专利名称：丙型肝炎病毒包膜抗原elisa试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于丙型肝炎检测技术领域。更具体涉及一种丙型肝炎病毒包膜抗 原检测ELISA试剂盒，同时，本发明还涉及一种丙型肝炎病毒包膜抗原试剂盒检 测丙型肝炎病毒包膜抗原和病毒的方法，利用标记的多肽和E2抗体在作为检测 丙型肝炎病毒表面包膜抗原的酶联免疫吸附检测(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, EUSA)，可广泛应用于医学和生物学等相关领域。
背景技术：
丙型病毒性肝炎(简称丙型肝炎)是由丙型肝炎病毒(HepatitisC Virus, HCV) 引起的肝脏炎症性疾病。HCV感染呈全球性分布，主要通过血液传播。据世界 卫生组织统计，全球HCV感染率约为3%，估计有l. 7亿人感染HCV，每年新发 丙型肝炎病例约3.5万。我国血清流行病学调查资料显示， 一般人群抗HCV阳性 率为3.2%,各地区感染率有一定差异。急性HCV感染者约80。/。发展为慢性丙型 肝炎(CHC)，在20年间约20%可发展为肝硬化，每年约有1% 4%肝硬化患者发 展为肝癌。CHC己成为不可忽视的重要疾病，及早发现和治疗CHC患者已受 到重视。CHC治疗目的包括根除或长期抑制病毒复制，减轻肝内炎症和纤维化， 最终阻止进展为肝硬化、肝癌和肝功能衰竭，并提高患者的生活质量。
HCV病毒颗粒直径30 60nm，含类脂外膜，属于黄病毒科，是一种单股正 链RNA病毒，全长约9500bp， HCV整个基因组只有一个可读框(ORF)，位于基因 组中央。在基因组的5'和3'末端各有一段非编码序列。5'末端有一个长度和序列 非常稳定的非编码区(URT)，可以说是整个基因组最为保守的区域，长度是341 个核苷酸。3'末端非编码区由三部分组成，从编码病毒前体蛋白的可读框的第一 个终止密码之后是30 40个核苷酸的非编码变异序列，然后是polyU (或polyA) 结构，最后面有98个核苷酸的高保守序列。中间是几乎跨越了整个基因组的大的ORF，由9 033个核苷酸组成，能编码约3 010 3 033aa的病毒前体多聚肽，经过 蛋白酶切割修饰后，前体多肽产生2种结构蛋白，即核心蛋白(C区)和膜蛋白(E 区)，5种非结构区蛋白NSt 、 NS2 、 NS3 、 NS4和NSs。 HCV的复制是利用RNA 指导的RNA多聚酶，又称RDRP，并无阅读保护酶来修正复制中的错误，因而HCV 的变异较大，尤其在结构基因的E区的3'末端和非结构基因的NS1区的5'末端之 间是一个高度可变区，在结构基因的C区和非结构基因的NS3、 NS4和NS5区则保 守性较高。
目前，临床上检测HCV感染的方法大致包括(1) ELISA法检测抗-HCV抗 体，包括重组免疫印迹(RIBA); (2) PCR检湖ijHCV的RNA，包括荧光PCR、免疫 PCR法(PCR -ELISA)、及用于定量的bDNA和NASBA技术；(3)基因型芯片检 测技术。酶联免疫吸附法检测抗HCV的特异性好，灵敏度高，操作简便，目前 己成为采供血机构检测抗-HCV的常规方法。然而抗-HCV样本的浓度介于试剂盒 临界范围时，由于受到各种不确定因素如试剂盒的敏感度、操作人员技术熟练程 度及其责任心、实验室温度、加样器等影响，很可能造成假阳性或假阴性的结果。 文献曾报道用ELISA法检测抗-HCV灰带区血样经重复检测有12.6 %(11/87)的 假阴性率。对落在灰区范围内的随机抽样样本进行的PCR检测中，HCVRNA的 阳性率为18%(3/17)，表明灰区内样本确实存在着病毒复制。如果没有设置灰区， 一年之内就可能有5份抗-HCV阳性的样本输入到无辜的患者体内。为提高抗 -HCV的检出率，最大限度地防止漏检，提高输血的安全性，笔者认为灰区的设 置有着重要的意义。至于灰区的范围应该多大才合适，还须做进一步的研究。对 于落在灰区内的样本应进行重复检验。有条件的单位应予行PCR检测，以提高 检验的准确性。PCR检测HCV的RNA，特别是支链DNA(bDNA)技术的最大特 点是不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素少，因此稳定性、 重复性高，用于HCV RNA的动态水平研究结果准确。但bDNA技术的局限性也 显而易见，即放大倍数少、敏感性低、检测范围窄、不适用于HCVRNA的低水 平检测。基因芯片技术适用于研究HCV的流行病学、变异趋势、传播途径，对 丙型肝炎患者判断病情、指导治疗、预测疗效及预后有重要意义，但其成本高， 易出现假阳性。
由于现有的临床检测HCV感染的方法的各种局限性，临床工作者迫切希望
4出现一种新型的临床检测HCV的方法，该方法应具有特异性高，成本低廉，操 作简便，诊断迅速的特点。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种丙型肝炎病毒包膜抗原ELISA试剂盒，能快 速、灵敏、准确的检测丙型肝炎病毒。
本发明另一个目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒包膜抗原ELISA试剂盒 的检测方法，该方法特异性高，成本低廉，检测速度快，操作方便，省时效率高。
本发明的丙型肝炎病毒包膜抗原试剂盒在快速检测HCV感染中可广泛应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施
一种快速检测丙型肝炎病毒包膜抗原ELISA的试剂盒，该试剂盒包括
a. 生物素等标记的能与HCVE2蛋白特异性结合的12肽；
b. 多肽为SEQIDNO:l、 SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:4所示的序
列；
c. 兔抗E2的的多克隆抗体；
d. 辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；
e. 辣根过氧化物酶底物；
f. 酶标板(CellStar@,购自武汉大风生物科技有限公司)；
g. E2蛋白作为标准阳性对照；
h、酶联免疫检测仪(购自南京华东电子集团医疗装备有限公司。
核糖体文库筛选技术是将编码随机肽的DNA文库在体外转录、翻译，转录 产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以 共价键结合，形成mRNA—核糖体一蛋白质三聚体结构，此三聚体形式将蛋白 和mRNA信息连接在一起，使基因型和表型得到统一。利用固相化抗原或受体 的特异性的单克隆抗体亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的 mRNA—核糖体一多肽复合物，通过降低Mg^浓度，核糖体解离，释放mRNA， 回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA,PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经过几轮筛选，能找到与抗体特异性结合的多肽。近年来， 应用核糖体展示技术已进行了许多研究，如筛选配体或受体，筛选抗体或确定抗 原表位，开发新的蛋白酶抑制物和新的药物。
