专利名称：多色荧光复合扩增11个肺癌易感性相关snp位点试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于体外一次性复合扩增染色体上肺癌易感性相关的11个 SNP基因座的试剂盒，属于肺癌易感性检测领域的发明。
背景技术：
随着人类基因组计划(Human Genome Project)精确序列图的完成，功能基 因的克隆与鉴定、人类基因组多样性的研究已成为下一个科技制高点。限制性 片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism RFLP)和微卫星多 态性(microsatellite polymorphisms)作为第一代和第二代遗传标记，在物理图 和遗传图的构建、序列基图的拼接和装搭过程中曾起到了决定性的作用。1996年美国的E. Lander首次提出被称之为"第三代遗传标记"的"单核 苷酸多态性"(single nucleotide polymorphism, SNP)。 SNP是指在染色体基 因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，而其中最少的一种等位 基因在群体中的频率不小于1%。它包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形 式。SNP具有如下特点首先，SNP位点非常丰富。几乎分布于整个基因组， 基因组中大约平均每lOOObp就会出现1个SNP，总数约有300万个。其次，S NP的突变率较低，每代每碱基突变率约为2 x 10—8。尤其是处于编码区的(co ding region) SNP (又称cSNP)，是高度稳定的，而串联重复的微卫星位点的高 突变率使得对群体的遗传分析出现困难。第三，具有代表性。cSNP经常引起表 达蛋白的多态性变异，并进而影响他们的功能、特性。第四，扩增片断短，易
于符合扩增，易实现分析的自动化。目前，人类基因组的研究工作己进入后基因组时代(Post genome Era),研究人员重点在功能基因组学领域，其中包括疾病基因鉴定、基因表达调节、人 类多样性和进化、蛋白质结构和功能等各项研究工作。在这种情况下，作为一 类基因研究工具，SNP被广泛应用于遗传疾病、人类进化、生物种群多样性等 方面的研究。SNP与各种疾病关系的研究越来越受到研究人员的重视。如果得出某些SN P或某些SNP的特定组合与特定疾病、特定地区发病人群有明显相关性，就可 以以此SNP作为分子遗传标记，进行分子标记辅助选择和疾病预测预防，在流 行病学调査中确定疾病患者的高危人群，以及进行患病危险程度的评价，建立 有效的预警系统，达到有效的一级预防目的。近年来的研究表明，许多肿瘤易感性与SNP之间具有强相关性，比如 JO CC3( Thr241Met)的Met/Met基因型、丄/G《T1977C)的T等位基因、iL4D57 (G135C)的C等位基因、Z尸D(Lys751Gln)的Lys等位基因分别增加个体患前 列腺癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌的风险。携带有此种基因型或单倍 型的个体更易患肿瘤。GSrM《T2517C)的T等位基因增加个体患肺癌的可能性， 而iVg07 ( C609T')的CC基因型增加个体患肺癌的风险，WX7G7(A11656G)的 GG基因型增加肺癌的易感性；Z/WIle658Val、 ，5^Arg72Pro、 Thr706Ala、 ^fiY7 Phe257Ser SNP突变均与肺癌易感性相关；Pro50Ser、 Z尸P Lys751Gln、 Z尸C Lys939Gln 、 ^尸/9"463G->A 、 iT C6V 194Trp/Arg 、 iffi^ Glu346Lys、缀尸V141L、腐6F7 Alal33Ser、 OT， Val432Leu、,腊al762Ala 等SNP突变均增加肺癌的易感性。