专利名称：：一种测定细菌纳米磁小体载药量的方法
技术领域：
：本发明涉及一种细菌纳米磁小体载药量的测定方法，特别是涉及一种采用紫外光谱或荧光光谱间接测定细菌纳米磁小体载药量的方法。
背景技术：
：趋磁性细菌(magnetotacticbacterium)是1975年美国生物学家布拉克莫尔(Blakemore)偶然发现的自然界存在的一类奇特的微生物，它能够沿着磁力线运动，其细胞内含有对磁场具有敏感性的细菌纳米磁小体(magrietosomes)，它在细胞内起了导向的作用，并可借助于自身的鞭毛来运动。细菌纳米磁小体大小约为35-120nm，在永久的单磁畴晶尺寸范围之内，主要成分为FeA或Fe^，外面有由嵌合蛋白质的憐脂双分子脂膜包被，分离纯化后在溶液中分散性好，稳定性高。日本学者Matsunaga早在1991年就预计趋磁细菌磁小体在未来的10年中将是高新技术应用中的一种新的生物资源。在固定化酶载体，免疫检测、基因转移，DNA、RNA的分离和标记等方面的研究结果表明，细菌纳米磁小体的性能优于人工合成磁性纳米颗粒，前者固定化酶量大(可达人工合成磁性纳米颗粒的100倍)，抗体连接量大，免疫检测灵敏度高，DNA吸附量大，应用前景非常广阔。(与人工合成磁性纳米颗粒相比，细菌纳米磁小体由于来自活体细菌，具有优越的生物相溶性，毒副作用小；其尺寸均在纳米级，颗粒均匀，晶型稳定，具有较大的比表面积；电负性较大且可调节，不易聚集；同时由于有脂膜包被，活性基团丰富，表面可进行各种化学修饰，可能成为一种更理想的纳米药物载体，在耙向定位治疗肿瘤方面展现出诱人的应用前景。已有的初步研究结果表明，细菌纳米磁小体粒度均匀，它负载药物阿霉素前后粒径变化小，比传统人工合成的载药磁颗粒小1-20倍。采用生物纳米磁小体作为药物载体，载药量可比传统人工合成磁颗粒的高出10倍以上。但是由于采用细菌纳米磁小体进行载药方面研究工作才刚刚起步，测定细菌纳米磁小体载药量的方法也无现成经验可循。有文献报道，对于测定人工合成纳米磁颗粒的载药量，通常采用强酸及强极性溶剂将其溶解，提取后再测定。但是对于细菌纳米磁小体体系，这些强酸及强极性溶剂在溶解破坏细菌纳米磁小体膜及磁核的同时，也极易使所载药物的性质发生变化并分解，从而影响其载药量的准确测定。因此，如何在不破坏药物本身性质及活性的条件下，准确测定细菌纳米磁小体对药物的载药量，是目前细菌纳米磁小体载药研究工作中急待解决的技术难题。
发明内容本发明的目的在于提供一种细菌纳米磁小体载药量的测定方法。具体的说，是提供一种采用紫外光谱或荧光光谱间接测定细菌纳米磁小体载药量的方法。本发明所说的细菌纳米磁小体是趋磁细菌细胞内形成的纳米磁性颗粒，粒径35-120nm，主要成分为Fe304或FesS4，单个磁颗粒有脂膜包被。此法涉及的药物是能与细菌纳米磁小体偶连的药物。本发明所述细菌纳米磁小体载药量的测定方法，包括下述步骤(1)将水或缓冲溶液加入待测药物中，配制出一系列不同浓度的药物标准溶液；(2)以纯水或相应缓冲溶液为参比，测定上述药物标准溶液紫外扫描光谱或荧光发射光谱(波长范围190—900nm)，确定最大紫外吸收波长或最大发射波长测定上述一系列已知准确浓度的药物溶液在该Amax处的紫外吸光度值或荧光发射强度值，制出其标准工作曲线；(3)将已知准确浓度的药物溶液与细菌纳米磁小体混合，使它们定量定体积反应，反应结束后，用磁铁在反应容器外将反应容器内的磁小体吸至容器底部，收取上清液，待测；再配制一份与上述混合溶液浓度相同的未与细菌纳米磁小体反应的药物溶液作为反应空白对比溶液，待用；(4)分别测定步骤3中待测反应上清液和反应空白对比溶液在A皿处的紫外吸光度值或荧光发射强度值；(5)根据待测反应上清液和反应空白对比溶液在Xmax处的紫外吸光度值或荧光发射强度值的差值，通过所载药物的相应标准工作曲线，计算出细菌纳米磁小体的载药量。