一种抑制丙肝病毒与人肝细胞结合的多肽具体制备步骤如下
一、制备E2-GST融合蛋白的步骤如下
A. 挑取含有pGEX-KG-E2(见参考文献Li， et al.， Engineering of 7V-glycosylation of Hepatitis C Virus Envelope Protein E2 Enhances T cell responses for DNA immunization, f^cc'we. 2007. 25:1544-1551.)的大
肠杆菌BL21DE3 (购自美国invitrogen公司)接种于3 ml含有氨节青 霉素(5p(ig/ml)的LB培养基中，对照组别接种含有pGEX-KG(GST蛋 白的原核表达载体，购自Amersham Biosciences公司)的大肠杆菌 BL21DE3, 37。C培养12~16小时。
B. 将小试管中的菌液分别转移到200ml含有氨苄青霉素(50pg/ml)的LB 液体培养基(LB液体培养基为lOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，10 g氯 化钠，溶解至1000ml双蒸水)中，37 'C培养到OD600为1 2。
C. 加入100mM异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1 mM, 3(TC诱导4 5小时。
D. 将诱导以后的菌液分装到250ml的离心管中，4'C,7700 g,5min离心， 弃上清。
E. 沉淀物用磷酸盐缓冲液PBS (140mM氯化钠，2.7 mM氯化钾，10 mM 磷酸氢二钠，1.8 mM磷酸二氢钾)洗涤1次，4°C ， 7700 g, 5 min离心，
弃上清。
F. 将沉淀重悬于8 ml含1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF: 17.42 mg PMSF溶 于lml异丙醇中，-20 'C保存)的PBS中。
G. 将菌液放置冰中，超声碎菌，加入20。/。曲通X-100 (Triton X-100: 1ml TritonX-100溶于4 ml无菌双蒸水中)，使其终浓度1%, 4°C,轻混30分钟。
H. 每EP管中加入lml超声降解的菌液，4 °C, 12000 g, 10 min离心，取上清。
6I. 4 °C, 12000 g，离心10min，再取上清。
J.各EP管加入20 pi琼脂糖凝胶4B (Sepharose 4B:购自Amersham
Biosciences公司，美国)，混匀，室温20 25 °C孵育30 min。 4°C ， 5000 rpm，
5min,离心，弃上清。 K.每个EP管中各加入100 pi 0.01M PBS洗涤，离心洗涤后将含有
Separose 4B的悬浊液收集于一管，4°C, 5000 rpm， 5 min，离心，弃上清，
共洗涤3次。
L.加入与Sepharose 4B等量的谷光苷肽洗脱缓冲液(Glutathione Elution Buffer: 0.0154 g谷光苷肽溶解于0.25 ml pH 8.0的1M过滤除菌，分装， 4'C保存)，室温20 25。C轻轻混匀10 min， 4°C, 5000 rpm， 5 min，取上清。
M.重复步骤L两次。收集的上清则为E2-GST融合蛋白。
二、 制备兔抗E2蛋白抗体的步骤如下
A. 将表达纯化的E2-GST融合蛋白用PBS稀释至1 mg/ ml，加入完全弗氏 佐剂(CFA)，注射至新西兰家兔(购自武汉大学医学院实验动物中心) 脊椎两侧6点皮下及腹股沟淋巴结，每点O. l 0.2ml,每只兔子抗原免 疫剂量为1 mg。
B. 两周后，用同样抗原量再次免疫家兔，以不完全弗氏佐剂(IFA)为佐剂。 免疫位点及数量选择同基础免疫。
C. 共免疫4次，间隔时间为2周，后两次免疫剂量为第一次剂量的1.5倍。 末次免疫后第10天心脏采血，室温静置凝固后，转入4'C冰箱静置过夜， 分离血清，血清即为E2-GST融合蛋白的抗体，置于-80。C冰箱保存备用。
三、 制备随机DNA文库的步骤如下
A.寡核昔酸为3 ，-CCT CTATATAGGTAC CGA TCG (NNM)12 AGG CCG G TAGTA GTA GTA GTA GTA CCZ4GG CCA-5'(90bp)(划线部分分别为 SD序列、启始密码子、HisTag、斜体部分为5aw/fl酶切位点)(N代表 A， C, T或G, M代表A或C)
7B.第一轮PCR的上游引物Ul为5'-G CTC GTA TAA TGT GTG GCC ACA ACG GAT ATA TCC ATG -3' (43 bp)(划线部分为5'端茎环和
斜体部分为核糖体结合位点:RBS)，下游引物Dl为3'-GTA GTA ￡￡I
G-5，(52 bp)(划线部分分别为5awHI酶切位点、Gly-Ser序列和3，端茎环)
C. 第二轮PCR的上游引物U2为5'-GCG CTG CAG TTG ACA ATT AAT CAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG-3' (42 bp),(划线部分分别为Pwl酶切 位点和Tac启动子)。下游引物为D1。随机ssDNA文库和引物由上海博 亚生物有限公司合成。随机DNA文库的构建示意图见图1。
D. 以寡核普酸为模板，用引物U1和D1进行第一轮PCR，反应体系为
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+)5pl
dNTP mix(10mM;) 1 pi
引物Ul (20 (aM) 1 |Lll
引物Dl (20 (iM)1. W
寡核苷酸(0.05ng7pl)"I
双蒸水40 (al
Tag DNA聚合酶1. W
总体积50 |al
反应程序
a. 95°C， 2分钟
b. 95°C， 36秒；63°C， 36秒；72°C， 84秒；共25个循环。
c. 72°C， 5分钟
E. PCR产物经2%的琼脂糖凝胶(0.4 g琼脂糖粉末溶解于20 mil X TAE溶 液)电泳，然后用回收试剂盒(QIAEX II gel Extraction Kit,美国promega