这些特异性标记可以作为判断个体某肿瘤易 感性的分子标记，进行疾病预测，从而可确定患某肿瘤的高危人群。SNP基因座的研究大多是逐个位点进行的，检测手段或者使用测序技术， 或者采用测序或者采用限制性内切酶消化的方法，前者技术复杂，费用昂贵； 后者操作繁琐、准确性差。复合扩增(Multiplex PCR)又称为多重PCR，即在 一个反应体系中使用多套引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行 扩增的过程。它可大幅度地简化操作程序、节省时间和试剂，同时能满足同时 分析不同基因位点的需要。基于检测体系的不同，目前世界上将复合扩增主要可以分为两大类硝酸 银染色复合扩增和荧光复合扩增。前者是复合扩增后的产物利用普通电泳槽分 离，进行硝酸银染色检测的方法，方法简单，成本较低，在普通实验室可以开 展这个项目。但由于所得结果只是单种颜色，故其复合扩增试剂盒的位点数不 能太多， 一般1次复合扩增的位点不能超过4个，否则会因为不同位点的扩增 产物互相重叠，难以区分检材的基因型。再加上所得结果是用肉眼观察，所以 其灵敏度受到一定的限制。荧光复合扩增是在普通复合扩增PCR的其中一条引物一端加上荧光标记， 利用自动激光荧光遗传检测仪检测PCR扩增产物，结果准确、灵敏度高、自动 化程度高、可重复性强等。用一种颜色的荧光素标记一组3或4个基因位点(其 扩增片段不能相重叠)，另一种颜色的荧光素标记另一组3或4个基因位点，多 种荧光素则可以标记多组不同的基因位点。目前自动激光荧光遗传检测仪可以 检测几十种荧光素，但在一个反应体系中，最多可以同时检测5种荧光素，除 其中一种用作内标外，其余四种荧光素可以用于标记产物，加在一起，就可以 达到1次检测IO个以上的基因位点的目的。荧光复合扩增已成为目前先进的复合扩增方法。
本发明筛选了 11个已经过研究证明与肺癌易感性相关的SNP基因座，根据 引物特异性PCR的原理，每个SNP基因座设计了 3条引物。在每一个SNP基因 座侧面100-280bp范围内设计了一条引物，作为该基因座的共享引物，并在引 物5，末端选用一种荧光物质标记；针对SNP基因座的不同等位基因，又设计了 分别与SNP基因座不同等位基因相匹配的两条引物，作为特异性引物，引物3' 末端的最后一个碱基分别与SNP基因座不同等位基因的碱基匹配，但由于只有3' 末端的最后一个碱基不匹配往往不能抑制扩增，所以为了防止错误性扩增，3' 末端第3或4位碱基人为引入一个错配碱基，这是引物设计最为关键的部分； 最后为了在检测时自动区分不同的等位基因，设计引物时两条引物长度相差4bp (如果两条引物Tm值相差过大，则人为引入TATA四个碱基，这是引物差异设 计的另一个关键，因为TATA对引物的退火温度影响最小，同时又满足了扩增片 断长度不同的要求)，所有引物长度18-28bp，为了便于复合扩增，所有引物的 Tra值保持在60士0.5'C，为了减少引物之间的竞争抑制，对反应体系中不同SNP 位点的引物浓度进行调整，获得了最佳引物浓度配比，防止了非特异性扩增片 断的产生。利用该试剂盒，就能方便地同时对肺癌易感性相关的11个SNP基因 座进行复合扩增，获得各基因座的基因型结果；同时，利用该试剂盒提供的等 位基因分型标准物，利用基因分析软件(Genetyper2.5.2)，还可以方便地自动 检测、分析扩增结果。
图1为蓝色荧光标记物6-FAM的结构式。图2为黄色荧光标记物6-TAMRA(Tetramethyl-rhodamine)的结构式。图3为绿色荧光标记物JOE(6-carboxy誦4，，5，-dichloro画2，，7，-dimethoxy-fluorescein)的结构式。图4为红色荧光标记物6-ROX(X-RHODAMINE)的结构式。
