专利名称：：荭草苷标准品的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药提取物标准品的制备方法，特别是涉及荭草苷标准品的制备方法。
背景技术：
：本品荭草苷来源于毛茛科植物金莲花，在竹叶、荭草等植物中均有分布。目前主要用于金莲花、竹叶和荭草等药材的质量控制以及含有金莲花、竹叶和荭草等药材的中药制剂的质量控制。目前荭草苷标准品的制备方法存在收率低，成本高并且纯度不够等缺点。
发明内容本发明目的在于公开荭草苷标准品的制备方法。本发明所述的荭草苷标准品是通过如下步骤制备的步骤I:金莲花药材，加相当于生药重量6-10倍量的50-80%乙醇回流提取2-4次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓縮至浸膏；步骤II:浸膏用常规溶剂溶解，经过硅胶柱层析，60-80:20-40:5-15的氯仿甲醇水的下层溶液洗脱，洗脱溶液采用薄层色谱检测，合并含有荭草苷的洗脱液，得纯度70-80%荭草苷粗品；步骤III:荭草苷粗品加70-100%甲醇溶解，经羟丙基葡聚糖凝胶(S印hadexLH-20)柱层析，70-100%甲醇洗脱；步骤IV:洗脱液用HPLC检测纯度，合并纯度大于98%的洗脱液，即得荭草苷。上述的荭草苷标准品制备中TLC系统检测，展开溶剂为60-70:25-45:5-15的氯仿甲醇水的下层溶液展开。本发明所述的荭草苷标准品制备优选如下方法步骤I:金莲花药材，加生药按重量比计8倍量70%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓縮至浸膏；步骤II:浸膏用常规溶溶解剂，经过硅胶柱层析，70:30:10的氯仿甲醇水的下层溶液洗脱，收集含有荭草苷的洗脱液，洗脱液采用薄层色谱检测(TLC)检测，展开溶剂为65:35:IO的氯仿甲醇水的下层溶液展开,合并含有荭草苷的洗脱液，得纯度70-80%荭草苷粗品；步骤m:荭草苷粗品加80%甲醇溶解，S印hadexLH-20柱层析，80%甲醇洗脱；步骤IV:洗脱液用HPLC检测纯度，流动相为乙腈-0.1%磷酸水为12:88，检测波长350nm，合并纯度大于98%的洗脱液，即得荭草苷标准品。所述浸膏可以用现有技术中公开的溶剂溶解，如甲醇，然后干法上样。本发明公开荭草苷标准品的制备方法具有如下特点(1)工艺简单，成本低廉该标准品的制备首先采用50%80%浓度间的乙醇回流提取，溶剂经减压回收以后，得浸膏，上硅胶柱色谱层析，以不同比例的氯仿-甲醇-水下层溶剂系统为洗脱剂，并采用TLC检测，合并含有荭草苷的洗脱液，得荭草苷粗品；经反复试验，选用硅胶柱色谱层析能够很好的去除色素和其它杂质，得到荭草苷粗品；在实验过程中，如对比采用丙酮-乙酸乙酯系统为洗脱剂，洗脱效果不好，洗脱流程长，且乙酸乙酯极性较小，不利于荭草苷的洗脱，且容易引进其它极性较小的杂质；曾选用乙酸乙酯-甲醇(9:1)等为洗脱剂，洗脱流程长，得到的荭草苷粗品纯度低(约6070%)且去除色素效果不好；选用氯仿-甲醇-水(60-80:20-40:5-15)下层溶剂为洗脱剂，洗脱流程短，去除色素和其它杂质的效果好，荭草苷粗品的纯度能达到7080%;荭草苷粗品的进一步纯化；对硅胶柱色谱等进行考察，发现不但流程长，浪费试剂，且由于硅胶柱色谱的特性，吸附性较大，得到的收率低，同时去除色素效果不好，含有其它杂质，荭草苷标准品的纯度达不到98.0%;采用S印hadexLH-20柱色谱进行纯化，由于以80%甲醇为洗脱剂，可回收利用且流程短，几乎不产生吸附，收率较高，同时去除色素和其它杂质的效果好，一般经一次S印hadexLH-20柱色谱纯化，能得到7585%的荭草苷标准品。