公司)回收。
F. 经步骤E回收所得的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR扩增，反应 体系为
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+) 5 (al
dNTP mix (10 mM) .1(^1引物U1 (20|aM)
引物D1 (20pM) 化l
第一轮PCR产物 4^1
双蒸水 37|al
TagDNA聚合酶 "1
总体积 50pl
反应程序
a. 95 °C, 2分钟
b. 95°C， 36秒；62°C， 36秒；72°C, 84秒；共25个循环。
c. 72°C， 5分钟
G.步骤F所得得PCR产物经2。/。的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回 收，回收所得片段即可用于体外转录翻译
四、制备核糖体文库的步骤如下
A.核糖体文库的制备(见参考文献Wu, et al.,户e;^W^ 2005， 26(11): 2057-2063.),构建及筛选流程如图2所示:将编码1014个随机12肽的DNA 库在体外进行偶联的转录/翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不 能从核糖体上释放，从而形成一个稳定的mRNA-核糖体-新生多肽复合 体结构。利用连接有Sepharose 4B (sigma公司)的E2-GST融合蛋白 (E2-GST-Sepharose4B)亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性 结合的mRNA—核糖体一多肽复合物，通过降低Mg^浓度，核糖体解离， 释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA,逆转录成cDNA. PCR扩 增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经过六轮筛选，能找到与E2
蛋白特异性结合的多肽。 B.反应体系
DNA模板(0.3mg/ml) 10^1
S30 Premix without Amino Acids 20 (il
氨基酸混合液(无甲硫氨酸) 2.5 pi
氨基酸混合液(无亮氨酸) 2.5^1
S30 Extract 15^1
9总体积 50 pi
轻轻混匀EP管中各混合物，5000rpm，离心30秒，让混合物沉积于EP 管底部。
C. 30'C孵育2.5小时。
D. EP管冰上放置5分钟中止反应，EP管中物质即为核糖体展示文库。
五、核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的歩骤如下
A. 在100 pi体外转录翻译混合物中加入6单位的无RNA酶的DNase (Promega公司，美国)，lOXDNase I缓冲液(Promega公司，美国)6 |il， 37。C温育30 min。然后加中止缓冲液，65°C， 10 min灭活DNase。
B. 取60 pl E2-GST陽Sepharose 4B, 4 。C， 5000 rpm， 5 min离心，弃上清。
C. 沉淀用500 pl洗脱缓冲液(washing buffer : 50 mM pH 7.5的Tris-醋 酸，150 mM氯化钠NaCl， 0.1 %Tween-20, 50 mM醋酸镁)洗涤3次。
D. 将100 pi体外转录/翻译混合物加入到洗涤过的E2-GST-Sepharose 4B 中，4'C摇动1小时。
E. 4 。C， 5000 rpm， 5min离心，弃上清，沉淀用washing buffer洗涤3次。
F. 沉淀中加入100 nl elution buffer, 4"C摇动10 min使mRNA与核糖体解 离，4°C， 5000rpm， 5min离心，取上清。
G. 用RNaidKit (购自biol01公司，美国)回收mRNA,具体方法如下
a. 上清中加入3倍体积的RNA Binding Salt (RNaid Kit成份)混匀。
b. 再加入1 RNA MATRIX (RNaid Kit成份)，室温放置5 min。
c. 13000 rpm， lmin离心，弃上清。
d. 用RNA wash (RNaid Kit成份)洗涤2次，(RNA wash:乙醇4:l)。
e. 加入无RNase的H20， 45 55。C温育5 min。
f. 13000 rpm， 2 min离心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。
H. RT-PCR，其反应体系为
AMV/Tfl 5 X Reaction buffer 10 pi
dNTP mix混合物 1 1^1
引物U 1(20 pM) 1 pi
10引物D 1(20 (iM) 1 pi
MgS04(25 mM) 2 pi AMV Reverse Transcription 1 Tfl DNA Polymerase 1 (il
RNA模板 1 |al
无酶水 29 ^
总体积 50 ^
反应程序为48°C， 45分钟；94°C， 2分钟；94°C， 30秒；63°C， l分
钟，72°C， 2分钟；共31个循环；72°C， 7分钟 I. 2%琼脂糖琼脂糖凝胶电泳。 J.回收分子量大小为155 bp的RTPCR产物。
K.以回收产物为模板，再行第二轮PCR扩增，回收分子量大小为181 bp 的PCR产物。
L.将回收的第二轮PCR产物连接至载体pUC19 (购自美国Invitrogen公 司)上，具体步骤为-
a.将PCR产物及载体pUC19酶切，反应体系为
lOXY+Buffer 2 |Ld
5画HI 1 pi
尸WI 1 nl
ddH20 17 pi
总体积 20 ^ 37'C水浴2小时
M.分别回收分子量大小为128 bp的DNA片段以及分子量大小为2.668 kb 的pUC 19目的片断，然后用回收试剂盒(QIAEX II gel Extraction Kit,美 国promega公司)回收。
a.用DNA连接酶将步骤b所的DNA和载体pUC19连接，反应体系为 DNA 4 |il
pUC 19 2 pi
10 X Buffer 2 |alT4连接酶 2 ^
双蒸水 10 pl
总体积 20 |al 16'C孵育20小时