具体实施方式
本试剂盒是由分离包装的11个SNP位点引物混合物、DNA聚合酶、反应缓冲液(含MgC12)、以及11个SNP位点等位基因分型标准物和质控DNA构成。11个SNP基因座的引物混合物2. 0ml(不同基因座引物浓度不相同，从30nM-240 nM，每个20ul的复合PCR反应体系中用量为2ul); DNA聚合酶1000u (5u/pl每个20ul的复合PCR反应体系中用量为lu);缓冲液2. Oml (10倍浓縮缓冲液，每个20ul的复合PCR反应体系中用量为2ul);等位基因分型标准物混合物总量1 ml (40nM，供1000次检测使用)，等位基因分型标准物混合物中所含各个基因座的等位基因分型标准物等量；质控DNAO. lml (10ng/ul)。荧光复合扩增的技术核心主要在于引物序列与荧光标记的位置以及各种引 物的浓度配比。在本发明试剂盒中，11个SNP位点均为已有研究表明与肺癌易 感性密切相关的基因座，其参考序列均可通过NCBI查阅，ll个SNP位点的名录为IL4SOT(Alal33Ser) ， MBZ)《Glu346Lys) ， APZ)(Lys751Gln) , A3 CC/(194Trp/Arg)， ^LD户i rO/7624/") ， CTil 5/(Val432Leu)， 及五K/(Phe257Ser) ， APC(Lys939Gln)， GSrM^(T2517C)， ^A7iV2(Pr。5。Ser)，户丄O/(Thr706Ala)。11个肺癌易感性相关SNP位点引物序列为RASSFl-pub-5，-Fl-GAAGCCCTGGGTTCCTCAA-3， (RASSF1位点共享引物， Fl荧光素标记)RASSF 1 -spe 1 -5 ，-GATCTTCTGCTCAATCTCGGC-3 ， ( RASSF1位点特异性弓I物 1，针对C等位基因)RASSFl-spe2-5，-TATAGATCTTCTGCTCAATCTCGGA -3， (RASSF1位点特异 性引物2，针对A等位基因)MBD4-pub-5 ，-F1-TTTCCTGGTTGGTGAGCAGTT-3 ， ( MBD4位点共享引物，Fl荧光素标记)MBD4-spel-5，-GCCAAAGACTCAGAACACACCA-3， (MBD4位点特异性引物 1，针对A等位基因)MBD4-spe2-5，- TATATCCAAAGACTCAGAACACATCG-3， (MBD4位点特异性 引物2，针对G等位基因)XPD-pub-5，-Fl-CGGACATCTCCAAATTCATTCA-3， (XPD位点共享引物，Fl 荧光素标记)XPD—spel-5，-CTGAGCAATCTGCTCTATCCTGTT-3， (XPD位点特异性引物1， 针对T等位基因)XPD -spe2-5，-TATACTGAGCAATCTGCTCTATCCTATG-3， (XPD位点特异性引 物2，针对G等位基因)
XRCCl-pub-5，-Fl-TCCAGACAAAGATGAGGCAGAG-3， (XRCC1位点共享引 物，Fl荧光素标记)XRCC1 -spe 1 -5 ，-CTGGGGATGTCTTGTTGAACC-3 ， ( XRCC1位点特异性引物1，针对G等位基因)XRCC 1 -spe2-5 ，匿TATATTGGGGATGTCTTGTTGAGCT-3 ， ( XRCC 1位点特异性 引物2，针对A等位基因)ADPRT-pub-5，-F2-CAGCAGGAGGGTTTGCCA-3， (ADPRT位点共享引物，F2 荧光素标记)ADPRT-spel-5，-AGCAGGTTGTCAAGCATTTACG-3， (ADPRT位点特异性引 