采用上述本发明的细菌纳米磁小体载药量的测定方法，将传统的紫外光谱或荧光光谱与细菌纳米磁小体载药反应的实际情况相结合，通过反应前后反应液中药物浓度的变化间接测定细菌纳米磁小体载药量，能够在不破坏药物本身性质及活性的条件下，测定细菌纳米磁小体对药物的载药量。该方法操作简单，结果可靠，并可以保证药物活性及反应的持续性，为细菌纳米磁小体载药量的测定提供了新颖、可靠的检测技术手段。图1是阿霉素标准溶液紫外光谱图。图2是阿霉素水溶液的标准工作曲线(Uax-480nm)。图3是抗CEA标准溶液荧光发射光谱图。图4是抗CEA磷酸缓冲溶液的标准工作曲线。具体实施例方式下面各实施例中采用的试剂和仪器说明如下细菌纳米磁小体(BMP):由MSR-1趋磁细菌菌株培养而得，粒径为40-50nm，由中国农业大学生物学院微生物系提供。单克隆抗CEA:购自SIGMA公司。抗癌化疗药物阿霉素(ADM):购于北京云迪同创医药科技有限公司。水二次去离子水。所用溶剂和化学试剂均为分析纯。仪器日本岛津UV-3100型紫外-可见光谱仪，石英池厚lcm;KQ-IOO型超声波振荡器；PerkinElmerLS50B型荧光光谱仪，石英池厚lcm。实施例1:采用紫外光谱法测定细菌纳米磁小体(BMP)所载抗癌药物阿霉素,(ADM)的载药量。(1)配制阿霉素的标准溶液准确称取0.02g阿霉素，溶于纯水，在25ml容量瓶中配制其标准溶液。移取不同体积的上述阿霉素标准溶液于25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，准确配制出一系列已知浓度的阿霉素标准溶液。(2)建立所载药物的标准工作曲线用纯水做参比，测定上述阿霉素标准溶液紫外扫描光谱，获得其紫外光谱如图l所示。根据图l可以确定阿霉素在纯水溶液中最大吸收波长入皿为480nm。测定上述一系列已知准确浓度的阿霉素溶液在480nm处的吸光度值，制出其标准工作曲线如图2所示。确定其线性回归方程为A-23.73K。A为吸光度值，C为阿霉素标准液浓度，即溶液吸光度值与溶液中阿霉素的含量成正比。(3)将药物与细菌纳米磁小体定量反应将戊二醛修饰过的细菌纳米磁小体与己知准确浓度的阿霉素溶液混合，使混合液中细菌纳米磁小体反应浓度为0.02mg/ml，阿霉素的浓度为0.2mg/ml，开启超声波振荡器，二者反应，反应结束后，用磁铁将磁小体吸至反应容器底部，收取上清液，待测。(4)配制阿霉素的反应空白对比溶液配制一份与步骤(3)的混合溶液同体积量的浓度为0.2mg/ml的阿霉素药物溶液，作为未与细菌纳米磁小体反应的阿霉素的空白对比溶液。(5)紫外光谱测定分别测定上述步骤(3)所得的反应后上清液和步骤(4)的反应空白对比溶液在480nm处的紫外吸光度值。测得二者在480nm处的紫外吸光度值的差值为0.254。(6)载药量的计算根据待测反应上清液(3)和反应空白对比溶液(4)在480nm处的紫外吸光度值的差值，通过所载药物的相应标准工作曲线(图2)所确定的线性回归方程，计算出细菌纳米磁小体的载药量为536iigADM/mgBMP。需要注意的是，无论是采用紫外光谱法还是荧光光谱法，每次进行药物与细菌纳米磁小体定量反应时均应同时配制阿霉素的反应空白对比溶液，以保证反应空白对比溶液的配制条件完全与反应液一致，减小实验误差。实施例2:采用荧光光谱法检测细菌纳米磁小体载单克隆抗体抗CEA含量。(1)配制抗CEA标准溶液加磷酸缓冲溶液，配制一系列已知准确浓度的抗CEA标准溶液。(2)建立抗CEA的标准工作曲线测定上述抗CEA标准溶液荧光发射光谱，获得其荧光发射光谱如图3所示。确定其最大发射波长入^为336nm。