b. 将步骤c所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5 a 。取连接产物 10 ^，加入100plDH5a感受肽细胞，冰浴30分钟，42°C 90秒，再冰 浴5分钟，加入800pl LB液体培养基(LB液体培养基为10 g胰蛋白 胨，5g酵母提取物，10 g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)，37°C， 225 rpm振摇40 50分钟。取200W菌液均匀涂在有氨苄青霉素(Ampf)抗 性的LB固体培养基(LB固体培养基为10g胰蛋白胨，5g酵母提取 物，10 g氯化钠，15g琼脂粉溶解至1000 ml双蒸水)上(氨苄青霉素 浓度为50吗/ml)， 37'C培养过夜。
c. 挑取单个克隆菌落，置于3 ml LB液体培养基(含氨苄青霉50 pg/ml) 培养过夜。
d. 提取步骤e获得的菌液的质粒DNA。
e. PCR鉴定步骤f所得的DNA，反应体系为
10 X Taq DNA polymerase buffer 5 |il
dNTP mix混合物(10 mM) 1
引物U2(20mM) 1 pi
引物D 1(20 mM) 1 (il
质粒DNA 1 |_U
双蒸水 40 nl
Taq DNA Polymerase 1 |al
总体积 50 ^
反应程序为95°C， 2分钟；95°C， 30秒；62°C， 1分钟，72°C, l分 钟24秒；共25个循环；72°C， 5分钟
f.将步骤g所得产物经5amM和尸Wl鉴定，正确的克隆送至上海华诺 公司测序。
根据测序结果，请西安美联公司合成的，得到了4条一种分离的多肽，其氨
12基酸序列分别为:
PE2A (SEQIDNO:l)
GFGRYRRHGSPW
PE2B (SEQIDNO:2)
MAIGPYPACGSG
PE2C (SEQIDNO:3)
LSVLVISMFNAV
PE2D (SEQIDNO:4)
MARHRNWPLVMV
六、利用丙型肝炎病毒包膜抗原试剂盒检测丙肝病人血清里的丙肝病毒的歩骤
如下
A. 96孔板里每孔加入100 pl用碳酸氢钠缓冲液(0.05M pH9.6)稀释的抗 E2-GST抗体(稀释度为1:300 1:500)，或加入100 pl用碳酸氢钠缓冲液
(0.05MpH9.6)稀释的多肽(30 50ug/孔)，37'C孵育1小时。
B. 洗涤液(0.P/。Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液)洗涤五次
C. 封被每孔加入10(^1封闭液(1。/。BSA的PBS磷酸盐缓冲液)，4°C孵 育过夜。
D. 洗涤液(0.1。/。Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液)洗涤五次
E. 每孔加入100 pl丙肝病人血清或健康人血清，室温(26°C)孵育1小时。
F. 重复B步骤一次。
G. 每孔加入100 pl 10 mg/L的生物素标记的多肽(bio-ZD, bio-ZA等，北
京华大基因公司合成)室温(26°C)孵育1小时。
H. 重复B步骤一次。
I. 每孔加入IOO辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(稀释度为1: 1000)， 室温(26°C)孵育30分钟。
加入邻苯二氨显色，酶标仪OD450nm下读取OD值。结果显示分离得到的多 肽能特异性结合丙肝病毒E2糖蛋白，并能与丙肝病人血清里的病毒直接结合， 其OD值大于与正常人血清结合的OD值的2 3倍以上。可达到直接检测病人血样 里病毒含量的效果。
七、利用丙型肝炎病毒包膜抗原试剂盒检测丙肝病毒颗粒的步骤如下
A. 96孔板里每孔加入l&Ll丙肝病毒颗粒(3xl()S个病毒)和162|^1碳酸氢 钠缓冲液(0.05MpH9.6)，混合，4'C孵育7小时。B. 洗涤液(0.1。/。Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液)洗涤五次。
C. 每孔加入lOOpl封闭液(1。/。BSA的PBS磷酸盐缓冲液)，4°C孵育过夜。
D. 洗涤液洗涤五次次后，分别加入^g ^g的生物素标记的多肽到96孔 板中，每孔体积为lOOpl， 37°C孵育lh。
E. 洗涤五次后，加入IO(VI稀释度为1:1000的辣根过养化物酶标记的链霉 亲和素(HRP-advin，购自晶美公司)。
F. 加入邻苯二氨显色，酶标仪OD450nm下读取OD值。显示生物素标记 的多肽能与丙肝病毒颗粒直接结合。
该实验证明分离得到的多肽能特异性结合丙肝病毒颗粒(HCVcc)的E2糖 蛋白，结合能力呈剂量依赖性。
本发明的优点
本实验首次应用核糖体文库筛选了与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽。筛选 到的三种多肽(ZD,ZA,ZB)与丙肝病毒表面包膜E2糖蛋白蛋白具有高亲和力，本 实验首次用抗E2的多克隆抗体和生物素标记的多肽，ELISA法检测丙肝病人血清 中的丙肝病毒表面抗原，本发明所提供的针对丙肝病毒E2糖蛋白的小分子多肽 (12肽)分子量小，易于合成，抗E2的的多克隆抗体制备简单，灵敏度高于传统检 测HCV抗体方法，接近传统HCVRNA检测方法，成本较传统检测HCVRNA检测 方法低，不需要PCR仪。
图l.随机DNA文库的构建流程图。
RBS表示核糖体结合位点，N代表A, C, T或G, M代表A或C 图2.核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的构建流程图。 图3. SPR检测多肽PE2A、多肽PE2B、多肽PE2C、多肽PE2D与E2蛋白的亲
和力，它们结合的亲合力大小是多肽PE2D〉多肽PE2B〉多肽PE2A〉多肽
PE2C。
图4A多肽抑制HCVE2蛋白与人肝细胞Huh7.5细胞结合 图4B多肽抑制HCVE2蛋白与DC-SIGN+靶细胞结合(A)流式细胞仪检测多 肽A、多肽B、多肽D分别抑制HCVE2蛋白结合人肝癌细胞Huh7.5的能力(图4A);多肽分别抑串ijHCVE2蛋白结合人肝癌细胞Huh7.5的能力的剂量依赖性(图4A)。(B) 流式细胞仪检测多肽A、多肽B、多肽0分别抑制￡2蛋白结合00810!^+-皿113丁3 细胞的能力(图4B);多肽分别抑制E2蛋白结合人肝癌细胞DC-SIGN+-NIH3T3的 能力的剂量依赖性(图4B)。
图5.多肽PE2D能竞争性抑制E2与HCV的受体CD81,肝素的结合。 图6.多肽PE2D能特异性抑制丙肝假病毒(HCVpp)感染靶细胞，且多肽PE2D 抑制能力呈剂量的依赖性。图4A是假病毒的构建步骤，图4B是假病毒在293细胞 里表达E1、 E2蛋白，图4C是PE2D (SEQIDNO:4)阻止假病毒感染Huh7.5细胞， 并呈剂量依赖性。
图7.不同浓度PE2D与HCV病毒颗粒(HCVcc)结合的能力呈剂量依赖性。 图8. ELISA检测不同浓度的PE2D能抑制HCVcc与Huh7.5结合的能力不同， 剂量越大，抑制能力越强。