物l，针对C等位基因)ADPRT-spe2-5，-TATAAGCAGGTTGTCAAGCATTTACA-3， (ADPRT位点特异 性引物2，针对T等位基因)CYPlBl-pub-5，画F2-GAGGGACCGTCTGCCTTGTA-3， (CYP1B1位点共享引物， F2荧光素标记)CYPlBl-sepl-5，-CCGGGTTAGGCCACTTGAG-3， (CYP1B1位点特异性引物1， 针对C等位基因)CYPlBl-s印2-5，-TATACCGGGTTAGGCCACTTTAC-3， (CYP1B1位点特异性引 物2,针对G等位基因)REVl-pub-5，-F2-AGTCAATGGCATGAACAGTTGG-3， (REV1位点共享引物，F2荧光素标记)REVl-spel-5，-CCTTATCCTCCTCCTGGGAAA-3， (REV1位点特异性引物1， 针对T等位基因)REVl-spe2-5，-TATACCTTATCCTCCTCCTGGGTAG-3' (REV1位点特异性引物 2，针对C等位基因)XPC-pub-5，-F2-TGATTACTAACCCTCGCCTGTG-3， (XPC位点共享引物，F2 荧光素标记)XPC-spel-5'-GGCGCTCAGCTCACAGGTT-3， (XPC位点特异性引物1，针对 A等位基因)XPC —spe2-5，-TATAAGCGCTCAGCTCACAGTTG-3， (XPC位点特异性引物2, 针对C等位基因)GSTM4-pub-5 ，-F3-GGAAAGGCGTCCAAGCAGT-3 ， ( GSTM4位点共享引物，F3荧光素标记)GSTM4-sepl-5，-GGCCATGGTTTGTTGGACAC-3， (GSTM4位点特异性引物1， 针对C等位基因)GSTM4-sep2-5，-TATAGGCCATGGTTTGTTGGATAT—3， (GSTM4位点特异性引 物2，针对T等位基因)AXIN2-pub-5，-F4-CAGCAGCAGCTTCCGTGAG-3， (AXIN2位点共享引物，F4 荧光素标记)AXIN2-spe 1 -5 ，-CCTGGTGTTGGAAGAGACTGG-3 ， ( AXIN2位点特异性引物1，针对C等位基因)AXIN2-spe2-5，TATACCTGGTGTTGGAAGAGACCGA-3， (AXIN2位点特异性 引物2，针对T等位基因)PLOI-pub-5，—F4-CAGATAGCCATAAGCAAACAGTAGC-3， (PLOI位点共享引 物，F4荧光素标记)PLOI-spel-5，-ATGTGGAAATCTGATCCGGC-3， (PLOI位点特异性引物1，针 对G等位基因)PLOI-spe2-5，-TATAATGTGGAAATCTGATCCGGT-3， (PLOI位点特异性引物2， 针对A等位基因)四种荧光素的名称和结构分别为Fl:蓝色荧光标记物6-FAM，结构式为图l。F2:黄色荧光标记物6-TAMRA(Tetramethyl-rhodamine)，结构式为图2。F3:纟录色荧光丰示"i己物JOE(6曙carboxy-4，,5，一dichloro國2，，7，-dimethoxy國fluorescein)，'结构式为图3。F4:红色荧光标记物6-ROX(X-RHODAMINE)，结构式为图4。 需要说明的是四种荧光标记物可以互换。上述引物的设计是极为关键的，其设计需要考虑以下几个方面的要素(1)、 所有位点同时得到扩增，即所有引物对的退火温度须相近；(2)引物之间不形 成引物二聚体；(3)、不形成二级结构。本发明的试剂盒中包含了上述11个SNP基因座的所有引物，每个位点3条
