOFMS是一种技术,其中,UV光吸收基质和生物分子共沉淀经过十亿分之一秒激光脉冲照射。大部分的激光能量被基质所吸收,从而阻止不必要的生物分子的分裂。离子化的生物分子在电场中被加速并进入飞行管。在飞行过程中,不同的分子根据它们的质荷比被分离,并且在不同的时间内到达检测器。每个分子以这种方式获得一个清晰的信号。在制备用MADLI-TOFMS来作鉴定的不同蛋白质时,含有每一种目的蛋白质(例如,蛋白质表达为正调)的凝胶填料可以用刀/切刀或其它任何一种本领域的标准技术从2D凝胶上获取。通过将蛋白质与酶(例如trypsin)共孵育12-16小时,把该凝胶填料中的蛋白质用酶来酶解,如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或本领域常用的酶类。蛋白质被酶解后的肽可以通过反复和选择性地添加和移取乙腈及0.1%的三氟乙酸(TFA)而提取。肽提取物被真空离心浓縮为更浓縮的形式和/或用含有离子交换树脂的Tips(如Zip-Tips)进行纯化。被浓縮和纯化的肽混合物然后与基质相混合。该凝胶基质由甲醇、乙酸、甲醛、乙醇、乙腈、三氟乙酸、高度纯化的水和乙酸的结合而构成。然后,通过MALDI-TOFMS,获得一个肽谱(根据M+ZZ比)。该谱称为蛋白质的肽质量指纹(PMFs)。通过比较对各种蛋白质和DNA数据库中所有记载的蛋白质的酶解作用产生的PMFs来鉴定目的蛋白质。除了以MALDI-TOFMS为基础的鉴定方法之外,Western印迹法也可以使用。Western印迹法可通过本领域己知的方法进行,包括制备、凝胶电泳、转移、封闭和检测。检测包括比色检测、化学发光检测,或放射性检测。以上所述平台提供了蛋白组检测及筛选,该检测及筛选利用脾细胞作为效应物来检测及筛选传统医药成分的免疫调节作用的存在。在用传统医药成分提取物处理脾细胞后,利用确定和测定方法如分析试验、电泳技术和质谱分析,差别表达的蛋白质种类即被检査到。因而可以评估传统医药成分的多靶标效果以及基本的免疫调节机制。本方法为大规模检测及筛选传统医药成分的免疫调节作用提供了一个有效的途径。如本领域所知,免疫调节作用的确定和测定可以被调整至满足更大规模和快速检测及筛选传统医药成分的需求。这种"更大规模"的需求对本领域技术人员是已知的,即它是针对有效地应用本发明的效率。在以上所述方法的另一个实施例中,生物标记指示物还包括发现于巨噬细胞、多形核细胞、细胞毒素T淋巴细胞、自然杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞中的生物指示物。图2-6针对以下的实例实施例高度纯化的Rgl为人参中一种主要的皂苷,已经显示出可抑制癌细胞的生长。它刺激动物组织中DNA、蛋白质和脂类的生化合成。Rgl还显示可以作为一种免疫调节剂,引起内皮细胞在Rgl诱导之后增加一氧化氮的生成,以及增加T辅助细胞的活性、细胞因子IL-1和自然杀伤细胞产量的增加。其它的特性包括选择性增强淋巴细胞的增殖和IL-2的产生。可以假设,人参皂苷的抗癌效果可能与由半胱天冬酶-3和/或活性氧类引发的凋亡效应相关。尽管已经对人参效果有很多的研究,但是对它的分子作用机理仍然知之甚少。材料和方法动物周龄8-10、体重200g的雄性SpragueDawley大鼠由香港理大学应用生物禾口化学技术系动物中心(theanimalholdingcenteroftheDepartmentofAppliedBiologyandChemicalTechnology,TheHongKongPolitechnicUniversity)提供。所有研究都是根据最新公布的对实验室动物护理和使用的NIH指南(theNIHGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)中所述的原理和程序进行的。动物伦理学批文己从香港理工大学动物伦理学分委员会获得。制备大鼠脾细胞将大鼠在醚深度麻醉下放置,并经腹部大动脉放血,通过无菌技术移出脾脏,接着在10ml含有1000U/ml青霉素-链霉素(PS)(Gibco,USA)的RPMI-1640(Gibco,USA)培养基中洗涤两次。