图9. HCV表面包膜ELISA试剂盒检测方法包被E2抗体，加样品，再加生物 素表记的多肽，以及辣根过养化物酶标记的链霉亲和素检测HCV抗体阳性或 HCVRNA检测阳性的丙肝病人血清中的病毒。正常人血清作为对照。
具体实施例方式
实施例1
丙型肝炎病毒包膜抗原试剂盒的配置
a. 生物素等标记的能与HCVE2蛋白特异性结合的12肽；
b. 多肽为SEQIDNO:l、 SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4所示的序列；
c. 兔抗E2的的多克隆抗体；
d. 辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；
e. 辣根过氧化物酶底物；
f. 酶标板(CellStar@,购自武汉大风生物科技有限公司)，酶标仪；
g. E2蛋白作为标准阳性孔；
h、酶联免疫检测仪(购自南京华东电子集团医疗装备有限公司)。
一种多肽PF2A、 PE2B、 PE2C、 PE2D的步骤如下一、制备E2-GST融合蛋白的步骤如下
A. 挑取含有pGEX-KG-E2(见参考文献Li, et al.， Engineering of N-glycosylation of Hepatitis C Virus Envelope Protein E2 Enhances T cell responses for DNA immunization, Vaccine. 2007. 25:1544-155l.)的大肠杆 菌BL21DE3(购自美国irwitrogen公司)培养于3 ml含有氨苄青霉素(50
g/ ml)的LB培养基中，对照组别接种含有pGEX-KG (GST蛋白的原 核表达载体，购自Amersham Biosciences公司)，37。C培养12~16小时。
B. 将小试管中的菌液分别转移到200 ml含有氨苄青霉素(50g/ ml)的 LB液体培养基(LB液体培养基为lOg胰蛋白胨，5g酵母提取物， 10 g氯化钠，溶解至1000 ml双蒸水)中，37 。C培养到OD600为1 2。
C. 加入100 mM异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG),使其终浓度为0.1 mM， 3(TC诱导4 5小时。
D. 将诱导以后的菌液分装到250ml的离心管中，4'C,7700 g，5min离心， 弃上清。
E. 沉淀用磷酸盐缓冲液PBS(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷 酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾)洗涤1次，4'C， 7700g,5min离心，弃上清。
F. 将沉淀重悬于8 ml含1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF: 17.42 mg PMSF溶 于lml异丙醇中，-20 X:保存)的PBS中。
G. 将菌液放置冰中，超声碎菌后加入20。/。曲通X-100 (20%TritonX-100:
1 ml TritonX-100溶于4 ml无菌双蒸水中)，使其终浓度1%, 4°C,轻混 30分钟。
H. 每EP管中加入1 ml超声降解的菌液，4 °C， 12000 g, 10 min离心，取上清。
I. 上清再次离心，4 °C, 12000 g, 10 min，再取上清。
J.各EP管加入20 pi琼脂糖凝胶4B (Sepharose 4B:购自Amersham Biosciences公司)，室温(20-25°C，以下相同)轻混30min。 4°C， 5000 rpm， 5min，离心，弃上清。
K.每个EP管各加入1000.01M PBS洗涤，离心洗涤后将含有Separose 4B的悬浊液收集于一管，4'C， 5000 rpm, 5 min，离心，弃上清，共洗涤3次。
L.加入与Sepharose 4B等量的Glutathione Elution Buffer (0.0154 g谷光 苷肽溶解于0.25 mlpH8.0的1MPBS过滤除菌，分装，4。C保存)，室 温轻混10min， 4。C,5000rpm, 5min，取上清。
M.重复步骤L两次。收集的上清则为所需E2-GST融合蛋白。
二、 制备兔抗E2蛋白抗体的步骤如下
A. 将表达纯化的E2-GST融合蛋白用PBS稀释至1 m/ml，加入完全弗氏佐 剂(CFA)，注射至新西兰家兔脊椎两侧6点皮下及腹股沟淋巴结，每 点0. l 0.2ml,每只兔子抗原免疫剂量为1 mg。
B. 两周后，用同样抗原量再次免疫家兔，以不完全弗氏佐剂(IFA)为佐剂。 免疫位点及数量选择同基础免疫。
C. 共免疫4次，间隔时间为2周，后两次免疫剂量为第一次剂量的1.5倍。 末次免疫后第10天心脏采血，室温静置凝固后，转入4t:冰箱静置过夜， 分离血清，血清即E2-GST融合蛋白抗体，置于-80。C冰箱保存备用。
三、 制备随机DNA文库的步骤如下(见图1):
A. 寡核昔酸为3'-CCT CTATATAGGTAC CGA TCG (NNM)12 AGG CCG G TAGTA GTA GTA GTA GTA CCT4( G CCA-5'(卯bp)(划线部分分别为 SD序列、启始密码子、HisTag、斜体部分为S"m/ZI酶切位点)(N代表 A, C， T或G, M代表A或C)
B. 第一轮PCR的上游引物Ul为5'-G CTC GTA TAA TGT GTG GCC ACA ACG G" GGL4 GAT ATA TCC ATG -3' (43 bp)(划线部分为5'端茎环和 斜体部分为核糖体结合位点:RBS)，下游引物Dl为3'-GTA GTA ￡￡J
Q-5，(52 bp)(划线部分分别为ftraHI酶切位点、Gly-Ser序列和3，端茎环) C.第二轮PCR的上游引物U2为5'-GCG CTG CAG TTG ACA ATT AAT CAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG-3' (42 bp),(划线部分分别为PWl酶切位点和Tac启动子)。下游引物为Dl。随机DNA文库的构建示意图见图
D. 以寡核普酸为模板，用引物U1和D1进行第一轮PCR，反应体系为
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+) 5 pi
dNTPmix(10mM) "1 引物Ul (20 pM) "1 引物Dl (20 (aM) Jfil 寡核苷酸(0.05吗/pl) 化l 双蒸水
TagDNA聚合酶 Jpl 总体积 50pl 反应程序
a. 95°C， 2分钟