引物，其中一条是共享引物，分别用不同的荧光素标记，另外两条引物针对不同的SNP等位基因设计，与共享引物分别配对扩增不同的等位基因，由于引物 长度不同，所以不同的等位基因扩增产物长度不同， 一般相差4bp，通过自动激 光荧光遗传检测仪检测，就可以根据产物长度的不同区分不同的等位基因，如 果是纯合子，只能得到l个产物峰；而如果是杂合子，则可以得到两个产物峰。
对于SNP等位基因的检测，最直接最准确的方法是基因测序，但这种方法 只能逐个位点进行，效率低下、技术要求高而且费用昂贵；其次常用的方法是 根据SNP位点的等位基因，寻找适合的限制性内切酶，根据限制性内切酶消化 后产物长度的不同，区分不同的等位基因，但这种方法也只能逐个位点SNP进 行检测，而且有时会由于酶的消化不完全而得出错误结论，所以具有效率低下、 准确性差的缺点。本方法将11个SNP位点在一个反应管中同时扩增，同时检测， 效率大大提高，结合基因分析软件(GenoTyper2.5.2)可以自动对结果进行分 析， 一天可以完成上百例样品的检测；由于荧光检测具有高灵敏性，所以检测 所需要的样品量极其微量， 一次只需要5-10ng;不同等位基因的扩增产物长度 相差4bp，完全能满足检测的要求；通过调试引物浓度，获得了最佳引物浓度配 比，可以有效抑制非特异性扩增产物的出现；本试剂盒中选择的SNP位点均位 肺癌易感性相关基因位点，可以在肺癌易感风险预测中发挥重要作用，达到一 级预防的目的。
在进行复合扩增反应时，可在PCR反应体系中同时加入本试剂盒中分离包 装的引物混合物、DNA聚合酶、缓冲液和常规反应所需的四种脱氧核苷三磷酸， 就可以进行有效地PCR扩增。具体反应体系如下-样品DNA (5-10ng) lul 引物混合物 2uldNTPs 1. 6ul缓冲液 2ulDNA聚合酶 0. 2ul (lu)无菌去离子水补充至 20ul本发明的试剂盒中还提供了用于规范不同实验室检验结果的质控DNA样品 和11个SNP位点等位基因分型标准物(Ladder),质控DNA样品是已经过测序 确证了的按照本试剂盒的操作说明能够准确分型的DM样品，可以作为阳性对 照或标准DNA样品使用；等位基因分型标准物是发明人收集了所有11个SNP位 点所有等位基因的扩增产物，用于基因分析软件自动分型时作为标准使用，采 用该等位基因分型标准物，可以快速、准确对检测结果进行分型；同时只要将 等位基因分型标准物与样本PCR扩增产物同步电泳，不同的实验室，不同的设 备，不同的电泳方法，均可得到一致的可重复性结果，可以用于规范不同实验 室的检测结果，避免了因电泳引起的误差。本发明试剂盒能够高效率地对ll个肺癌易感性相关的SNP基因座进行复合 扩增，通过自动荧光测序仪进行检测分型，达到高自动化水平，实验结果准确、 可重现性好的目的，本发明的试剂盒用于肺癌预测和风险性评价具有很大的优 势和潜力。
权利要求
1、一种11个肺癌易感性相关SNP位点多色荧光复合扩增试剂盒，该试剂盒包括a)引物混合物，b)DNA聚合酶，c)缓冲液(含MgCl2)，d)质控DNA，e)等位基因分型标准物混合物，其特征是引物混合物由11条荧光标记共享引物和22条针对不同等位基因的长度特异性引物组成；分别针对11个肺癌易感性相关SNP基因位点，分别为RASSF1(Ala133Ser)，MBD4(Glu346Lys)，XPD(Lys751Gln)，XRCC1(194Trp/Arg)，ADPRT(Val762Ala)，CYP1B1(Val432Leu)，REV1(Phe257Ser)，XPC(Lys939Gln)，GSTM4(T2517C)，AXIN2(Pro50Ser)，PLOI(Thr706Ala)。
2、 一种长度特异性PCR引物设计方法，其特征是在每一个SNP基因位点侧面设计一条共享引物，并在引物5'末端选用一种荧光物质标记;针对SNP基 因位点的不同等位基因，又设计了针对SNP基因座不同等位基因的两条引物， 两条引物长度不同，作为特异引物。