把脾脏切成小块后,在塑料注射器中用柱塞上下抽吸。制备单个细胞悬浮液,并放置在含有IOOOU/mlPS和5c/。柠檬酸葡萄糖的同样培养基中。然后通过梯度离心将单细胞悬浮液分层到Ficoll-PaguePlus梯度(AmershamBioscience,H.K丄td.)上而分离脾细胞,室温下以400g离心35分钟。收集含脾细胞的组分。室温下加入4倍体积的冰冷氯化铵溶液(pH7.4)而裂解红细胞5分钟,将脾细胞在普通培养基中洗涤两次。淋巴细胞用Wright-Giema着色剂染色后,再在光学显微镜下检査。台盼蓝染色后,经光学显微镜检査细胞生存力和数目。将脾细胞(lxl06)培养在含有1000U/mlPS、补充有2g/L碳酸钠的完全RPMI-1640培养基上。24小时孵育后,使细胞重悬浮在含有10。/。FCS(Gibco,USA)的同样培养基上,并进行多种处理。用Rgl剌激脾细胞将Rgl(剂量5Mg/ml)加入到位于37'C、5%(]02培养箱内6孔平底板(NuncMaxisorp,USA)上脾细胞的PBS缓冲液中。在不同时间点(12-72小时)从孵育混合物中采集条件培养基的样品。这些样品储存在-8(TC备用。样品保存不超过两个月,除用Western印迹法之外,还可以在Rgl处理的脾细胞的样品(间隔12和24小时)中使用2DE分析进行全蛋白的表达,与PBS孵育24小时的细胞用作对照。Western印迹和免疫检测在不同时间点采集与Rgl孵育和没有与Rgl孵育的脾细胞培养物的上清液,并且用于检测TNF-a和IFN-Y。同样,脾细胞裂解物用于检测iNOS的表达,上清液/裂解物中的蛋白含量通过Bradford方法(Bio-RadLaboratory,USA)确定。对于各个分析,通过12.5y。还原性SDS-PAGE胶在恒压(150V)下电泳l小时,分析350pg蛋白。蛋白转移至硝酸纤维素膜(Millipore,USA)上。洗涤和封闭后,以1:500的稀释度,对这些膜用下列探针进行检查兔抗大鼠的iNOS(TransductionLaboratories,USA),兔抗大鼠TNF-a(PropTech:USA)或兔抗大鼠IFN-Y(PropTech,USA)。室温孵育2小时后,洗涤这些膜,然后与l:20,000稀释的结合有IgG(Sigma,USA)的山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)孵育。使用SuperSignalWestPicoChemiluminescent试剂盒(Pierce,USA)检测阳性结合,而使用分子动力学密度仪(MolecularDynamicsDensitometer)(Bio-RadLaboratories,USA)扫描曝光的X线胶片(Kodak)。ELISA测定使用OptEIATM大鼠IFN-Y和TNF-a试剂盒(Pharmigen,USA)进行IFN-y和TNF-a测定。对使用或未使用Rgl刺激的脾细胞裂解物进行检测。在这些试剂盒中,单克隆抗大鼠IFN-Y和TNF-a抗体用作初级抗体,而生物素化的单克隆抗大鼠IFN-Y和TNF-a抗体用作次级抗体。加入亲和素-HRP结合物后,再加入2,2-吖嗪-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2-Azin-bis-3-thylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)显色,并且采用微滴定板读数仪(Bio-RadLaboratories,USA)在吸光度405nm处检测颜色变化。与标准相比,计算IFN-Y和TNF-a的量。2-DE分析脾细胞裂解物样品制备在与或不与Rgl孵育后,将培养皿上的脾细胞以RPMI-1640冲洗一遍,随后加入含有0.2g/LEDTA的0.5g/L胰蛋白酶,孵育3分钟。