(2)收率高本法制得的荭草苷标准品收率在0.050.1%之间，即平均1000g金莲花药材即可制得500mg荭草苷标准品，获得很高的收率；(3)稳定性好本法制得的荭草苷标准品的稳定性很好，经试验，在粉末状态，在两年内稳定性良好；在溶液状态，在48h内稳定性良好；(4)标准品纯度纯度在98.0%以上；下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明；实验例1S印hadexLH-20柱应用的实验纯化方法一般有硅胶柱层析纯化法、S印hadexLH-20柱纯化法和制备液相纯化法等。曾采用过硅胶柱层析纯化法，选用氯仿-甲醇-水(65:35:10)下层溶液为洗脱剂，由于硅胶柱吸附作用较强，荭草苷收率较低；且采用大量有机溶剂进行洗脱，不能回收使用，成本较高；另外纯化得到的荭草苷纯度有时不够98.0%，需进行进一步纯化。制备液相纯化法费时且成本高，一般不适用于大量标准品的制备。S印hadexLH-20柱纯化法，以80%甲醇为洗脱溶剂，洗脱溶剂可回收使用，洗脱流程很短，且没有死吸附，收率较高，得到的荭草苷标准品的纯度也较高，一般都能够达到98.0%。结果见表l。表l项目硅胶柱层析制备液相S印hadexLH-20柱纯化流程长长短成本高很高低收率(％)<0.050.05-0.10.05-0.1纯度(％)<98.0》98.0采用S印hadexLH-20柱进行纯化，曾采用氯仿-甲醇(1:1)系统进行洗脱，分离效果不好，荭草苷标准品纯度不是很高，大于98.0%纯度的洗脱液较少，并且成本较高，说明氯仿-甲醇系统不适用。还曾选择40-60%甲醇为洗脱溶剂进行洗脱，杂质与荭草苷的分离效果不好，有时交叉较严重，标准品的纯度不高，还需进行纯化。后以80%甲醇为洗脱溶剂进行洗脱，杂质与荭草苷的分离效果很好，荭草苷纯度较高，纯度一般均大于98.0%,收率较高，成本很低。经过筛选实验，说明80%甲醇为洗脱溶剂效果很好，成本很低且流程短，目前还没有应用S印hadexLH-20柱进行纯化的文献报道。实验例2硅胶柱、S印hadexLH-20柱结合与硅胶柱、硅胶柱结合效果的对比实验在荭草苷标准品的制备过程中，我们曾选用硅胶柱与硅胶柱结合的方法，结果实验流程很长，成本很高，并且收率很低，标准品纯度低，往往需再次纯化；硅胶柱与S印hadexLH-20柱结合，结果实验流程短，溶剂可回收利用，成本低，并且收率高，标准品纯度高。结果见表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>下述实施例均能够实现上述实验例所述的效果具体实施例方式实施例l:荭草苷制备方法金莲花药材，加生药10倍量50%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓縮至浸膏；该浸膏用甲醇溶解，干法上样，经过硅胶柱层析，70:30:10氯仿甲醇水的下层溶液为洗脱剂，洗脱，TLC检测，65:30:10氯仿甲醇水的下层溶液为展开剂，展开，收集含有荭草苷的洗脱液，加80%甲醇溶解，S印hadexLH-20柱层析，80%甲醇洗脱；洗脱液用HPLC检测纯度，流动相为12:88的乙腈-0.1%磷酸水，检测波长350mn合并纯度大于98^的洗脱液，即得荭草苷；实施例2:荭草苷制备方法金莲花药材，加生药7倍量60%乙醇回流提取2次，每次3小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓縮至稀膏状；浸膏经过硅胶柱层析，80:22:5的氯仿甲醇水的下层溶液为洗脱剂，洗脱，TLC检测，70:30:10的氯仿甲醇水的下层溶液为展开剂展开，收集含有荭草苷的洗脱液，加70%甲醇溶解，S印hadexLH-20柱层析，75%甲醇洗脱；洗脱洗脱液用HPLC检测纯度，流动相乙腈-0.1%磷酸水为14:82,检测波长350nm,合并纯度大于98%的洗脱液，即得荭草苷。