b. 95°C， 36秒；63°C， 36秒；72°C， 84秒；共25个循环。
c. 72°C， 5分钟
E. PCR产物经2。/。的琼脂糖凝胶(0.4g琼脂糖粉末溶解于20mllXTAE溶 液)电泳，然后用回收试剂盒(QIAEX II gel Extraction Kit,美国promega
公司)回收。
F. 经步骤E回收所得的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR扩增，反应 体系为
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+) 5 (al
dNTPmix(10mM) 引物Ul (20 nM) 引物Dl (20|aM)
第一轮PCR产物 4^1 双蒸水 37pl TagDNA聚合酶 ^1 总体积 50|al 反应程序a. 95°C， 2分钟
b. 95°C， 36秒；62°C， 36秒；72°C， 84秒；共25个循环。
c. 72°C, 5分钟
G.步骤F所得得PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回 收，回收所得片段即可用于体外转录翻译DNA模板。
四、制备核糖体展示文库的步骤如下
A.核糖体文库制备及筛选流程(见参考文献Wu, et al., Pep^fes 2005， 26(11): 2057-2063.)，构建及筛选流程如图2所示:将编码1014个随机12肽的DNA 库在体外进行偶联的转录/翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不 能从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以共价键结合，形成一个稳 定的复合体结构。利用连接有Sepharose 4B的E2-GST蛋白(E2-GST— Sepharose 4B)亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的 mRNA—核糖体一多肽复合物，通过降低Mg^浓度，核糖体解离，释放 mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA. PCR扩增， 其产物可作为下一轮体外合成的模板，经连接有Sepharose 4B的GST蛋 白(GST—Sepharose 4B)反筛以去除非特异性结合的多肽，E2-GST— Sepharose4B正筛，经过六轮筛选，筛选到与E2蛋白特异性结合的多肽。
B.反应体系
DNA模板(0.3mg/ml) 10 pl
S30 Premix without Amino Acids 20 jxl
氨基酸混合液(无甲硫氨酸) 2.5 )il
氨基酸混合液(无亮氨酸) 2.5 pi
S30 Extract,linear 15 pi
总体积 50 pi
轻轻混匀步骤B中各混合物，5000rpm，离心30秒，让混合物沉积于 EP管底部。
C. 30'C孵育2.5小时。
D. EP管冰上放置5分钟中止反应。即得到核糖体展示文库。四、核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的步骤如下(见图2)A．在100“1体外转录翻译混合物中加入6单位的无RNA酶的DNase(Promega公司，美国)，10 X DNase I缓冲液(Promega公司，美国)6 gl，37℃温育30 min。然后加§¨l中止缓冲液，65~C，10 rain灭活DNase。B．取60“1 E2一GST-Sepharose 4B，4℃，5000 rpm，5 min离心，弃上清。C．沉淀用500 gl washing buffer(50 mM pH 7．5的Tris一醋酸，1 50 mM NaCl，0．1％Tween．20．50 mM醋酸镁)洗涤3次。D．将100 ul体外转录／翻译混合物加入到洗涤过的E2-GST-Sepharose 4B中，4℃摇动I小时。E 4℃，5000 rpm，5 min离心，弃上清，沉淀用洗脱缓冲液洗涤3次。F．沉淀中加入100¨l elution buffer，4℃摇动10 rain使mRNA与核糖体解离，4"C，5000 rpm，5 rain离心，取上清。G．用RNaid K“(购自biol01公司，美国)回收mRNA，具体方法如下g．上清中加入3倍体积的RNABinding Salt(RNaid Kit成份)混匀。h．再加入lOgl RNA MATRIX(RNaid Kit成份)，室温放置5 min。i．13000 rpm，1 rain离心，弃上清。i．用RNAwash(RNaid Kit成份)洗涤2次，(RNAwash~gg。11)。k．加入1．Ogl无RNase的H20， 55口C温育5 min。1． 13000 rpm，2 min离心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。H．RT-PCR，其反应体系为AMV／Tfl 5×Reaction buffer10“ldNTP mix混合物1“1引物U 1(20 raM)l pl引物D l(20 mM)1肛1硫酸镁(25 mM)2 plAMV Reverse Transcription1 LLlYfl DNA聚合酶1“lRNA模板1 pl无酶水 29 总体积 50 ^
反应程序为48°C， 45分钟；94°C， 2分钟；94°C， 30秒63°C， 1分 钟，72°C， 2分钟；共31个循环；72°C, 7分钟 I. 2%琼脂糖琼脂糖凝胶电泳。 J.回收分子量大小为155 bp的RTPCR产物。
K.以回收产物为模板，再行第二轮PCR扩增，回收分子量大小为181 bp 的PCR产物。
L.将回收的第二轮PCR产物连接至载体pUC19 (购自美国invitrogen公 司)上，具体步骤为
a.将PCR产物及载体pUC19酶切，反应体系为
lOXY+Buffer 2^1
M 1 pi
ddH20 17pl
总体积 20 pi 37'C水浴2小时
b. 分别回收分子量大小为128 bp的DNA片段以及分子量大小为2.668 kb的pUC 19目的片断(回收方法同上)。
c. 用DNA连接酶将步骤b所的DNA和载体pUC19连接，反应体系为
DNA 4 pil
pUC19 2^1
10 X Buffer 2 (il
T4连接酶 2 pi
双蒸水 10 pi
总体积 20 pi 16'C孵育20小时