以1000g离心5分钟收集细胞,并用PBS(pH7.2)洗涤两次。然后将脾细胞用最低量的含有4。/。TritonX-IOO,9M尿素和lmM的PMSF的裂解缓冲液(通常200iJl)在冰上裂解10分钟。以3000g离心10分钟收集上清液,采用Bio-RadLaboratories,USA的蛋白分析试剂盒,通过改良的Bradford法测量蛋白含量。经同样处理的不同动物的细胞裂解物以l"的蛋白比率合并在一起,并用作2-DE分析。120iJg的脾细胞裂解物[在含有9M尿素,2%w/vTritonX-IOO,0.5%w/vDDT(Sigma,USA),0.4%v/vIPG缓冲液4-7(AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)和痕量溴酚兰的缓冲液中至终体积300lJl中]用于胶内样品再水合。2-DE把样品上样到IPG胶条pH4-7(3xl70mm,Bio-RadLaboratories,USA)。使用ProteanIEFCell(Bio-RadLaboratories,USA)或IPGphor(AmershamBiosciences,USA)进行再水合及之后的等电聚焦。室温下在覆盖有低粘度石蜡油的IPG胶条固定器上以50V进行再水合16小时。然后依序使用500V(l小时)、1000V(l小时)、4000V(2小时)和8000V(2小时)进行等电聚焦,胶条平衡在pH6.8,含有1%(w/v)DTT(Sigma,USA)、9M尿素、30。/。v/v甘油、2。/。w/vSDS和痕量溴酚兰的50mMTris-HCl平衡缓冲液中10分钟。平衡后,IPG胶条转移至12.5Q/。SDS-PAGE凝胶(1600xl60()xlmm),用于在ProteanVI电泳槽中室温下以恒电流30mA每凝胶电泳进行第二维分离。随后,使用与MALDI-TOF分析相容的方法对凝胶银染。银染的凝胶用分子动力学密度仪(Bio-RadLaboratories,USA)扫描。所得2-DE图谱采用软件MelanieIII(Bio-RadLaboratories,USA)加以分析。在银染蛋白质点中以体积百分比变化的基础上,对相对量的变化进行评价。目的点变化在多个凝胶上测试重现性,蛋白质可视使用MALDI-TOF质谱仪的制造商BrukerDaltonics(USA)所建议的质谱仪相容的方法进行银染。简而言之,首先将凝胶在含有50。/。v/v甲醇,12。/。v/v乙酸,0.0375。/。v/v甲醛的固定溶液中固定2小时,随后用50%甲醇另洗涤凝胶20分钟。重复两次洗涤步骤。凝胶在含有0.05%硫代硫酸二钠的溶液中氧化l分钟,接着用milli-Q水洗涤(三次,每次20分钟)。把凝胶在含有0.0375%甲醛的0.2%硝酸银中孵育20分钟。再次用milli-Q水洗涤凝胶三次,每次20分钟。然后在含有0.0375%甲醛和0.004%硫代硫酸二钠的15%碳酸钠溶液中使凝胶显色,直到凝胶达到所需量的染色。该过程不应长于IO分钟。最后,用含有12%乙酸的25%甲醇终止反应。蛋白鉴定或通过软件MelanieIII(Bio-Rad,USA)进行图像分析,或直接利用如前所述的"二合一"凝胶法(WangAYY,CheungBY,WongMS,LoSCL.两维电泳后"二合一"凝胶用于点匹配,Proteomics2003,3,580-583)加以比较,而将不同处理后差异表达的蛋白定位于2-DE凝胶上。使用MALDI画TOF國MS(Autoflex,BrukerDaltonics,Germany)通过肽质量指纹识别选择和鉴定若干种差异表达的蛋白质点。含有差异表达的蛋白质点的凝胶填料从2-DE凝胶上切去,并用胰蛋白酶消化(采用由BrukerDaltonics,Germany建议的方案,该方案是如以前由Shevchenko等(ShevchenkoA,WilmM,VormO,MannM.质谱测序蛋白银染的聚丙烯酰胺凝胶。Aanl.Chem.68:850-8,1996)所述方法的改进)。