测定上述一系列已知准确浓度的抗CEA溶液在336nm处的荧光发射强度值，做出其标准工作曲线如图4所示。确定其回归方程为1=8.047*103*C。I为吸光度值，C为抗CEA标准液浓度，即溶液吸光度值与溶液中抗CEA的含量成正比。(3)将抗CEA与细菌纳米磁小体定量反应将戊二醛修饰过的细菌纳米磁小体与已知准确浓度的CEA抗溶液混合，使混合液中细菌纳米磁小体反应浓度为0.02mg/ml，抗CEA的浓度为0.14mg/ral，开启超声波振荡器，二者反应，反应结束后，用磁铁将磁小体吸至反应容器底部，收取上清液，待测。(4)配制抗CEA的反应空白对比溶液配制一份与步骤(3)的混合溶液同体积量的浓度为0.14mg/ml的抗CEA药物溶液，作为未与细菌纳米磁小体反应的抗CEA的空白对比溶液。(5)光谱测定分别测定步骤(3)所得反应上清液和步骤(4)所配制的反应空白对比溶液在336nm处的荧光发射强度值，测得二者在336处的荧光发射强度的差值为724。(6)载药量的计算根据待测反应上清液(3)和反应空白对比溶液(4)在336nm处的荧光发射强度值的差值，通过所载药物的相应标准工作油线)所确定的线性回归方程，计算出细菌纳米磁小体的连接抗CEA的量为4.5mg抗CEA/mgBMP。实施例3:精密度实验以荧光光谱法为例，按上述方法对同一批次的抗CEA溶液及戊二醛修饰细菌纳米磁小体用同样操作条件同时进行平行实验，根据各实验的荧光发射强度值，计算细菌纳米磁小体的连接抗CEA的量，结果如下表1所示。此结果表明本发明的检测方法能达到理想的精密度要求。表1精密度实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表1表明，同一批原料经六次平行测试，测得载药量误差在允许范围内。权利要求1.一种测定细菌纳米磁小体载药量的方法，其特征是包含下述步骤(1)将水或缓冲溶液加入待测药物中，配制出一系列不同浓度的药物标准溶液；(2)以纯水或相应缓冲溶液为参比，测定上述药物标准溶液紫外扫描光谱或荧光发射光谱(波长范围190-900nm)，确定最大紫外吸收波长或最大发射波长λmax；测定上述一系列已知准确浓度的药物溶液在该λmax处的紫外吸光度值或荧光发射强度值，制出其标准工作曲线；(3)将已知准确浓度的药物溶液与细菌纳米磁小体混合，使它们定量定体积反应，反应结束后，用磁铁在反应容器外将反应容器内的磁小体吸至容器底部，收取上清液，待测；再配制一份与上述混合溶液浓度相同的未与细菌纳米磁小体反应的药物溶液作为反应空白对比溶液，待用；(4)分别测定步骤3中待测反应上清液和反应空白对比溶液在λmax处的紫外吸光度值或荧光发射强度值；(5)根据待测反应上清液和反应空白对比溶液在λmax处的紫外吸光度值或荧光发射强度值的差值，通过所载药物的相应标准工作曲线，计算出细菌纳米磁小体的载药量。全文摘要本发明涉及一种测定细菌纳米磁小体载药量的方法，采用紫外光谱或荧光光谱确定待测药物的最大紫外吸收波长或最大发射波长λ<sub>max</sub>；测出不同浓度的药物溶液在该λ<sub>max</sub>处的紫外吸光度值或荧光发射强度值，制出其标准工作曲线；将已知浓度的药物与细菌纳米磁小体混合反应，分离出反应后的磁小体，得上清液；另配制与上述药物同浓度的未与细菌纳米磁小体反应等量药物溶液，作为空白反应对比溶液；分别测定上清液和空白反应对比溶液在λ<sub>max</sub>处的紫外吸光度值或荧光发射强度值，根据二者的差值由标准工作曲线计算出细菌纳米磁小体的载药量。文档编号G01N21/33GK101173893SQ20071019028公开日2008年5月7日申请日期2007年11月26日优先权日2007年11月26日发明者琳郭申请人:南京大学