d.将步骤c所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5 a 。取连接产物 10 pl，加入100nlDH5a感受肽细胞，冰浴30分钟，42°C 90秒，再冰浴5分钟，加入800pl LB液体培养基(LB液体培养基为10 g 胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)， 37°c， 225 rpm振摇40 50分钟。取200pl菌液均匀涂在有氨苄青 霉素(Ampf)抗性的LB固体培养基(LB固体培养基为10g胰蛋 白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g琼脂粉溶解至1000ml双 蒸水)上(氨苄青霉素浓度为50吗/ml)， 37。C培养过夜。
e. 挑取单个克隆菌落，置于3 ml LB液体培养基(含氨节青霉50 pg/ml) 培养过夜。
f. 提取步骤e获得的菌液的质粒DNA。
g. PCR鉴定步骤f所得的DNA，反应体系为
10 X Taq DNA polymerase buffer 5 (j1
dNTP mix混合物(l 0 mM) 1
引物u2(20 nM) 1 pi
引物D 1(20 ^M) 1 pi
质粒DNA 1 |ul
双蒸水 40 ^
Taq DNA Polymerase 1 jil
总体积 50 pi
反应程序为95°c， 2分钟；95°c， 30秒；62°c， 1分钟，72°c， l分 钟24秒；共25个循环；72°c， 5分钟
h.将步骤g所得产物经^wzM和PWl鉴定，正确的克隆送至上海华诺 公司测序。
M.根据测序结果，请西安美联公司合成12肽，见表1。 表l筛选出的与e2蛋白结合的多肽序列
分离的肽氨基酸序列
PE2AGFGRYRRHGSPWSEQIDNO:l
PE2BMAIGPYPACGSGSEQIDNO:2
PE2CLSVLVISMFNAVSEQIDNO:3
PE2DMARHR丽PLVMVSEQ謂0:4实施例2
表面等离子共振技术(SPR)检测多肽与E2蛋白的亲和力的步骤如下
A. 让测试仪器Biocore(美国)通过一段HBS缓冲液直至基线稳定。
B. 注射40 pl氨基偶联试剂(含0.02 M的l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺(EDC)禾n 0.05 M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))，活化CM5传
感片上的羧基。
C. 用pH值为5.0的醋酸缓冲液将E2蛋白稀释至5 mg/ml，注射该溶液40
D. 上机检测，流速为20nl/min。
E. 将多肽PE2A、 PE2B、 PE2C、 PE2D稀释为不同浓度，以2 nl/min上机 与CM5传感片上的E2蛋白作用7分钟。
F. 以2 pl/min的流速注射10 pl的HC1再生液使基线恢复，实时采集响应 信号。
G. 用BIACORE的专用软件进行数据分析，我们发现分析PE2D与E2蛋白 的亲和力最高，结果见图3，其亲和力有关参数见表2。
表2多肽与E2蛋白相互结合作用的动力学数据
多肽 ka/M"s.1 (x104) kd/s.1 (xl(T3) kA/M"(x107)
PE2A3.22 1.39 2.32
PE2B2.56 1.22 2.10
PE2C I no ; no no
PE2D7.51 1.45 5.18
实施例3
流式细胞仪检测多肽与靶分子细胞结合的步骤如下
A.培养人肝癌细胞Huh7.5(见参考文献Zhong, et al.， Robust hepatitis C virus infection in vitro， 2005， PNAS, 102: 9294-9299)和DC-SIGN+陽NIH3T3 (表 面有DC-Sign分子的小鼠的成纤维细胞)细胞(见参考文献Wu, et al.， Functional evaluation of DC-SIGN monoclonal antibodies reveals DC-SIGNinteractions with ICAM-3 do not promote human immunodeficiency virus type I transmission. J. virol. 2002, 76: 5905-5914)。培养条件均为10%胎牛 血清的DMEM培养基(Gibco公司购买)，培养于37°C，含5%二氧化 碳的培养箱中。
B. 将多肽PE2A、 PE2B、 PE2D分别与E2-GST蛋白混合(对照管加入GST蛋 白)，总体积为50pl，其中多肽的浓度均为500 pM, E2-GST蛋白和GST 蛋白的浓度均为20吗/ml， 37。C孵育30分钟。
C. 将步骤B所得的多肽与蛋白的混合物分别与收获的Huh7.5和DC-SIGN+ -NIH3T3细胞混合，总体积为100Ml，其中细胞个数为2X 106个。37°C 孵育30分钟。
D. 每管加入1 mlPBS洗涤，1000 rpm， 5 min，弃上清，用80 pl重悬细胞。
E. 加入201: 500的E2-GST抗体，37'C孵育30分钟。
F. 重复步骤D。
G. 加入1 |al PE标记的羊抗兔的二抗，37'C孵育30分钟。
H. 每管加入1 mlPBS洗涤，1000 rpm, 5 min，弃上清，用500 |al重悬细胞。
I. 经上机检测，申请人发现PE2A,安PE2B， PE2D分别与E2-GST蛋白作用 后，能显著抑制￡2蛋白结合到他117.5细胞(图4)及0(:-810^^1113丁3细胞
(图5)，且成剂量依赖关系，多肽剂量愈大，其与E2的亲合力愈强，抑 制HCVE2侵袭靶细胞能力愈强(图4A和图4B)。
实施例4
多肽D能部分竞争性抑制E2与HCV的受体CD81,和肝素的结合(图5)。 实施例5
PE2D能抑制HCVppv假病毒(图6A,6B)侵袭人靶细胞(图6C). HCVppv 假病毒的构建见6A,6B， PE2D抑制HCVppv假病毒侵袭人靶细胞的能 力呈剂量依赖性，多肽D浓度愈大,其抑制能力愈强(图6C)。
实施例6检测多肽PE2D与丙肝病毒颗粒(HCVCC)结合的步骤如下
A. 96孔板里每孔加入WW丙肝病毒颗粒(3"05个病毒)和162 Ml碳酸氢 钠缓冲液(0.05MpH9.6)，混合，4°C孵育7小时。
B. 洗涤液(0.1。/。Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液)洗涤五次。
C. 每孔加入100(xl封闭液(1%BSA的PBS磷酸盐缓冲液)，4°C孵育过夜。
D. 洗涤液洗涤五次次后，分别加入Ofig， >g，化g， 的bio-PE2D到 96孔板中，每孔体积为IOOW， 37°C孵育lh。
E. 洗涤五次后，加入lOppl稀释度为1:1000的辣根过养化物酶标记的链霉 亲和素(HRP-advin，购自晶美公司)。