简而言之,凝胶填料被切成小块,用milli-Q水洗涤两次,接着用25mM碳酸氢铵的50M乙腈洗涤。样品中的半胱氨酸残基用10mMDTT还原,并用55mM碘代乙酰胺处理而衍生化。乙腈再水合和干燥后,样品用胰蛋白酶(5ng/iJl胰蛋白酶的25mM碳酸氢铵)37。C下消化过夜。消化样品用50%乙腈/1%三氟乙酸通过超声抽提。收集含有消化的肽的上清液,消化的肽(0.5iJl-1.5lJl)与l-2ml的a-氰基-4-羟基肉挂酸(10mg/ml的50。/。乙腈,0.1%三氟乙酸)基质和100fM促肾上腺皮质激素(ATCH)片段18-39混合作为内标。仪器以阳离子反射方式在20kV加速压下操作。所得肽质量指纹使用矩阵科学(MatrixScience)的MSCOT搜索引擎对Swiss-Prot进行检索。所有检索都使用1-1OOkDa的质量窗以质量公差+Z-100ppm进行。每个样品允许有一个失误切割,而半胱氨酸假定是氨基甲酰胺基甲基化的,以及甲硫氨酸为氧化形式。结果脾细胞分离图2为用LeicaQ500MC成像处理和分析系统(Leica,Gemany)显示分离的脾细胞(大淋巴细胞和小淋巴细胞)图像。脾细胞的制备如以上的方法部分所述,并在Wright-Giemsa染色后检查细胞。未见红细胞污染。台盼蓝染色证实95%以上的分离细胞具有生存力。还可以见到少量的巨噬细胞,它们附着在用于孵育细胞的培养皿的底部。由于巨噬细胞、大淋巴细胞和小淋巴细胞皆存在,该制备物可用作研究Rgl的免疫调节作用的效应物。Rg1对脾细胞生成IFN-Y和TNF-a和iNOS的影响图3A、3B和3C分别为Western印迹检测Rgl在不同时间间隔内对TNF-a、IFN-Y和i-NOS的诱导作用的结果。在成功制备有生存能力的脾细胞之后,加入Rgl作为刺激物以研究这些脾细胞可能的反应。Western印迹检测IFN-Y和TNF-a在培养基中的分泌。iNOS的表达也在脾细胞裂解物中加以测试。大多数药理学研究Rgl所用的浓度为5-2(^g/ml。初步研究使用5ng/ml的Rgl,导致IFN-y和TNF-a实验的阳性结果。因此,5iJg/ml的Rgl用于本发明人实验中。没有Rgl处理的脾细胞用作比较用对照。结果显示,对照组在72小时的孵育过程中,细胞培养基或脾细胞裂解物均未检测到IFN-Y、TNF-a和iNOS。另一方面,当用5ng/mlRgl剌激时,可检测到所述的两个细胞因子和iNOS。TNF-a在间隔24小时和48小时皆被检测到,而IFN-Y在24小时被检测到。诱导的iNOS在用Rgl孵育后12小时和24小时被检测到。随后,利用ELISA对培养基的系列样品进行这些抗癌细胞因子(IFN-Y和TNF-a)的定量记录。图4为各个条件重复测定三次的结果。两个细胞因子的分泌方式在诱导后很相似,这些细胞因子的数量在Rgl诱导后增加1000倍以上,而其水平在孵育24小时时达到最高。24小时后,两个细胞因子分泌水平随着孵育时间延长开始下降。该结果也与Westem印迹的结果一致,其中,最大量的IFN-Y和TNF-a分泌出现在Rgl诱导后24小时处。Rgl对蛋白质表达的影响图5显示蛋白质在普通样品和经过Rgl处理后的样品中表达上的差异。由于Rgl发现在孵育24小时后诱导IFN-Y和TNF-a产生,因此在孵育24小时后还研究了Rgl对脾细胞蛋白质组的影响。同样处理的样品以l:l的蛋白质比率合并,并用于如材料和方法中所述的2-DE分析。无论在PBS还是在含有Rgl的PBS中,全部样品皆在孵育24小时后采集。与PBS孵育的样品用作对照作比较之用。为便于鉴定差异表达的蛋白质,如前所述(Wang等,2003)进行"二位一体"凝胶方法。简而言之,样品第一维IEF(与或未与Rgl一同孵育)分开在不同ProteanIEF细胞中但同时进行。IEF完成后,将IEF胶条切成等半。半份IEF胶条对应于同样的pH范围,但以不同样品(与或未与Rgl—同孵育)电泳,并排放到ProteanVI电泳装置中制备的第二维SDS-PAGE的顶部。所得对照样品的凝胶和Rgl处理样品的凝胶在银染后利用MdaninII咖以比较。