实施例3:荭草苷制备方法金莲花药材，加生药6倍量60%乙醇回流提取4次，每次1小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓縮至稀膏状；浸膏经过硅胶柱层析，65:35:10的氯仿甲醇水的下层溶液为洗脱剂，洗脱，TLC检测，60:4(hl0的氯仿:甲醇水的下层溶液为展开剂展开，收集含有荭草苷的洗脱液，加甲醇溶解，S印hadexLH-20柱层析，甲醇洗脱；洗脱洗脱液用HPLC检测纯度，流动相乙腈-0.1%磷酸水为16:82，检测波长350nm，合并纯度大于98%的洗脱液，即得荭草苷。权利要求1、一种荭草苷标准品的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤步骤I金莲花药材，加相当于生药重量6-10倍量的50-80％乙醇回流提取2-4次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至浸膏；步骤II浸膏用常规溶剂溶解，经过硅胶柱层析，60-8020-405-15的氯仿甲醇水的下层溶液洗脱，洗脱溶液采用薄层色谱检测，合并含有荭草苷的洗脱液，得纯度70-80％荭草苷粗品；步骤III荭草苷粗品加70-100％甲醇溶解，SephadexLH-20柱层析，70-100％甲醇洗脱；步骤IV洗脱液用HPLC检测纯度，合并纯度大于98％的洗脱液，即得荭草苷。2、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于该方法步骤II中的薄层色谱检测展开溶剂为氯仿甲醇水60-70:25-45:5-15的下层溶液。3、如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤IV中的HPLC检测纯度时流动相10-20:80-90的乙腈-0.1%磷酸水，检测波长350nm。4、如权利要求1_3所述的任意一种制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤步骤I:金莲花药材，加生药按重量比计8倍量70%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至浸膏；步骤II:浸膏用常规溶剂溶解，经过硅胶柱层析，70:30:10的氯仿甲醇水的下层溶液洗脱，收集含有荭草苷的洗脱液，洗脱液采用TLC系统检测，展开溶剂为65:35:10的氯仿甲醇水的下层溶液，合并含有荭草苷的洗脱液，得纯度70-80%荭草苷粗品；步骤m:荭草苷粗品加80%甲醇溶解，S印hadexLH-20柱层析，80%甲醇洗脱；步骤IV:洗脱液用HPLC检测纯度，流动相为乙腈-0.1%磷酸水为12:88,检测波长350nm,合并纯度大于98%的洗脱液，即得荭草苷标准品。全文摘要本发明公开了一种荭草苷标准品的制备方法，该方法包括如下步骤步骤I金莲花药材，加50-80％乙醇回流提取，减压回收乙醇并浓缩至膏状；步骤II浸膏经过硅胶柱层析，洗脱，收集含有荭草苷的洗脱液；洗脱液采用薄层色谱检测，合并含有荭草苷的洗脱液，得纯度70-80％荭草苷粗品。步骤III荭草苷粗品加70-100％甲醇溶解，SephadexLH-20柱层析，70-100％甲醇洗脱；步骤IVSephadexLH-20洗脱液用HPLC检测纯度，合并纯度大于98％的洗脱液，即得荭草苷；本方法收率高、稳定性好。文档编号G01N1/34GK101387586SQ200710121800公开日2009年3月18日申请日期2007年9月14日优先权日2007年9月14日发明者周长奎,张安静,黄泽奇申请人:黄泽奇