F. 加入邻苯二氨显色，酶标仪OD492 nm下读取OD值。显示ZD能与丙 肝病毒颗粒直接结合。
该实验证明分离得到的多肽能特异性结合丙肝病毒颗粒(HCVcc)，结合能力呈 剂量依赖性(图7)。
实施例7
检测多肽PE2D抑制丙肝病毒颗粒(HCVcc)感染人肝细胞Huh7.5细胞的 步骤如下
A. 培养人肝癌细胞Huh7.5于24孔板中，置于37'C，含5%二氧化碳的培 养箱中，培养条件为10%胎牛血清的DMEM培养基，。
B. 每孔加入PE2D和3><105个丙肝病毒颗粒，PE2D的浓度分为200(aM， 卿nM。
C. 37'C孵育5小时，洗涤细胞后，加入培养基培养3天。
D. 加入荧光标记的HCV-E2抗体(购自上海巴斯德研究所)与细胞孵育30 分钟
E. 荧光显微镜下计数每孔红色荧光点数(ffu/we11， 58nm)。 该实验证明分离得到的多肽PE2D能特异性抑制丙肝病毒颗粒(HCVcc
感染人肝细胞，且剂量越大，抑制能力越强，呈剂量依赖性(图8)。
实施例8利用丙型肝炎病毒包膜抗原试剂盒检测150例丙型肝炎病人血清里的丙肝 病毒(该病毒是从湖北.武汉有关医院收集到丙型肝炎病毒人血清里的丙肝病毒)， 150例正常人血清作为对照(体检收集到正常人血清为参考物)，步骤如下
A. 96孔酶标板里每孔加入100nl用碳酸氢钠缓冲液(0.05MpH9.6)稀释 的抗E2抗体(稀释度为l: 400)， 37°C孵育l-2小时(或fC过夜)。
B. 洗涤液(0.1。/。Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液)洗涤五次。
C. 封被每孔加入100nl封闭液(P/。BSA的PBS磷酸盐缓冲液)，4°C孵 育过夜。
D. 重复B步骤一次。
E. 每孔加入100 ^tl丙肝病人血清或健康人血清，26。C-37。C孵育1~2小时。
F. 重复B步骤一次。
G. 每孔加入IO(VI 10mg/L的生物素标记的多肽(北京华大基因公司合成) 26'C-37'C孵育1~2小时。
H. 重复B步骤一次。
I. 每孔加入100 pl 1辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(稀释度为1: 1000)， 26。C-37。C孵育30分钟。
J.加入邻苯二氨显色，酶标仪OD492nm下读取OD值(见图9)。结果显 示生物素标记的多肽能特异性与丙肝病人血清里的病毒直接结合，其 OD值大于与正常人血清结合的OD值的2 3倍以上。可达到直接检测 病人血样里病毒含量的效果。
SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>丙型肝炎病毒包膜抗原ELISA试剂盒及检测方法 <130>丙型肝炎病毒包膜抗原ELISA试剂盒及检测方法 <160> 4
<170> Patentln version 3.1
<210> 1 <211> 12<212> PRT <213>人工合成
<400> 1
Gly Phe Gly Arg Tyr Arg Arg His Gly Ser Pro Trp 1 5 10
<210〉 2
<211> 12
<212> PRT <213>人工合成
<400> 2
Met Ala lie Gly Pro Tyr Pro Ala Cys Gly Ser Gly 1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT <213>人工合成
<400〉 3
Leu Ser Val Leu Val He Ser Met Phe Asn Ala Val 1 5 10
<210> 4
<211〉 12
<212> PRT <213>人工合成
<400〉 4
Met Ala Arg His Arg Asn Trp Pro Leu Val Met Val 1 5 10
权利要求
1、一种丙型肝炎病毒包膜抗原ELISA试剂盒，其特征是该试剂盒包括a. 生物素等标记的能与HCV E2蛋白特异性结合的12肽；b. 多肽为SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4所示的序列；c. 兔抗E2的的多克隆抗体；d. 辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；e. 辣根过氧化物酶底物；f. 酶标板，酶标仪；g. E2蛋白作为标准阳性孔。
2、 利用权利要求l所述的一种试剂盒在制备检测丙型肝炎病毒包膜抗原ELISA试剂盒的方法，该检测方法包括下列步骤A、 在96孔酶标板里每孔加入100 pi用碳酸氢钠缓冲液稀释的兔抗E2抗体，稀释度为l: 400， 37°C孵育l-2小时或4。C过夜，PBS洗涤3遍，甩干，碳酸氢钠缓冲液为0.05M， pH9.6;B、 洗涤液洗涤五次，洗涤液为0.1。/。Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液；C、 封被每孔加入100 ^封闭液，4°C孵育过夜，封闭液为1%BSA的PBS磷酸盐缓冲液；D、 重复B步骤一次；E、 每孔加入100 丙肝病人血清或健康人血清，26'C-37。C孵育1 2小时；F、 重复B步骤一次；G、 每孔加入100 10 mg/L的生物素标记的多肽室温26'C-37'C孵育1~2小时；H、 重复B步骤一次；I、 每孔加入100pl辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，稀释度为1: 1000，26'C-37"C孵育30分钟，加入辣根过氧化物酶底物邻苯二氨显色，酶标仪OD492nm下读取OD值。
全文摘要
本发明公开了一种丙型肝炎病毒包膜抗原ELISA试剂盒及检测方法，包括酶标板，生物素标记的能与HCV E2蛋白特异性结合的三种多肽(12肽ZA，12肽ZB，12肽ZD)，兔抗E2的多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。一种检测丙型肝炎病毒包膜抗原试剂盒的方法，首先包被兔抗E2的多克隆抗体，再加入待测病人血清，第三是加入生物素标记的多肽，第四是加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，第五是加入邻苯二氨显色，酶标仪OD450nm下读取OD值。这些多肽及其标记物作为检测丙型肝炎病毒包膜抗原的试剂盒中的应用，这些多肽同时还可作为制备或治疗预防丙型肝炎病毒感染的药物，可广泛应用于医学等相关领域。
文档编号G01N33/576GK101458256SQ20071016889
公开日2009年6月17日 申请日期2007年12月14日 优先权日2007年12月14日
发明者晶 俞, 李冬青, 章晓联 申请人:武汉大学