在用正常样品电泳的一半凝胶中约有102个蛋白质点被检测,而在用Rgl处理的样品电泳的另一半凝胶中有122个蛋白质点被检测到。蛋白质鉴定在凝胶内胰蛋白酶消化后,MALDI-TOF质谱用于鉴定差异表达的蛋白质。7个差异表达的蛋白质点通过MASC0T搜索引擎得以成功鉴定。6个蛋白质被正调,包括细胞色素C氧化酶,同源异型蛋白质LH-2,T细胞表面糖蛋白CD5,DNA聚合酶P,a-甘露糖苷酶II以及鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G,其他蛋白质发现是被负调的,并且被鉴定为假设的抗增殖因子。7个鉴定的蛋白的详情汇总在表l中。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>讨论大鼠脾细胞由巨噬细胞、T细胞和B细胞组成。这群细胞用作效应物对Rgl是否存在免疫调节作用进行测试。利用Western印迹和ELISA,发现Rgl刺激了脾细胞的IFN-Y、TNF-a和iNOS的产生。Rgl诱导后,IFN-y和TNF-a的产量在24小时达到峰值。这个结果与Gao等(PharmaceuticalResearch1996,13:1196-2000)的报道相似,其中在用三七(尸awaxwotog/""wg)的粗制品对分离自小鼠脾脏的淋巴细胞诱导后24小时和48小时检测到最高量的IFN-Y和TNF-a。在本发明人的实验中,IFN-Y和TNF-a的产生达到其峰值所需的时间较短。这可能是由于本研究使用纯化的Rgl而非粗制品的缘故。另一方面,Rgl对分子水平的作用方式可能已被揭示出来,这在以前的研究中尚未发现。本发明研究了Rgl诱导的脾细胞中差异蛋白质的表达。基于直接比较"二合一"凝胶的蛋白质表达,发现了蛋白质表达在正常样品和Rgl处理样品之间的显著变化。有87个蛋白质发现是正调的,而另有38个蛋白质发现是负调的。还有38个点没有任何显著的变化。胰蛋白酶消化后,利用MALDI-TOF质谱对差异表达蛋白质进行了选择和鉴定。有7个蛋白质成功地得以鉴定,其中6个是正调蛋白质。它们是细胞色素C氧化酶,同源异型蛋白LH3,T细胞表面糖蛋白CD5,DNA聚合酶卩,a-甘露糖苷酶II以及鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G。剩余蛋白质点(假设的抗增殖因子)发现是负调的。从文献中可知,DNA聚合酶P相关于DNA合成。其正调表明Rgl剌激DNA合成。该剌激是否通过类固醇激素依赖的或不依赖的途径介导现在还未知。Rgl对DNA合成的剌激效果也在大鼠和小鼠骨髓细胞中被观察到。另一方面,已知还有两个正调蛋白同源异型蛋白LH-2和T细胞表面糖蛋白CD5参与B细胞和T细胞增殖。据报道,同源异型蛋白LH-2是B淋巴细胞分化的早期标记,也参与控制B细胞分化(Xu等,.ProcA/^/JcadC/&4.,1993,90,227-31)。T细胞表面糖蛋白CD5为一跨膜蛋白,已知在调节T细胞增殖中担当受体(Vermeer等,£wr.//www"o/.1994,24,585-92)。另两个鉴定的正调蛋白细胞色素C氧化酶和a-甘露糖苷酶n可能参与细胞代谢过程。细胞色素C氧化酶是一种参与呼吸链的氧化性磷酸化作用的线粒体膜酶(Kadenbach,B.Biochim.Biophys.Acta2003,1604,77-94)。由于ATP是呼吸过程的终产物之一,当细胞色素C增加时,ATP的合成也很可能增加,己知细胞内高的ATP含量为细胞生长和增殖提供能量。细胞色素C氧化酶还参与cAMP生成的跨膜信号传导途径(Frizzdl,R.A.AmJRespirCritCareMed.1995,151,S54-8)。a-甘露糖苷酶II为高尔基膜蛋白质,控制甘露糖转化为复合的N-糖基。其可能参与溶酶体合成,因为注定为溶酶体的蛋白质在高尔基体内通过加入6-磷酸甘露糖被共价修饰,然而,其真正的功能还不清楚。鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G是另一个正调蛋白,为膜相关蛋白,其将许多类型的膜受体连接到多种第二信使系统上(Gilman,A.G.Ann.Rev.Biochem.1987,56,615-49)。(3和Y亚基为把a亚基(一种膜周边蛋白)固定至质膜上的疏水整合膜蛋白。已知G蛋白的一个组分Gsa-GTP能够结合到腺苷酰基环化酶,这剌激cAMP的产生(Lania,五wr丄五"Acn'".2001,145,543-559)。据报,道,Rgl可增加老年动物中胞内cAMP和cGMP,导致白介素2(IL-2)的表达以及脾细胞增殖(LiuM.,ZhangJ.T.,YaoXueXueBao,1996,31,95-100)。因此鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G的正调可能暗示cAMP水平相应增加,而这又诱导IL-2表达和脾细胞增殖的相应增加。假设的抗增殖因子,尽管其真正的功能还未确立,但据信抑制细胞增殖。因此,这种蛋白质在Rgl处理后的负调表明细胞增殖的机会增加。图5说明7种鉴定了的蛋白质以及IL-2、TNF-a、IFN-Y和iNOS在带来免疫调节作用方面可能的相互作用。上述结果还表明,Rgl处理后12小时和24小时检测到iNOS。诱导的iNOS己知产生一氧化氮,其在诸如血管舒张、抑制血小板聚集和神经传递的不同生理过程中起重要作用。一氧化氮也己知起细胞毒介导剂的作用,并且作用于巨噬细胞的杀菌和杀肿瘤活性。因此,iNOS的正调可用于评价细胞的杀菌活性。这种酶的产生可能受到细胞因子(TNF-a和IFN-Y)的调节。Kampiah等报道了病毒复制受到IFN-Y诱导的NOS的抑制(Karupiahetal.5We"cel993,261:1445-48)。这些研究人员认为诱导NOS对于IFN-y的实际抗病毒效果是必需和足够的。文献中还清楚记载了IFN-Y可与TNF-a协同作用,促进iNOS的基因表达。此外,细胞色素C氧化酶和ATP在Rgl处理后的增加可能还增加iNOS的生成。蛋白激酶C(PKC)活性对于iNOS表达是必要的,其中PKC在结合到膜受体的过程中需要ATP。还已知PKC介导的信号传导剌激G蛋白的活性。因此,iNOS的增加也会导致IL-2、TNF-a和IFN-Y的量的增加。总之,免疫调节是一种复杂的活动,涉及多种蛋白和细胞组分之间的相互作用。利用脾细胞对Rgl免疫调节作用进行检测已证明在了解涉及Rgl免疫调节的机理方面是成功的。本发明提供了一个大规模检测传统医药的概念。尽管结合附图描述了本发明的实施方案,但要理解本发明不受确切的实施例的限制,而且本领域技术人员可以对此进行修正和改变。但是这些修正和改变都没有脱离开权利要求书中所限定的范围和精神。为说明权利要求书,必须要理解a)术语"包括"不排除权利要求书中未列出的其它的成分或功能;b)某个成分之前的冠词"一个"或"一种"不排除多个这类成分;c)权利要求书中的附图标记并不限制它们的范围;d)任何公开的设备或它们的一部分都可以进一步结合或分开成其它的部分,除非做出专门的说明;和e)不需要对操作或步骤排序,除非特指。权利要求1.一种检测传统医药免疫调节活性的方法,包括步骤获取脾细胞;用活性成分溶液刺激所述脾细胞;和确定生物标记指示物的存在。2.根据权利要求l所述的方法,其中,所述脾细胞可以从选自由下列动物组成的群组获得大鼠、狗、猫、小鼠、豚鼠、家畜、鹿或猴子。3.根据权利要求l所述的方法,其中,刺激所述脾细胞包括将所述活性溶液加至所述脾细胞,且所述脾细胞置于盘中。4.根据权利要求l所述的方法,其中,所述活性成分溶液包括来自历史上被用作传统医药的天然原材料的活性成分和盐水溶液,所述盐水溶液选自由磷酸缓冲生理盐水、半量生理盐水、生理盐水、四分之一量生理盐水和含糖生理盐水组成的群组。5.根据权利要求4所述的方法,其中,所述活性成分选自由皂苷、生物活性多糖、免疫刺激剂组成的群组。6.根据权利要求4所述的方法,其中,所述天然原材料来自由传统中药、印度草医学、草药、同治法和细胞疗法(pytotherapy)构成的领域。