3、 根据权利要求1所述的11个肺癌易感性SNP基因位点引物序列为RASSFl-pub-5，-Fl-GAAGCCCTGGGTTCCTCAA-3， (RASSF1位点共享引物， Fl荧光素标记)RASSF1画spe 1 -5 ，國GATCTTCTGCTCAATCTCGGC-3 ， ( RASSF1位点特异性引物 1，针对C等位基因)RASSFl誦spe2國5，誦TATAGATCTTCTGCTCAATCTCGGA -3， (RASSF1位点特异 性引物2，针对A等位基因)MBD4-pub-5 ，-Fl-TTTCCTGGTTGGTGAGCAGTT-3 ， (MBD4位点共享引物，Fl荧光素标记)MBD4-spel-5，-GCCAAAGACTCAGAACACACCA-3， (MBD4位点特异性引物 1，针对A等位基因) MBD4-spe2國5 ，國TATATCCAAAGACTCAGAACACATCG-3 ， (MBD4位点特异性 引物2，针对G等位基因)XPD-pub-5，-Fl-CGGACATCTCCAAATTCATTCA-3， (XPD位点共享引物，Fl 荧光素标记)XPD—spel-5，-CTGAGCAATCTGCTCTATCCTGTT-3， (XPD位点特异性引物1， 针对T等位基因)XPD—spe2-5，-TATACTGAGCAATCTGCTCTATCCTATG-3， (XPD位点特异性引 物2,针对G等位基因)XRCC1 -pub-5 ， -Fl -TCCAGACAAAGATGAGGC AGAG-3 ， ( XRCC1位点共享引物，Fl荧光素标记)XRCCl-spel-5，-CTGGGGATGTCTTGTTGAACC-3， (XRCC1位点特异性引物 1，针对G等位基因)XRCC 1 -spe2-5 ， -TATATTGGGGATGTCTTGTTGAGCT—3, ( XRCC 1位点特异性 引物2，针对A等位基因)ADPRT—pub-5，—F2-CAGCAGGAGGGTTTGCCA-3， (ADPRT位点共享引物，F2 荧光素标记)ADPRT-spe 1 -5，-AGCAGGTTGTCAAGCATTTACG-3， ( ADPRT位点特异性弓I 物l，针对C等位基因)ADPRT—spe2-5，画TATAAGCAGGTTGTCAAGCATTTACA-3， (ADPRT位点特异 性引物2，针对T等位基因)CYPlBl誦pub-5，-F2國GAGGGACCGTCTGCCTTGTA-3， (CYP1B1位点共享引物， F2荧光素标记)CYPlBl-sepl-5，-CCGGGTTAGGCCACTTGAG-3， (CYP1B1位点特异性引物1， 针对C等位基因)CYP1B1-sep2画5，誦TATACCGGGTTAGGCCACTTTAC-3， (CYP1B1位点特异性引 物2，针对G等位基因)REV 1 -pub- 5 ， -F2-AGTC AATGGC ATGAAC AGTTGG-3 ， ( REV 1位点共享引物，F2荧光素标记)REVl-spel-5，-CCTTATCCTCCTCCTGGGAAA-3， (REV1位点特异性引物1， 针对T等位基因)REVl-spe2-5，-TATACCTTATCCTCCTCCTGGGTAG-3' (REV1位点特异性引物 2，针对C等位基因)XPC-pub画5，-F2画TGATTACTAACCCTCGCCTGTG-3， (XPC位点共享引物，F2 荧光素标记)XPC —spel-5，-GGCGCTCAGCTCACAGGTT-3， (XPC位点特异性引物1 ，针对 A等位基因)XPC —spe2-5，-TATAAGCGCTCAGCTCACAGTTG-3， (XPC位点特异性弓|物2， 针对C等位基因) GSTM4-pub-5 ，-F3-GGAAAGGCGTCCAAGCAGT-3 ， ( GSTM4位点共享引物，F3荧光素标记)GSTM4-sepl-5，-GGCCATGGTTTGTTGGACAC-3， (GSTM4位点特异性引物1, 针对C等位基因)GSTM4-sep2-5，-TATAGGCCATGGTTTGTTGGATAT—3， (GSTM4位点特异性引 物2，针对T等位基因)AXIN2-pub-5，-F4-CAGCAGCAGCTTCCGTGAG-3， (AXIN2位点共享引物，F4 荧光素标记)AXIN2-spe 1 -5 ，-CCTGGTGTTGGAAGAGACTGG-3 ， ( AXIN2位点特异性引物1，针对C等位基因)AXIN2-spe2-5，TATACCTGGTGTTGGAAGAGACCGA-3， (AXIN2位点特异性 引物2，针对T等位基因)PLOI—pub-5 ，—F4-CAGATAGCCATAAGCAAACAGTAGC-3 ， ( PLOI位点共享引物，F4荧光素标记)PLOI-spel-5，-ATGTGGAAATCTGATCCGGC-3， (PLOI位点特异性引物1，针 对G等位基因)PLOI—spe2-5，-TATAATGTGGAAATCTGATCCGGT-3， (PLOI位点特异性引物2， 针对A等位基因)四种荧光素的名称分别为Fl:蓝色荧光标记物FAM; F2:黄色荧光标记物TAMRA; F3:绿色荧光标记 物JOE; F4:红色荧光标记物ROX;四种荧光标记物可以互换。
4、根据权利要求1所述的一种11个肺癌易感性相关SNP位点多色荧光复 合扩增试剂盒，其特征是各组份的用量比为11个SNP基因座的引物混合物 2.0ml (不同基因座引物浓度不相同，从30nM-240 nM，每个20ul的复合PCR反 应体系中用量为2ul); DNA聚合酶lOOOu (5u/pl每个20ul的复合PCR反应 体系中用量为lu);缓冲液2. Oml (IO倍浓縮缓冲液，每个20ul的复合PCR反 应体系中用量为2ul);等位基因分型标准物混合物总量1 ml (40nM，供1000 次检测使用)，等位基因分型标准物混合物中所含各个基因座的等位基因分型标 准物等量；质控DNAO. lml (10ng/ul)。
5、根据权利要求2所述的一种长度特异性PCR引物设计方法，其特征是 针对每个SNP位点不同的等位基因，两条特异性引物3'末端的最后一个碱基 分别与SNP基因座不同等位基因的碱基匹配，并在3'末端第3或4位碱基人为 引入一个错配碱基； 一条引物的5'端人为增加TATA四个碱基，两条特异性引 物长度相差4bp;所有引物的Tm值尽可能保持一致，相差不超过rC。
6、 根据权利要求1所述的一种11个肺癌易感性相关SNP位点多色荧光复 合扩增试剂盒，在快速、准确检测肺癌易感性SNP基因型中的应用。７、 根据权利要求2所述的一种长度特异性PCR引物设计方法，在SNP位点 等位基因检测中引物设计的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于体外一次性多色荧光复合扩增肺癌易感性相关的11个SNP基因座的试剂盒，是由分离包装的引物混合物、DNA聚合酶、缓冲液、质控DNA样品和等位基因分型标准物混合物构成。引物混合物由11条荧光标记的共享引物和22条针对不同等位基因的长度特异性引物组成，具体组成为引物混合物2.0ml(不同基因座引物浓度不相同，从30nM-240nM)；DNA聚合酶1000u；缓冲液2.0ml；等位基因分型标准物混合物总量1ml；质控DNA0.1ml(10ng/ul)。本发明在最佳引物配比条件下，可快速、准确获得11个肺癌易感性相关的SNP位点的基因型。
文档编号G01N21/00GK101158633SQ20071011277
公开日2008年4月9日 申请日期2007年6月17日 优先权日2007年3月24日
发明者王瑞恒 申请人:辽宁师范大学