7.根据权利要求4所述的方法,其中,所述天然原材料为历史上一直被使用的传统中药。8.根据权利要求l所述的方法,其还包括测定所述生物标记指示物的步骤。9.根据权利要求l所述的方法,其中所述生物标记指示物选自由IFN-Y、TNF-a和iNOS组成的群组。10.根据权利要求7所述的方法,其中,确定和测定生物标记指示物包括使用一种或多种测试,所述测试选自由BradfordProteinAssay、改良的BradfordProteinAssay、ELISAAssay、抗体反应、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色、Westem印迹和MALDIJTOF质谱分析组成的群组。11.根据权利要求l所述的方法,其中所述生物标记指示物可选自由同源异型蛋白质LH-2、细胞色素C氧化酶多肽IV前体、DNA聚合酶P、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G、T细胞表面糖蛋白CD5前体、a-甘露糖苷酶II和假设的抗增殖因子组成的群组。12.—种检测传统医药抗肿瘤活性的方法,包括步骤获取脾细胞;用活性成分溶液刺激所述脾细胞;确定生物标记指示物的存在;和测定所述生物标记指示物。13.根据权利要求12所述的方法,其中,所述活性成分溶液包括来自历史上作为传统医药的天然原材料的活性成分。14.根据权利要求13所述的方法,其中,所述天然原材料为历史上一直被使用的传统中药。15.根据权利要求12所述的方法,其中,所述生物标记指示物选自由IFN-y、TNF-a和iNOS组成的群组。16.根据权利要求12所述的方法,其中,确定和测定生物标记指示物包括使用一种或多种测试,所述测试选自由BmdfordProteinAssay、改良的BradfordProteinAssay、ELISAAssay、抗体反应、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色、Western印迹和质谱分析组成的群组。17.—种检测传统中药抗肿瘤活性的方法,包括步骤获取脾细胞;用含有来自历史上一直被用作中药的天然原材料的活性成分的活性成分溶液刺激所述脾细胞;确定生物标记指示物的存在;和测定所述生物标记指示物。18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述生物标记指示物选自由IFN-y、TNF-a和iNOS组成的群组。19.根据权利要求17所述的方法,其中,确定和测定生物标记指示物包括使用一种或多种测试,所述测试选自由BradfordProteinAssay、改良的BradfordProteinAssay、ELISAAssay、抗体反应、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色、Western印迹和质谱分析组成的群组。20.根据权利要求17所述的方法,其中,所述生物标记指示物选自由同源异型蛋白质LH-2、细胞色素C氧化酶多肽IV前体、DNA聚合酶P、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G、T细胞表面糖蛋白CD5前体、a-甘露糖苷酶II和假设的抗增殖因子组成的群组。全文摘要本发明涉及一种检测或筛选传统医药免疫调节作用和抗肿瘤活性的方法。该方法包括应用蛋白组学领域使用的技术和分析工具从历史上一直被作为传统医药使用的天然原材料分离活性成分、刺激脾细胞以及确定和测定来自这种刺激作用的生物标记指示物。文档编号G01N33/566GK101281199SQ20071009209公开日2008年10月8日申请日期2007年4月6日优先权日2007年4月6日发明者卢俊立,王渊渊,黄文秀申请人:香港理工大学
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